陶 玲，尹海波，李 旭，邵 飛，賈曉晴

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600）

龍膽為我國(guó)常用中藥，2015版藥典規(guī)定其來(lái)源為龍膽科（Gentianaeeae）植物條葉龍膽（Gentiana manshuricaKitag.）、龍膽（Gentiana scabraBge.）、三花龍膽（Gentiana triflorapall.）或堅(jiān)龍膽（Gentiana rigescensFranch.）的干燥根及根莖。前3種習(xí)稱(chēng)“關(guān)龍膽”，后一種習(xí)稱(chēng)“堅(jiān)龍膽”，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效［1］。關(guān)龍膽被稱(chēng)為遼藥六寶之一，市場(chǎng)需求量大，近年來(lái)野生資源處于瀕危狀態(tài)，人工栽培龍膽成為市場(chǎng)的主要藥材來(lái)源。遼寧省撫順市清原縣擁有遼寧最大的龍膽栽培基地，栽培品種為龍膽（Gentiana scabraBge.），即粗糙龍膽。全縣龍膽草種植面積達(dá)2 466 hm2，年產(chǎn)量1 600 t，占全國(guó)市場(chǎng)份額的82%。但龍膽草種子細(xì)小，千粒重僅為24～32 mg［2］，加之近年來(lái)水資源供應(yīng)的短缺以及土壤鹽漬化等問(wèn)題的凸顯，直播發(fā)芽率較低。本實(shí)驗(yàn)人工模擬水分及鹽分2種環(huán)境脅迫，研究不同干旱程度、不同鹽分濃度下龍膽種子的發(fā)芽特性，為粗糙龍膽人工栽培和規(guī)范化種植提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用龍膽種子為2016年9月采于撫順市清原縣英額門(mén)鎮(zhèn)英額門(mén)村的3年生成熟種子。

1.2 方 法

1.2.1 水分脅迫對(duì)龍膽種子萌發(fā)的影響

將PEG6000用去離子水溶解，分別配制成5%、10%、15%、20%的溶液，p H＝7.0的去離子水處理組作為對(duì)照組。取成熟飽滿(mǎn)的種子適量，1%次氯酸鈉浸泡消毒15 min后，用去離子水沖洗掉表面殘留的次氯酸鈉溶液。將2層濾紙放置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿經(jīng)酒精消毒。每個(gè)培養(yǎng)皿放置100粒成熟飽滿(mǎn)的種子。用一次性針管吸取5 m L處理液于各處理組中，共5個(gè)處理組，每處理3次重復(fù)，放入25℃人工氣候箱中培養(yǎng)，光周期為11 h光照／13 h黑暗。用稱(chēng)重法補(bǔ)充每天損失的水分。

1.2.2 鹽分脅迫對(duì)龍膽種子萌發(fā)的影響

將分析純的 NaCl分別配制成45，90，135，180，225 mmol／L的溶液，p H＝7.0的去離子水處理組作為對(duì)照組。種子前期處理方法與1.2.1一致。用一次性針管吸取5 m L處理液于培養(yǎng)皿中，每皿100粒種子。共6個(gè)處理組，每處理3次重復(fù)，放入25℃人工氣候箱中培養(yǎng)，光周期為11 h光照／13 h黑暗。用稱(chēng)重法補(bǔ)充每天損失的水分。

1.2.3 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定

置床72 h后每天同一時(shí)間觀(guān)察種子萌發(fā)情況（本實(shí)驗(yàn)規(guī)定置床之日為1），當(dāng)種子露白（胚根突破種皮1 mm時(shí)）時(shí)視為萌發(fā)［3］。種子停止萌發(fā)時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)抽取3株幼苗測(cè)量其長(zhǎng)度。

發(fā)芽率（%）＝正常發(fā)芽的種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100%；

相對(duì)發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子數(shù)占對(duì)照萌發(fā)種子數(shù)的百分比；

發(fā)芽勢(shì)＝發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到高峰時(shí)正常發(fā)芽種子總數(shù)與供檢種子總數(shù)的百分比；

“雙十一”購(gòu)物狂歡節(jié)，是指每年11月11日的網(wǎng)絡(luò)促銷(xiāo)日，源于淘寶商城（天貓）2009年11月11日舉辦的網(wǎng)絡(luò)促銷(xiāo)活動(dòng)。下面我將列舉從2009年至2017年“雙十一”天貓和淘寶的總銷(xiāo)售額以及各年銷(xiāo)售額的增長(zhǎng)率，如表所示：

