王思予，趙樹(shù)蘭，多立安

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，環(huán)境問(wèn)題日益突出，重金屬污染土壤的問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮。目前，世界各國(guó)土壤均存在不同程度的污染，全世界平均每年排放Hg、Cu、Pb、Mn、Ni的量，分別約為1.5×104、3.4×106、5×106、1.5×107和1.5×106t。我國(guó)受Cd、Hg、As、Cr、Pb污染的耕地面積約2×107hm2，每年因重金屬污染而損失的糧食約100萬(wàn)t［1］，因此人們?cè)絹?lái)越重視重金屬污染土壤的修復(fù)。植物修復(fù)技術(shù)屬于原位修復(fù)技術(shù)，其成本低、環(huán)保無(wú)污染，植被形成后具有保護(hù)表土、減少侵蝕和水土流失的功效，可大面積應(yīng)用于礦山的復(fù)墾、重金屬污染場(chǎng)地的植被與景觀修復(fù)［2］。

為增加重金屬在土壤中的溶解性，絡(luò)合劑常被用來(lái)活化土壤中的重金屬，促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收及向地上部轉(zhuǎn)移，達(dá)到提高植物提取效率的目的［34］。EDTA（乙二胺四乙酸）是一種常用絡(luò)合劑，去除重金屬的效果好，且濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng)、次數(shù)越多，去除效果越好［5］。但EDTA難降解，在環(huán)境中存留時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)再次污染深層土壤，甚至污染地下水［6］。目前，土壤重金屬修復(fù)研究都在尋找可生物降解的螯合劑［7］。

GLDA，谷氨酸二乙酸四鈉，主要由植物原料制備而成，容易生物降解，與金屬離子的螯合能力不低于EDTA、EDDS的螯合能力。有研究表明，GLDA可以去除污泥中的重金屬［8］，并且可以有效促進(jìn)東南景天提取污染土壤中的重金屬［9］。IDS，亞氨基二琥珀酸四鈉鹽，是一種新型的氨基羧酸類螯合劑，具有很強(qiáng)的螯合過(guò)渡金屬離子和堿金屬離子的能力，尤其對(duì)鐵、銅離子的螯合能力極佳。此外，IDS具有生物可降解性。有研究表明，IDS可以作為一種潛在的有效螯合劑來(lái)去除電池工業(yè)污泥中的重金屬［10］。

草坪草大部分是禾本科草本植物，主要特點(diǎn)是耐性強(qiáng)，抗病性好，耐粗放管理，易于成活，一年可刈割多次，產(chǎn)生很大的生物量，同時(shí)還是城市綠化建設(shè)的主要組成部分，因此可選擇草坪植物作為重金屬污染土壤的修復(fù)材料。利用GLDA和IDS去除重金屬的研究有少量報(bào)道，但2種絡(luò)合劑對(duì)草坪植物萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究將不同濃度的GLDA和IDS加入草坪基質(zhì)中，研究可生物降解絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，為可降解絡(luò)合劑應(yīng)用于重金屬污染土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)植物選取我國(guó)北方常見(jiàn)的多年生黑麥草（Lolium perenneL.）。土壤取自校園內(nèi)0～20 cm的表層土壤，自然風(fēng)干、碾碎，過(guò)篩，備用。土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土，p H＝7.44，有機(jī)質(zhì)含量4.68%，全氮0.21%，全鉀45.61%，有效磷22.03 mg／kg，飽和含水量56%，容重0.87 g／cm3。GLDA 購(gòu)于阿克蘇諾貝爾（Akzo Nobel）化工有限公司，p H＝10～11，有效含量為47.4%，IDS購(gòu)于中國(guó)河北省石家莊開(kāi)發(fā)區(qū)德賽化工有限公司，密度1.32～1.35 g／cm3，p H＝10.3～11.4，有效含量為75%。

1.2 黑麥草的培養(yǎng)

