吳沿勝，吳沿友，2，邢德科，劉宇婧，于 睿，黎明鴻，姚香平

（1.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國家重點實驗室環(huán)境生物科技研究中心，貴州 貴陽550081）

寧前胡，學(xué)名白花前胡（Peucedanum praeruptorum Dunn），為多年生傘形科（Umbelliferae）前胡屬（Peucedanum）野生草本植物［1］，以干燥根入藥，具有降氣化痰、散風清熱之功效［2］。前胡始載于《名醫(yī)別錄》，至今有1 500多年的悠久用藥歷史。安徽寧國盛產(chǎn)道地藥材白花前胡，該地所產(chǎn)前胡以個大皮黑、條長肉黃、質(zhì)地柔軟、氣味濃郁等特點在中藥界享有“寧前胡”之美譽［3］。由于連年采挖，野生資源逐漸枯竭，20世紀90年代末，由寧國醫(yī)藥局牽頭開展了野生寧前胡改家種試驗并取得成功［4］。目前人工栽培寧前胡多采用種子繁殖和分根繁殖［4］，分根繁殖系數(shù)低，用種量大，長期分根無性繁殖易導(dǎo)致分叉現(xiàn)象嚴重［5］，伴有變異發(fā)生［6］，種性退化［7］，品質(zhì)下降。而種子繁殖萌發(fā)率低［8］，出苗不整齊。另外，寧前胡栽培品種次年易出現(xiàn)抽薹現(xiàn)象，這些問題嚴重制約了寧前胡的可持續(xù)發(fā)展。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以避免種性退化和遺傳變異，高繁殖率也為寧前胡工廠化育苗提供可能。目前有關(guān)前胡組織培養(yǎng)的報道并不多見，李忠誼等［9］采用前胡幼苗切段通過愈傷組織誘導(dǎo)分化出胚狀體并再生成完整植株，其細胞懸浮培養(yǎng)物同樣能分化出胚狀體發(fā)育成完整植株。王濟玫等［10］研究了前胡原生質(zhì)體培養(yǎng)并成功再生出完整植株，發(fā)現(xiàn)蝸牛酶對原生質(zhì)體的游離起顯著作用。彭菲等［11］采用正交設(shè)計法以紫花前胡葉柄為外植體成功誘導(dǎo)出愈傷組織，并在愈傷組織中檢測出香豆素成分。本實驗以野生寧前胡根、莖、葉3種外植體和新型植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ對愈傷組織誘導(dǎo)和生長進行研究，旨在為寧前胡高效快速繁殖提供有效途徑，對寧前胡野生資源保護和發(fā)展提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植 物

于安徽省寧國市萬家鄉(xiāng)西泉村向北約3.1 km（119°9′E，30°21′N）挖取當年4月份優(yōu)質(zhì)野生寧前胡實生苗并移栽至江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院溫室大棚，用于組織培養(yǎng)所需的根、莖、葉等外植體均取自同一健壯植株。

1.1.2 試 劑

2，4D、6BA、KT、NAA、TDZ均為美國Sigma公司產(chǎn)品，購自北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、瓊脂、無水乙醇、Tween20等常規(guī)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；0.1%HgCl2和MS培養(yǎng)基為本實驗室自配。

1.2 方 法

1.2.1 外植體消毒

以長勢良好的寧前胡植株的根、莖、葉為材料，分別用75%酒精滅菌30 s，無菌水沖洗3～5次，再用0.1%HgCl2分別消毒15，12 min和10 min（根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果），無菌濾紙吸干水分，用無菌手術(shù)刀將葉片切成0.25 cm2的方塊，莖段切成長度約為1.0 cm的小段；根切成0.5 cm3的方塊。

1.2.2 培養(yǎng)條件

若無特殊聲明，溫度控制為（25±3）℃、空氣相對濕度保持40%～60%、光照時長12 h／d、光照強度1 500～2 000 lx、MS培養(yǎng)基、瓊脂8.0 g／L、蔗糖30 g／L，p H＝5.8～6.0。

1.2.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行錄入和整理，采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析，其中包括方差分析和Duncan法進行多重比較。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）＝形成愈傷的外植體塊數(shù)／接種后未污染的植體塊數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

寧前胡同一植株不同部位外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織能力差異性很大。由表1可看出，寧前胡3種不同外植體在18種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均可成功誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以葉片誘導(dǎo)率最高，在13號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率高達95.56%，與其他愈傷誘導(dǎo)結(jié)果相比具有顯著性差異；莖段在4號培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率最高為80.00%；根在4號和16號培養(yǎng)基上具有相同的愈傷誘導(dǎo)率，最高為78.89%。