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt／Dt）（式中，Gt為不同時(shí)間（t，d）的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù)）

活力指數(shù)（VI）＝GI×S（式中，S為一定時(shí)期內(nèi)幼苗長(zhǎng)度cm，GI為發(fā)芽指數(shù)）；

平均發(fā)芽速度＝∑（D×n）／∑n（式中，D為從種子置床起算的天數(shù)，n為相應(yīng)各天的發(fā)芽粒數(shù)）；

種子耐鹽適宜范圍＝發(fā)芽率達(dá)到對(duì)照發(fā)芽率75%時(shí)相對(duì)應(yīng)的鹽液濃度；

種子耐鹽半致死濃度＝發(fā)芽率達(dá)到對(duì)照發(fā)芽率的50%的鹽液濃度；

種子耐鹽極限濃度＝發(fā)芽率達(dá)到對(duì)照發(fā)芽率的10%的鹽液濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016與SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響

由圖1可知，隨著NaCl濃度的遞增，種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢(shì)。對(duì)照組的發(fā)芽率最高，為68%，而濃度225 mmol／L處理組的龍膽種子未見(jiàn)萌發(fā)。NaCl濃度與種子發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），回歸方程為y＝－13.210x＋68.067，R2＝0.851 0。方差分析表明，45 mmol／L濃度組與對(duì)照組發(fā)芽率比較有顯著性差異（p＜0.05），其他濃度組與對(duì)照組比較有極顯著性差異（p＜0.01）。說(shuō)明即使低濃度的鹽分脅迫，也會(huì)抑制龍膽種子的萌發(fā)，這與鄭偉等［4］，徐芬芬等［5］得出的低濃度鹽脅迫促進(jìn)種子萌發(fā)的結(jié)論并不相符，龍膽種子極其不耐鹽。

圖1 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響

2.1.1 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

為進(jìn)一步研究龍膽種子的耐鹽程度，將相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)應(yīng)的鹽濃度之間進(jìn)行相關(guān)回歸分析（如圖2）。結(jié)果表明，NaCl脅迫下的相對(duì)發(fā)芽率隨鹽溶液濃度的升高而降低，相對(duì)發(fā)芽率與NaCl溶液濃度表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.851 0，回歸方程為：y＝－19.427x＋100.10。以相對(duì)發(fā)芽率的75%、50%、25%時(shí)所對(duì)應(yīng)的NaCl濃度作為龍膽種子發(fā)芽時(shí)鹽脅迫的適宜值、臨界值和極限值。得出NaCl脅迫時(shí)，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為13.15 mmol／L，臨界值為71.06 mmol／L，極限值為128.97 mmol／L。

2.1.2 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽速度的影響

由圖3可知，各濃度下龍膽種子發(fā)芽的動(dòng)態(tài)變化，總體呈現(xiàn)出慢快慢的趨勢(shì)，其中對(duì)照組趨勢(shì)最為明顯，第6天到第9天種子萌發(fā)速度快、數(shù)量多。45 mmol／L和90 mmol／L濃度組在發(fā)芽后期速度有小幅度的上升。135 mmol／L和180 mmol／L 2個(gè)濃度組趨勢(shì)較為相似，比較平緩，225 mmol／L濃度下，種子未見(jiàn)萌發(fā)。由圖3可以看出，不同濃度的NaCl不僅可以影響發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽速度等指標(biāo)，還會(huì)對(duì)種子的初始發(fā)芽時(shí)間造成影響。對(duì)照組從第5天開(kāi)始萌發(fā)，低濃度組（45～90 mmol／L）均從第7天開(kāi)始萌發(fā)，135～180 mmol／L組從第10天開(kāi)始萌發(fā)。種子初始發(fā)芽時(shí)間隨著NaCl濃度增大不斷延后。供試種子發(fā)芽所需的平均時(shí)間稱(chēng)為平均發(fā)芽速度，它是衡量種子發(fā)芽快慢的一個(gè)指標(biāo)，在同一種類(lèi)種子中，平均發(fā)芽速度的數(shù)值小，表示該批種子的發(fā)芽速度大，發(fā)芽能力越好［6］。在龍膽種子的整個(gè)萌發(fā)時(shí)間段內(nèi)計(jì)算種子的平均發(fā)芽速度（見(jiàn)表1），可知隨著NaCl濃度的遞增，種子的平均發(fā)芽速度不斷增大，種子的發(fā)芽能力隨之降低。