選取直徑為6.8 cm、高為7.8 cm的塑料盆，裝入150 g土壤。選擇籽粒飽滿的黑麥草種子，預(yù)先在黑暗條件下清水浸泡24 h，每盆播種100粒。播種后添加2種絡(luò)合劑，設(shè)置5個(gè)處理濃度：3，6，9，12 mmol／kg和15 mmol／kg，分別以GLDA 3、GLDA 6、GLDA 9、GLDA 12、GLDA 15和IDS3、IDS6、IDS9、IDS12、IDS15表示，以不添加絡(luò)合劑的處理（0 mmol／kg）為對(duì)照；每個(gè)處理3次重復(fù)。黑麥草培養(yǎng)期間室內(nèi)溫度為18～25℃，相對(duì)濕度為35%～65%，光照為透入室內(nèi)的自然光（6 856～2 7090 lx）。每天補(bǔ)充水分，保證土壤含水量為最大持水量的70%，供植物正常生長(zhǎng)所需。

1.3 方 法

1.3.1 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

種子胚根長(zhǎng)出并超過(guò)種子長(zhǎng)度的1／2視為萌發(fā)，當(dāng)萌發(fā)第7天時(shí)，萌發(fā)達(dá)到穩(wěn)定，測(cè)定發(fā)芽率，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)、萌發(fā)速率系數(shù)和萌發(fā)值［1113］。

發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)（%）＝萌發(fā)4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt／Dt）（式中，GI為發(fā)芽指數(shù)，Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）；

萌發(fā)速率系數(shù)（%）＝［∑（t×n）／∑n］×100%（式中，t為自萌發(fā)試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的天數(shù)，n為在t天內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù)）；

萌發(fā)值（GV）＝MDG×PV（式中，MDG為平均每天萌發(fā)的幼苗數(shù)，PV為日累積萌發(fā)幼苗數(shù)除以試驗(yàn)時(shí)間所得最大值）。

1.3.2 植物生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽后每5天測(cè)定1次株高，隨機(jī)選取每盆中5株長(zhǎng)勢(shì)勻稱的植株，取其平均株高。黑麥草播種30 d后刈割，地上部分108℃下殺青20 min，80℃烘干至恒重。地下部分，用清水洗凈，用濾紙吸去根外部的水分，80℃烘干至恒重。

1.3.3 葉綠素和類胡蘿卜素的測(cè)定

取0.2 g鮮葉片，剪成1～2 mm碎片，浸泡于20 m L丙酮乙醇（V∶V＝1∶1）溶液中，避光浸泡24 h至葉片完全脫色，浸泡液為待測(cè)液。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)663、645 nm和470 nm下測(cè)量吸光值，并根據(jù)公式計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

葉綠素a的濃度Ca（mg／L）＝12.72A663－2.59A645；

葉綠素b的濃度Cb（mg／L ）＝ 22.88A645－4.67A663；

總的葉綠素濃度C T（mg／L）＝C a＋Cb＝20.29A645＋8.05A663；

葉綠素含量（mg／g）＝總?cè)~綠素濃度×提取體積／植物鮮重；

類胡蘿卜素的總濃度C xc（mg／L）＝（1 000A470－2.05Ca－114.8Cb）／245；

類胡蘿卜素含量（mg／g）＝類胡蘿卜素濃度×提取體積／植物鮮重。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），并采用Tukey法，在p＝0.05水平進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)；采用Microsoft Excel 2007繪制圖表，文中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n＝3）。

不同濃度的GLDA和IDS對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的綜合影響采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式：R（X j）＝（X j－Xmin）／（Xmax－Xmin）［14］。

式中X j為第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin、Xmax分別為第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值和最大值。然后用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加來(lái)計(jì)算綜合評(píng)定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)的影響

播種后第3天，黑麥草種子開(kāi)始萌發(fā)，第10天達(dá)到萌發(fā)穩(wěn)定。施加絡(luò)合劑GLDA和IDS對(duì)黑麥草的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、萌發(fā)速率系數(shù)以及萌發(fā)值的影響均隨著濃度的增加呈明顯的抑制趨勢(shì)，且高濃度絡(luò)合劑的影響達(dá)到顯著水平（p＜0.05，表1）。