表1 不同激素組合對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

另外，寧前胡的不同外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后，愈傷組織的生長情況也有很大差異。將寧前胡離體葉片接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)1周后葉片開始卷曲膨大，在切口四周產(chǎn)生黃綠色或奶白色的愈傷組織（圖1 a），而未卷曲膨大的葉片則變黃變褐，直至枯死（圖1 b）。寧前胡莖段在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)10 d左右，莖段切口兩端開始膨大，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d切口兩端膨大處長出少量黃綠色顆粒狀愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后可在大多數(shù)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上觀察到明顯的質(zhì)地緊密的黃綠色愈傷組織，由莖段產(chǎn)生的愈傷組織呈典型的啞鈴狀（圖1 c）。與葉片和莖段相比，寧前胡根愈傷組織形成緩慢，接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2周后逐漸產(chǎn)生質(zhì)地緊密的黃綠色顆粒狀愈傷組織或者少量褐色的愈傷組織且愈傷組織生長緩慢（圖1 d，e）。

2.2 不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織性狀特征

3種不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織在形態(tài)特征方面也表現(xiàn)出不同的差異：葉片愈傷組織多為顆粒狀聚集起來的淺白色的疏松易碎或者黃綠色、質(zhì)地緊密型愈傷組織塊（圖1 f，g）；莖段愈傷組織在莖段兩端膨大，形似啞鈴，多是質(zhì)地緊密的黃綠色愈傷組織塊；由根形成的愈傷組織呈淺黃綠色或者是褐色，質(zhì)地緊密，愈傷組織塊上凹凸分明。因此，在寧前胡組織培養(yǎng)中，葉片是最佳的愈傷組織誘導(dǎo)外植體，其次分別是莖段和根。

表2 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的比較

2.3 光照對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取寧前胡健康植株的離體葉片，接種于葉片愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基（13號培養(yǎng)基）上，進行不同光照條件培養(yǎng)（見表3和表4）。從表3可以看出，黑暗條件有利于寧前胡葉片愈傷組織的形成。而光照500 lx的條件下，葉片愈傷誘導(dǎo)率效果與黑暗條件相比有顯著性差異，愈傷誘導(dǎo)率為78.89%，通過觀察發(fā)現(xiàn)，隨著光照強度的增加，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢，光照為2 500 lx時，愈傷誘導(dǎo)率降低到16.67%，且形成的愈傷組織發(fā)生褐化，呈紫褐色（圖1 h），愈傷組織較小，隨后逐漸死亡。實驗表明，避光條件有利于提高寧前胡葉片愈傷組織誘導(dǎo)率。

由表4可知，寧前胡葉片愈傷組織的形成因為黑暗條件快速啟動，但是愈傷誘導(dǎo)率隨著黑暗培養(yǎng)時間的延長而降低。黑暗條件下分別誘導(dǎo)14，21，28 d，誘導(dǎo)率之間存在顯著性差異，與此同時愈傷組織顏色和生長狀態(tài)隨著黑暗處理時間的延長狀況變差。本研究表明，短時間的暗培養(yǎng)對寧前胡離體葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和愈傷組織生長狀況不會產(chǎn)生很大影響，而較長時間的暗培養(yǎng)不僅嚴重抑制寧前胡離體葉片生長，而且對愈傷組織誘導(dǎo)和生長狀況產(chǎn)生不良影響。

綜合表3和表4的實驗結(jié)果，寧前胡葉片愈傷組織誘導(dǎo)初始階段需要在無光或者弱光條件下進行暗培養(yǎng)1周左右，暗培養(yǎng)時間過短或者過長都不利于愈傷組織形成和生長；暗培養(yǎng)1周后逐漸增加光照強度有利于愈傷組織形成，保持愈傷組織健康生長，這樣利于后期愈傷組織分化出不定芽。

表3 光照條件對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表4 黑暗處理對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 葉片放置方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取寧前胡健康植株的離體葉片，接種在13號培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)。由表5可知，寧前胡離體葉片的不同放置方式直接影響到愈傷組織首次!愈時間和愈傷誘導(dǎo)能力強弱，以遠軸面向下的接種方式更加適合于寧前胡葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。出現(xiàn)這種結(jié)果很可能與寧前胡葉片自身結(jié)構(gòu)有一定聯(lián)系。

表5 葉片放置方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和發(fā)育受到諸多因素的影響，如外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基種類、光照條件、溫濕度等。愈傷組織通過分化呈組織器官、體細胞胚途徑可再生為完整植株，是瀕危植物種質(zhì)資源保存、遺傳操作獲得轉(zhuǎn)基因植物、無病毒試管苗生產(chǎn)、工廠化育苗的前提條件。通常，白色、球型的愈傷組織用于體細胞胚的發(fā)生；綠色、瘤狀愈傷組織多用于器官的發(fā)生［12］。本實驗結(jié)果表明，寧前胡的3種外植體均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，尤以寧前胡葉片的誘導(dǎo)效果最好，其次分別是莖段和根。

圖1 寧前胡愈傷組織形態(tài)