表1 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

圖2 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖3 NaCl對(duì)龍膽種子累計(jì)發(fā)芽率的影響

2.1.3 NaCl脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)等指標(biāo)的影響

計(jì)算龍膽種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長(zhǎng)度、種子活力指數(shù)等指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，龍膽種子在不同濃度NaCl溶液脅迫下，整體發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)、種子活力指數(shù)、幼苗長(zhǎng)度均隨著NaCl溶液濃度的增高呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（p＜0.05）。種子活力其余濃度組與對(duì)照組比均有顯著性差異（p＜0.05）。說(shuō)明低濃度的NaCl溶液（＜45 mmol／L）可降低龍膽種子的活力，進(jìn)一步表明龍膽種子在低濃度鹽脅迫下不存在促進(jìn)其發(fā)芽的情況。高濃度NaCl溶液明顯減弱種子活力，強(qiáng)烈抑制其萌發(fā)。

2.2 水分脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響

能夠充分反映種子萌發(fā)情況的指標(biāo)是發(fā)芽率，由圖4可知，除了PEG濃度為5%的處理組比對(duì)照組發(fā)芽率稍有增高外，其余3組發(fā)芽率均隨著PEG濃度的增高而呈下降趨勢(shì)。對(duì)各組發(fā)芽率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5%，10%濃度組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，15%濃度組，20%濃度組與對(duì)照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。其中5%濃度組的發(fā)芽率比對(duì)照組還略有提高。說(shuō)明適度的干旱刺激可以提高龍膽種子的發(fā)芽率。

2.2.1 水分脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽速度的影響

由圖5可知，龍膽種子在整個(gè)萌發(fā)期間內(nèi)，整體呈現(xiàn)出慢快慢的生長(zhǎng)趨勢(shì)。對(duì)照組、5%濃度組、10%濃度組皆從第5天開(kāi)始萌發(fā)，15%濃度組第8天開(kāi)始萌發(fā)，20%濃度組始終未見(jiàn)萌發(fā)。種子萌發(fā)多集中在6～12 d。15 d后處于萌發(fā)的停滯期。第7天后，5%濃度組每天的累計(jì)發(fā)芽率皆大于對(duì)照組。計(jì)算龍膽種子的平均發(fā)芽速度（平均發(fā)芽速度值越小，發(fā)芽能力越強(qiáng)）見(jiàn)表2，隨著PEG濃度的增加，種子的平均速度隨之遞增，但5%濃度組與對(duì)照組比無(wú)顯著性差異，由此可見(jiàn)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PGE可以促進(jìn)種子萌發(fā)，增大種子萌發(fā)速度，降低其平均萌發(fā)速度，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG延緩種子發(fā)芽時(shí)間，減慢種子發(fā)芽速度，抑制種子萌發(fā)。

表2 水分脅迫對(duì)龍膽種子萌發(fā)的影響

圖4 水分脅迫對(duì)龍膽種子發(fā)芽率的影響

圖5 PEG對(duì)龍膽種子累計(jì)發(fā)芽率的影響

由表2可知，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～5%范圍內(nèi)，龍膽種子的發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢(shì)呈升高的趨勢(shì)，而后隨著PEG濃度的加大，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)逐步降低。對(duì)照組和5%濃度組的種子日發(fā)芽數(shù)在第8天達(dá)到最高，故2組種子的發(fā)芽勢(shì)定在第8天測(cè)定，分別為34.67%和36.67%。10%濃度組種子的發(fā)芽勢(shì)定在第10天，為28%。15%濃度組發(fā)芽勢(shì)延遲到第12天，為24.67%。由此可見(jiàn)，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)芽勢(shì)天數(shù)的延后，減弱種子的萌發(fā)能力。其中5%濃度組和10%濃度組種子的發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，15%濃度組與對(duì)照組比較有顯著性差異（p＜0.05），20%濃度組與對(duì)照組比較有極顯著性差異（p＜0.01）。說(shuō)明此時(shí)PEG濃度超過(guò)了龍膽種子萌發(fā)過(guò)程的滲透調(diào)節(jié)承受限度，對(duì)種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)均造成傷害。