發(fā)芽率隨著絡(luò)合劑濃度的增加而降低，對(duì)照組的發(fā)芽率最高為79.33%；15 mmol／kg GLDA處理與對(duì)照差異顯著（p＜0.05），僅為對(duì)照的12.61%。發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)出和發(fā)芽率相同的趨勢(shì)，隨著絡(luò)合劑濃度的增加，也受到明顯抑制，添加GLDA的處理均與對(duì)照差異顯著（p＜0.05），其中GLDA濃度為15 mmol／kg的處理與對(duì)照差異最顯著，僅為對(duì)照的1.48%。發(fā)芽指數(shù)和萌發(fā)速率系數(shù)最高的均為對(duì)照組，只有3 mmol／kg IDS處理，和對(duì)照差異不顯著（p＞0.05）。萌發(fā)值也表現(xiàn)出和其它發(fā)芽指標(biāo)相同的趨勢(shì)，隨著絡(luò)合劑濃度的增加，受到明顯的抑制。

2.2 不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草株高的影響

黑麥草幼苗株高動(dòng)態(tài)如圖1所示。生長(zhǎng)初期，播種10 d時(shí)，添加GLDA的處理組均與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05），當(dāng)絡(luò)合劑濃度為15 mmol／kg時(shí)，植株幾乎未生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)中期，從15～25 d，對(duì)照株高平均生長(zhǎng)率為0.12 cm／d。添加IDS濃度為3，6，9 mmol／kg處理，植株生長(zhǎng)迅速，平均生長(zhǎng)率高于對(duì)照組。添加GLDA濃度為15 mmol／kg處理生長(zhǎng)最緩慢，到25 d株高僅為3.23 cm，與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）。生長(zhǎng)30 d后，對(duì)照株高為10.53 cm；3 mmol／kg IDS處理生長(zhǎng)最快，株高為11.47 cm，而添加GLDA和IDS濃度為15 mmol／kg的處理組幾乎未生長(zhǎng)，且與對(duì)照差異顯著（p＜0.05），分別為 對(duì) 照 的 34.47% 和68.09%。

表1 不同濃度絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

圖1 絡(luò)合劑GLDA（A）和IDS（B）對(duì)黑麥草株高動(dòng)態(tài)的影響

圖2 添加絡(luò)合劑GLDA和IDS對(duì)黑麥草地上和地下干重的影響

2.3 不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草生物量的影響

添加不同濃度的絡(luò)合劑對(duì)黑麥草地上和地下干重的影響見(jiàn)圖2。當(dāng)絡(luò)合劑濃度為6 mmol／kg時(shí)，地上干重均為最大；當(dāng)絡(luò)合劑濃度為15 mmol／kg時(shí)，地上干重均為最小，且均與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）。絡(luò)合劑顯著抑制了黑麥草地下根系的生長(zhǎng)，地下干重均以對(duì)照組為最高；GLDA濃度為3 mmol／kg的處理地下干重與對(duì)照差異不顯著（p＞ 0.05）。GLDA 和IDS 濃 度 為 15 mmol／kg的處理地下干重最小，與對(duì)照差異顯著（p＜0.05），僅為對(duì)照的3.70%。

2.4 不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響如表2所示。2種絡(luò)合劑濃度為3，6，9 mmol／kg處理葉綠素a與對(duì)照相比，含量較高，且與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）；GLDA 和IDS濃度為9 mmol／kg的處理葉綠素b和總?cè)~綠素含量最高，與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）；當(dāng) GLDA 和IDS濃度為6 mmol／kg時(shí)，類胡蘿卜素含量最高，較對(duì)照分別增加了58.11%和48.65%（p＜0.05）。

表2 不同濃度絡(luò)合劑GLDA和IDS對(duì)黑麥草葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

