李 群，張文蘭，田 茜，段乃彬，戴 雙，鄧翠霞，顏挺進(jìn)

（山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南250100）

先玉696和先玉335都是鐵嶺先鋒種子研究有限公司選育的國審玉米雜交種，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣、熟期適中、株型合理、籽粒品質(zhì)好、脫水快，出籽率高等優(yōu)點(diǎn)，而先玉696更有著比先玉335抗倒伏、抗病性能高的優(yōu)勢，深受農(nóng)民喜愛，推廣面積逐年加大。

然而先玉696和先玉335有著相同的母本，不僅從種子外觀上二者無任何差異（見圖1），而且利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)進(jìn)行鑒別，由于蛋白質(zhì)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的次生產(chǎn)物，在對遺傳基礎(chǔ)相近的品種鑒定時(shí)具有一定的局限性［1］，同樣也是無法區(qū)分先玉696和先玉335（見圖2）。SSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于品種鑒定和純度檢測研究中，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上呈共顯性、擴(kuò)增穩(wěn)定、引物序列易于交流，而且所需DNA數(shù)量少，質(zhì)量要求不高，檢測容易，重復(fù)性好等特點(diǎn)［13］。本實(shí)驗(yàn)是在已有的研究基礎(chǔ)上，選取多態(tài)性、穩(wěn)定性好、效率高的引物用于鑒別相似品種先玉335與先玉696，取得了良好的效果，以期為同行在工作實(shí)踐中提供一個(gè)快捷的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

先玉696和先玉335玉米雜交種，由本中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 SSR引物

根據(jù)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY／T 1432—2014）［4］中提供的20對核心引物中選取了多態(tài)性高的phil 065 k 9玉米SSR引物。引物序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

提取技術(shù)采用 Weising等［5］研制的CTAB法并稍加改進(jìn)。剪取25℃條件下發(fā)芽4 d的種子幼苗150 mg，置于1.5 m L離心管中，加入400μL DNA提取液［2% （W／V）CTAB，1.4 mol／L NaCl，20 mmol／L EDTA，100 mmol／L TrisHCl p H＝8.0，1%PVP］，磨碎，置于65℃水浴30 min。加入400μL 24∶1氯仿異戊醇（V／V），振蕩混勻。室溫下10 000 r／min離心5 min。將上清液200μL轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管，加入200μL冰冷乙醇沉淀DNA。10 000 r／min離心1 min，倒去上清液，加入500μL乙醇乙酸氨溶液（70%乙醇，10 mmol／L乙酸氨），離心收集沉淀（5 min，10 000 r／min）。加入100μL TE（p H＝8.0）溶解DNA［6］。

圖1 先玉335與先玉696種子形態(tài)比較

圖2 先玉334與先玉696蛋白質(zhì)電泳圖譜比較

1.3.2 DNA質(zhì)量檢測

分別對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，取5μL DNA溶液在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳15 min，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄［6］。

1.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25μL的反應(yīng)體系，包括10 mmol／L TrisHCl，50 mmol／L KCl，3.0 mmol／L MgCl2，0.4μmol／L SSR 引 物，0.25 mmol／L d NTP，1.0單位TaqDNA聚合酶，5μL DNA溶液。反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃，預(yù)變性2 min；94℃，45 s，55℃，1 min，72℃，45 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃，延伸2 min。PCR儀為Rapid Cycler（美國Idaho Technology公司生產(chǎn)）［6］。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

采用多功能電泳儀（北京六一儀器廠生產(chǎn)）和與之配套的雙垂直夾芯式電泳槽。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，160 V進(jìn)行電泳，1 h結(jié)束。銀染：1）固定：含10%乙醇和0.5%冰乙酸溶液中浸泡5 min；2）滲透：0.1%硝酸銀溶液中浸泡10 min；3）漂洗：將膠片移入蒸餾水中洗滌3～5 s；4）顯色：將膠片移入顯色液（含1.5%NaOH和1%甲醛）中輕輕搖晃，直至顯現(xiàn)出清晰譜帶，即可終止顯色，馬上用流動(dòng)的自來水沖洗膠片數(shù)分鐘。

1.3.5 結(jié)果判定

參照《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY／T 1432—2014）進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米品種提取DNA質(zhì)量檢測的結(jié)果

DNA提取是SSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)，SSR標(biāo)記對DNA的數(shù)量及質(zhì)量要求不高［1］，即使部分DNA降解也能通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來。將提取的DNA溶液于0.8%瓊脂糖凝膠上檢測，結(jié)果如圖3所示，1～10各有1條清晰完整的亮帶，盡管有部分有少量降解現(xiàn)象，但都能滿足SSR鑒定玉米品種真實(shí)性的要求。