2.2.2 水分脅迫對(duì)龍膽種子活力指數(shù)、幼苗長(zhǎng)度及根莖比的影響

植物的正常生長(zhǎng)需要合理的根莖比，如果根莖比過(guò)小，地上部分的水分和養(yǎng)分便難以輸送到植物上部，植株也不會(huì)正常生長(zhǎng)［6］。由表2可知，本次實(shí)驗(yàn)的根莖比、幼苗長(zhǎng)度、種子活力指數(shù)均隨著PEG濃度的增大而隨之降低。根莖比5%濃度組與對(duì)照組數(shù)值相同，10%濃度組與對(duì)照組比差異不顯著（p＞0.05），并有增大趨勢(shì)。15%濃度組和20%濃度組與對(duì)照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。種子活力指數(shù)只有5%濃度組與對(duì)照組比無(wú)顯著性差異，其余3組均與對(duì)照組有顯著性差異（p＜0.05）。說(shuō)明低濃度的PEG可以一定程度的促進(jìn)種子萌發(fā)，對(duì)種子活力也不會(huì)過(guò)分抑制，進(jìn)一步證明了龍膽種子具有一定的耐旱性。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)分別采用培養(yǎng)皿中添加不同濃度NaCl處理液和利用PEG6000人工模擬干旱條件2種方法，比較鹽分和水分2種環(huán)境脅迫對(duì)龍膽種子萌發(fā)的影響。試驗(yàn)相關(guān)分析表明，龍膽種子的發(fā)芽率與NaCl濃度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長(zhǎng)度、活力指數(shù)均隨著NaCl的增大呈顯著下降的趨勢(shì)，225 mmol／L濃度組始終未見(jiàn)萌發(fā)。通過(guò)回歸分析得出，NaCl脅迫時(shí)，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為13.15 mmol／L，臨界值為71.06 mmol／L，極限值為128.97 mmol／L。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的鹽脅迫可以促進(jìn)種子萌發(fā)［7］，而本次試驗(yàn)中即使低濃度（45 mmol／L）的NaCl脅迫仍可以顯著抑制龍膽種子的萌發(fā)，發(fā)芽率與對(duì)照組比有顯著性差異（p＜0.05）。說(shuō)明龍膽種子不耐鹽，應(yīng)盡量避免將龍膽種子播種在鹽漬化的土壤中。

當(dāng)PEG濃度為5%時(shí)，龍膽種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均較對(duì)照組有小幅度的上升，根莖比與對(duì)照組比有下降趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異。說(shuō)明適當(dāng)濃度的PEG可以促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率。10%濃度組的發(fā)芽率、根莖比、幼苗長(zhǎng)度與對(duì)照組比無(wú)顯著性差異，15%～20%濃度組發(fā)芽率，根莖比與對(duì)照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。種子活力指數(shù)除了5%濃度組與對(duì)照組比無(wú)顯著性差異外，其余3組都有顯著性差異（p＜0.05），當(dāng)PEG濃度達(dá)到20%時(shí)，種子未見(jiàn)萌發(fā)?？梢?jiàn)龍膽種子在萌發(fā)期間可承受的PEG濃度在10%以?xún)?nèi)，濃度達(dá)到15%時(shí)無(wú)論是對(duì)種子萌發(fā)還是幼苗生長(zhǎng)均會(huì)造成顯著抑制，龍膽種子不能萌發(fā)的PEG濃度的臨界值為20%。龍膽種子的根莖比在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)有小幅度上升，有可能是龍膽種子對(duì)干旱脅迫環(huán)境的適應(yīng)性，有利于種子在逆境脅迫下更好的吸收水分［6］。

龍膽草屬于藥用植物，其藥效成分主要是次生代謝產(chǎn)物。環(huán)境脅迫能夠顯著影響藥用植物的次生代謝等指標(biāo)，雖抑制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，但也會(huì)促進(jìn)其次生代謝產(chǎn)物的分泌。有研究分析了蒼術(shù)根際區(qū)土壤養(yǎng)分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)道地藥材茅山蒼術(shù)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到了較嚴(yán)重的養(yǎng)分缺乏脅迫，主要表現(xiàn)為缺鉀脅迫［8］。與水分充足時(shí)相比，萬(wàn)壽菊在受到水分脅迫時(shí)，自身所含酚類(lèi)物質(zhì)含量明顯增高［9］。何丙輝等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫促進(jìn)了銀杏中槲皮素含量的提高，抑制了蘆丁含量的增加［10］。本研究得出結(jié)論，粗糙龍膽種子極其不耐鹽但可以抵御一定程度的干旱脅迫，干旱脅迫環(huán)境對(duì)龍膽中主要藥效成分環(huán)烯醚萜苷類(lèi)的累計(jì)是否有促進(jìn)作用，還需要進(jìn)行下一步的試驗(yàn)證明。

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