表3 添加絡(luò)合劑對(duì)黑麥草各指標(biāo)影響的隸屬函數(shù)分析

2.5 不同絡(luò)合劑對(duì)黑麥草萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的綜合評(píng)定

采用隸屬函數(shù)法分別就添加不同濃度絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的綜合影響進(jìn)行評(píng)定（表3）。結(jié)果表明，添加絡(luò)合劑IDS濃度為6 mmol／kg的處理組生長(zhǎng)狀況最佳，影響最大的是15 mmol／kg處理組，且與對(duì)照差異顯著（p＜0.05），添加高濃度絡(luò)合劑不利于黑麥草生長(zhǎng)。2種絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的綜合評(píng)定排名順序?yàn)椋篒DS 6、IDS 3、GLDA 6、GLDA 3、CK、IDS 9、GLDA 9、IDS 12、IDS 15、GLDA 12、GLDA 15處理。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，絡(luò)合劑在植物修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用研究越來(lái)越多。EDTA雖然增加植物對(duì)重金屬的吸收和富集，但往往會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，減少生物量。廉菲等研究表明，絡(luò)合劑EDTA會(huì)強(qiáng)烈抑制黑麥草的發(fā)芽率、株高和生物量等［15］。Sinegani等的研究發(fā)現(xiàn)，EDTA對(duì)植物生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，表現(xiàn)在顯著減少出苗和干重［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，可降解絡(luò)合劑GLDA和IDS對(duì)黑麥草種子萌發(fā)表現(xiàn)出一定的抑制作用，這與賈麗娜等［11］的研究結(jié)果相同，且進(jìn)一步影響其幼苗生長(zhǎng)，低濃度絡(luò)合劑處理的15 d內(nèi)并未顯示明顯的優(yōu)勢(shì)，但15 d后，生長(zhǎng)狀況超過(guò)對(duì)照。添加低濃度的2種絡(luò)合劑時(shí)，黑麥草地上生物量較對(duì)照相比顯著增加，株高在20 d后，生長(zhǎng)迅速。當(dāng)絡(luò)合劑濃度增大，超過(guò)適宜濃度，則對(duì)植物根系生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，這與羅艷等［17］的研究結(jié)果相一致。葉綠素是與光合作用相關(guān)的最重要的一類色素，而類胡蘿卜素也是與光合作用相關(guān)的一類色素，還是活細(xì)胞中生物合成的產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，2種絡(luò)合劑對(duì)葉綠素和類胡蘿卜素的影響為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制，這和張燦燦等［19］研究EDTA對(duì)高羊茅葉綠素含量的影響結(jié)果相一致。通過(guò)多指標(biāo)的測(cè)定，采用隸屬函數(shù)分析對(duì)黑麥草的萌發(fā)和生長(zhǎng)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，避免了單一指標(biāo)的片面性，較為全面地反映2種絡(luò)合劑GLDA和IDS對(duì)草坪植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，使結(jié)果更具科學(xué)性。綜合評(píng)定值越大，表明添加該濃度絡(luò)合劑對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用越明顯［14］。各項(xiàng)萌發(fā)指數(shù)是表現(xiàn)植物萌發(fā)狀態(tài)的重要指標(biāo)，株高和生物量是衡量植物生長(zhǎng)的重要指標(biāo)，葉綠素和類胡蘿卜素與植物的光合作用相關(guān)，因此在綜合分析濃度的情況下，要參考以上各項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，低濃度絡(luò)合劑對(duì)黑麥草種子萌發(fā)和生物量有抑制作用，但可以提高株高和葉綠素、類胡蘿卜素含量。而高濃度絡(luò)合劑對(duì)黑麥草萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的抑制作用，表現(xiàn)出明顯的傷害。通過(guò)隸屬函數(shù)分析對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，添加2種絡(luò)合劑濃度不大于6 mmol／kg時(shí)均好于對(duì)照，以IDS濃度為6 mmol／kg的處理生長(zhǎng)狀況最佳。

［1］Wu G，Kang H B，Zhang X Y，et al.A critical review on the bioremoval of hazardous heavy metals from contaminated soils：issues，progress，ecoenvironmental concerns and opportunities［J］.Journal of Hazardous Materials，2010，174（13）：18.