圖3 先玉335和先玉696 DNA瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果

2.2 引物的選用

引物是進(jìn)行SSR分子標(biāo)記的前提。選擇適合的多態(tài)性高的引物可有效地提高工作效率，節(jié)省成本［6］。根據(jù)以往的工作經(jīng)驗(yàn)，從《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY／T 1432—2014）中提供的20對核心引物中選取了編號為17的phil 065 k 9引物，如表1。

表1 引物的選用

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的結(jié)果

從引物phil 065對先玉335和先玉696擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖2）可看出，在箭頭所指處先玉696有2個(gè)位點(diǎn)與先玉335存在明顯差異，上部位點(diǎn)的2條譜帶比先玉335的距離稍近些，而先玉335的2條譜帶的距離則稍寬些；在下部位點(diǎn)先玉696的2條譜帶距離非常接近，而先玉335在同位點(diǎn)的2條譜帶距離較遠(yuǎn)，由于先玉696與先玉335有著相同的母本，因此在這2個(gè)位點(diǎn)都有與先玉335共有的譜帶，而由于父本不相同，因此在親本共顯的2條譜帶中，顯示出了父本譜帶的不同。

根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY／T 1432—2014）的判定標(biāo)準(zhǔn)，1）當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；2）當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；3）當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為極近似或相同品種。本實(shí)驗(yàn)中由一對引物擴(kuò)增后出現(xiàn)了2個(gè)位點(diǎn)的差異，可以很明確的判別先玉335與先玉696。

圖4 先玉335和先玉696 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

3 討 論

3.1 利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定品種真實(shí)性，引物篩選是關(guān)鍵。許多研究者做了大量的工作，在DNA提取、PCR反應(yīng)程序、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測等環(huán)節(jié)中不斷完善和優(yōu)化［711］，但是對于適合的引物的篩選卻是無法繞開的關(guān)鍵一步，常常要耗費(fèi)大量的時(shí)間和財(cái)力。因此，選用多態(tài)性高的引物進(jìn)行鑒定，可有效地提高工作效率，降低成本。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)以往的工作基礎(chǔ)，僅選用一種多態(tài)性高、重復(fù)性、穩(wěn)定性好的引物用于鑒別先玉335和先玉696，取得了較好的效果。

3.2 本實(shí)驗(yàn)采用8%非變性凝膠電泳方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，較通常用的4.5%變性膠電泳［4］，程序步驟少，操作更為簡單省力，其效果完全滿足實(shí)驗(yàn)要求，實(shí)用性更利于一般種子檢測實(shí)驗(yàn)。

3.3 少數(shù)骨干自交系的頻繁使用導(dǎo)致我國玉米雜交種的遺傳基礎(chǔ)漸趨狹窄，很多雜交種的生物學(xué)特性非常接近，使判別不同雜交種變得十分困難［12］，僅用生化技術(shù)進(jìn)行品種鑒定已經(jīng)無法涵蓋不斷涌現(xiàn)的新品種，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)則可以彌補(bǔ)這一遺憾，不僅可以鑒別品種的真實(shí)性，進(jìn)而可以檢測種子的純度。

［1］辛景樹，郭景倫，賈希海.SSR技術(shù)在玉米種子純度鑒定上的應(yīng)用［J］.種子科技，2005（3）：155157.

［2］中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY／T 449—2001玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

［3］李汝玉，楊平平，宋國安.簡單重復(fù)序列（SSR）及其在品種鑒定及種子檢測中的應(yīng)用［J］.種子，1999，18（5）：3335.

［4］中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY／T 1432—2014）.

［5］Weising K，Nybom H，Wolff K，et al.DNA Fingerpringting in Plants and Fungi［M］.CRC Press Inc.，1995：5155.

［6］李群，李汝玉，顏廷進(jìn)，等.應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定登海11號玉米雜交種純度的研究［J］.種子，2004，23（10）：2123.

［7］郭奕生，何德銀.SSR分子標(biāo)記在玉米品種真實(shí)性鑒定上的應(yīng)用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）：1215.

［8］曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米SSR分子標(biāo)記技術(shù)操作流程研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（15）：14.

［9］任敬雯.SSR標(biāo)記及其在玉米中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（11）：5558.

［10］李蔥蔥，劉娜，李飛武，等.一種快速提取玉米基因組DNA的方法［J］.玉米科學(xué)，2011，19（1）：5255.

［11］王光利，石培春，張薇，等.微衛(wèi)星DNA非變性PAGE銀染法的分析探討［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，43（6）：455458.

［12］李曉輝，李新海，高文偉，等.玉米雜交種DNA指紋圖譜及其在親子鑒定中的應(yīng)用［J］.作物學(xué)報(bào)，2005（3）：386391.