植物生長調(diào)節(jié)劑種類、配比及其濃度關(guān)系對組織培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。本研究中，TDZ對寧前胡葉片愈傷組織的誘導(dǎo)表現(xiàn)出顯著的促進作用，MS＋NAA 0.5 mg／L＋TDZ 0.05 mg／L的葉片愈傷組織誘導(dǎo)率達到最高（95.6%），而使用2，4D誘導(dǎo)的愈傷組織多呈白色、疏松易碎狀態(tài)，在誘導(dǎo)初始階段，葉片切口四周先形成毛絨化愈傷組織后向中間聚攏（圖1 i），隨著2，4D濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率也呈上升趨勢；NAA 0.5 mg／L＋6BA 2.0 mg／L組合更適合莖段愈傷組織的誘導(dǎo)，而細胞分裂素6BA在寧前胡莖段愈傷組織誘導(dǎo)中的作用明顯強于TDZ和KT，莖段誘導(dǎo)出來的愈傷組織以黃綠色、質(zhì)地緊密型啞鈴狀愈傷組織為主；由根誘導(dǎo)出來的愈傷組織適宜在NAA 0.5 mg／L＋6BA 2.0 mg／L 或者2，4D 2.0 mg／L＋KT 0.5 mg／L組合的培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)，而低濃度的TDZ對根愈傷組織誘導(dǎo)也有一定促進作用，但是高濃度TDZ（0.5 mg／L）則對愈傷組織產(chǎn)生毒害作用，其誘導(dǎo)出的愈傷組織多為褐色，培養(yǎng)一段時間后漸漸死亡。TDZ是一種苯基脲衍生物，作為一種高效的細胞分裂素，在諸多的木本植物離體再生研究中表明，適宜濃度的TDZ能有效促進再生難度大的植物分化［1315］。

光照對外植體愈傷組織的增殖和分化有很大的影響，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)和光周期方面。文濤等［16］研究不同光照強度對虎杖愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，暗光有利于虎杖愈傷組織的形成。劉蓉等［17］發(fā)現(xiàn)PPO和PAL酶基因上調(diào)表達顯著提高了PPO和PAL酶活性，是引起葡萄愈傷組織褐變的主要原因，這與姜翠翠等［18］研究結(jié)果一致。此外，有研究表明，黑暗或者較低光照強度有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但不利于愈傷組織的生長［1920］，這與本研究結(jié)果一致，寧前胡外植體前期在黑暗或者低光照度暗培養(yǎng)愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色、質(zhì)地緊密，生長快速且不易衰老和褐化，但隨著光照強度的逐漸增強，愈傷組織顏色開始失綠，由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚詈笏劳?。這可能是由于光照強度的增加提高了相關(guān)酶活性［1718］，引起愈傷組織中酚類物質(zhì)氧化加劇褐化程度［21］。而酚類物質(zhì)的合成和氧化有關(guān)的酶是光誘導(dǎo)型酶，將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)是組織培養(yǎng)中導(dǎo)致褐化的最直接原因之一［22］。研究還發(fā)現(xiàn)，弱光培養(yǎng)產(chǎn)生的乳白色愈傷組織生長迅速，質(zhì)地外松內(nèi)緊，不易褐化和衰老，更適宜轉(zhuǎn)接和增殖。

近年來，一些植物組培實驗對外植體不同放置方式對愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生影響進行了相關(guān)研究。張江麗等研究表明，外植體放置方式對桔梗葉片愈傷組織誘導(dǎo)時間和叢生芽數(shù)目有關(guān)，而對誘導(dǎo)率無影響，均達到100%誘導(dǎo)率，但是近軸面朝下愈傷組織出芽更快［23］。曹斌等觀察到馬鈴薯葉片近軸面向下不定芽誘導(dǎo)率明顯高于近軸面向上［24］。而謝利等研究發(fā)現(xiàn)，葉片垂直放置對老虎須愈傷誘導(dǎo)率最高，為66.67%，其次依次為正面向下和正面向上水平放置［25］。楊樹［26］、柿［27］、梨［28］、雞心棗［29］的葉片近軸面接觸培養(yǎng)基能高效的誘導(dǎo)出愈傷組織，且不定芽再生率高，這與寧前胡葉片離體培養(yǎng)放置方式所產(chǎn)生的結(jié)果具有一致性。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與葉片的結(jié)構(gòu)有關(guān)，遠軸面接觸培養(yǎng)基時，角質(zhì)層、維管束、木質(zhì)部朝下，韌皮部朝上，這些結(jié)構(gòu)緊密不易于營養(yǎng)和激素的運輸；近軸面接觸培養(yǎng)基時，由于背面分布較多的氣孔，柵欄組織和海綿組織朝下，背面角質(zhì)層不發(fā)達，這種情況有利于外植體吸收營養(yǎng)和激素。

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