［2］李韻詩(shī)，馮沖凌，吳曉芙，等.重金屬污染土壤植物修復(fù)中的微生物功能研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（20）：6 8816 890.

［3］Huang J W，Chen J J，William R B，et al.Phytoremediation of leadcontaminated soils：role of synthetic chelates in lead phytoextraction［J］.Environmental Science and Technology，1997，31（3）：800805.

［4］Wu L H，Luo Y M，Xing X R，et al.EDTA enhanced phytoremediation of heavy metal contaminated soil with Indian mustard and associated potential leaching risk［J］.Agriculture，Ecosystems and Environment，2004，102（3）：307318.

［5］楊冰凡，胡鵬杰，李柱，等.重金屬高污染農(nóng)田土壤EDTA淋洗條件初探［J］.土壤，2013，45（5）：928932.

［6］郭曉方，衛(wèi)澤斌，吳啟堂.乙二胺四乙酸在重金屬污染土壤修復(fù)過(guò)程的降解及殘留［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2015，31（7）：272278.

［7］Pinto ISS，Neto I F F，Soares H M V M.Biodegradable chelating agents for industrial，domestic，and agricultural applicationsa review［J］.Environmental Science and Pollution Research，2014，21（20）：11 89311 906.

［8］Wu Q，Cui Y，Li Q，et al.Effective removal of heavy metals from industrial sludge with the aid of a biodegradable chelating ligand GLDA［J］.Journal of Hazardous Materials，2015，283：748754.

［9］衛(wèi)澤斌，陳曉紅，吳啟堂，等.可生物降解螯合劑GLDA誘導(dǎo)東南景天修復(fù)重金屬污染土壤的研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2015，36（5）：1 8641 869.

［10］Wu Q，Duan G，Cui Y，et al.Removal of heavy metal species from industrial sludge with the aid of biodegradable iminodisuccinic acid as the chelating ligand［J］.Environmental Science and Pollution Research，2014，22（2）：1 1441 150.

［11］賈麗娜，趙樹(shù)蘭，多立安.NTA對(duì)草坪植物種子萌發(fā)與初期生長(zhǎng)的影響［J］.種子，2012，31（6）：9194.

［12］閆興富，周立彪，思彬彬，等.不同溫度下PEG6000模擬干旱對(duì)檸條錦雞兒種子萌發(fā)的脅迫效應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36（7）：1 9891 996.

［13］杜國(guó)禎，馬錦榮.十五種野生草本植物種子在不同溫度下萌發(fā)能力的研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，1994，3（1）：1824.

［14］常青山，張利霞，張巧明，等.殼聚糖浸種對(duì)干旱脅迫下苜蓿種子發(fā)芽的緩解作用［J］.種子，2015，34（3）：3943.

［15］廉菲，趙樹(shù)蘭，滕萌，等.EDTA對(duì)一年生黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（12）：6264.

［16］Sinegani A A S，Khalilikhah F.The effect of application time of mobilising agents on growth and phytoextraction of lead by Brassica napus from a calcareous mine soil［J］.Environmental Chemistry Letters，2011，9（2）：259265.

［17］羅艷，張世熔，徐小遜，等.可降解螯合劑對(duì)鎘脅迫下籽粒莧根系形態(tài)及生理生化特征的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，34（20）：5 7745 781.

［18］白志英，李存東，孫紅春，等.干旱脅迫對(duì)小麥葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響及染色體調(diào)控［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（1）：16.

［19］張燦燦，多立安，趙樹(shù)蘭.EDTA對(duì)高羊茅生長(zhǎng)及其土壤中酶活性的影響［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2013，35（3）：116120.