□ 唐義紅 陳嘉敏 深圳市坪山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所

人類在食用含“瘦肉精”的豬肉后，因其具有殘留性和穩(wěn)定性，會致使人們動物性食物中毒，本次測試，是為尋求一種能準(zhǔn)確且快速檢測鹽酸克倫特羅的方法。檢測過程中使用鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條法和ELISA-競爭酶標(biāo)免疫法分別對73份生豬尿樣本進(jìn)行對比檢驗。再利用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法（GC-MS）對以上2種檢測方案結(jié)果實施確證。現(xiàn)把測試的過程和實驗結(jié)果闡述如下。

1 材料準(zhǔn)備

①實驗樣本及來源：生豬尿液；養(yǎng)豬場、屠宰場。②樣本數(shù)：73份。③樣本保存：零下20 ℃冰箱儲藏備用。④試劑準(zhǔn)備：競爭酶標(biāo)免疫試劑盒(包含試劑與標(biāo)準(zhǔn)品），于北京望爾生物技術(shù)有限公司購買。鹽酸克倫特羅快速監(jiān)測試紙條（包含試紙條與滴管），于廣東省廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院技術(shù)研究處購買。

2 試驗方法

2.1 ELISA-競爭酶標(biāo)免疫法

2.1.1 測試材料與設(shè)備

ELISA試劑盒：測試肌肉、肝臟、尿液中的含量，其包含了所有測試用的試劑。需用微孔板酶標(biāo)儀（450nm）用于定量分析[1]。

2.1.2 測試過程

把待檢尿液2 000 g離心10 min后留用上層清液。測前把所有試劑與測試尿液放置室溫19～25 ℃；把足量標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20μL導(dǎo)入微孔中，再加入酶標(biāo)二抗50μL/孔。標(biāo)準(zhǔn)品與樣本進(jìn)行2個平行實驗。記錄各自位置；將抗體工作液80μL/孔利用稀釋劑進(jìn)行稀釋后，再導(dǎo)入微孔中，然后將微孔口密封，室溫放置15 min；將微孔內(nèi)液體倒出后，把微孔架具倒立在吸水紙上，通過拍打和擦拭除盡孔中液體，然后將250μL試劑盒提供的洗滌工作液導(dǎo)入微孔中，再將微孔液體倒掉，重復(fù)2遍以上操作；仔細(xì)攝取20 μL標(biāo)準(zhǔn)液和經(jīng)過處理的樣品溶劑導(dǎo)入微孔，同樣利用準(zhǔn)確溶液和樣品溶液進(jìn)行2個平行測試；導(dǎo)入酶標(biāo)二抗50 μL物至微孔底面，將其均勻混合密封，室溫孵育30 min后倒出液體。再次消釋微孔中的液體，將250μL工作洗滌液導(dǎo)入微孔后，與上述步驟一樣，倒掉微孔中的液體，重復(fù)進(jìn)行兩次操作；將發(fā)色劑和基質(zhì)各100 μL導(dǎo)入微孔，繼續(xù)利用振蕩儀器進(jìn)行振蕩均勻，然后通過室溫遮光孵育15 min；將終止液50 μL/孔終止液導(dǎo)入微孔，振蕩均勻。在微孔的450nm刻度處，借助空氣讓空白測試吸光度值。

2.1.3 鑒定測試結(jié)果

檢測結(jié)果≥5μg/L，判定為陽性＜5 μg/L，檢測結(jié)果，判定為陰性，鹽酸克倫特羅的檢出限為0.5 μg/L。尿液稀釋系數(shù)為1。

2.2 鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條法

2.2.1 樣品準(zhǔn)備

尿液放置室溫20～24 ℃。同樣2 000 g離心10 min。留用上層清液進(jìn)行測試。

2.2.2 測試過程

分別向檢測板孔中倒入標(biāo)準(zhǔn)品1、標(biāo)準(zhǔn)品2與80 μg待檢尿液；把此檢測孔板條平衡固定于檢測板，并與試紙共同置于25 ℃的冰箱中，注意不要將試紙條插入樣品；15～20 min，將試紙條一起置于檢測板孔中；同樣，此時再次把檢測固定板和試紙一起平衡放入4℃的冰箱之中。切勿將試紙取出檢測孔，還要保證試紙是平放在檢測孔底面的；放置8～10min后開始判定結(jié)果。

2.2.3 檢測結(jié)果判定過程及記錄

將試紙和測試固定板共同置于4℃的冰箱之后進(jìn)行計時，在8 min后觀察發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品1的反應(yīng)線條明顯顯現(xiàn)出棕紅色，而相對于標(biāo)準(zhǔn)品1的反應(yīng)線顏色標(biāo)準(zhǔn)品2要淡很多；10 min左右把待檢測的樣本反應(yīng)線與標(biāo)準(zhǔn)品1、2顏色進(jìn)行對比然后進(jìn)行結(jié)果判定，若顏色淺，則鹽酸克倫特羅的含量越多，顏色也深，則含量越少；若待檢樣本顏色與1的反應(yīng)線顏色相比并不覺淺，則鑒定為未檢出；若待檢測樣本顏色深度呈現(xiàn)在兩者之間時，那么鹽酸克倫特羅的含量的含量也同樣介于標(biāo)準(zhǔn)品1與2之間，即0～5ng/mL；若待檢樣本其顏色深度明顯淺于標(biāo)準(zhǔn)品2，那么它的含量則高于標(biāo)準(zhǔn)品2的含量，即＞5ng/mL。

2.3 固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析法

GC-MS分析方法是全球統(tǒng)公認(rèn)的檢測克倫特羅殘留的證實方法，這種方式是通過將鹽酸克倫特羅在離子與C18固相萃取柱上萃取。不同度數(shù)的克倫特羅萃取回收率為75%～95%，最低檢測度數(shù)為0.5ng/mL，而它的硅烷化產(chǎn)物，利用選取離子的形式進(jìn)行檢驗（86、243、262、277）。

3 結(jié)果

經(jīng)過對73份樣本豬尿液中鹽酸克倫特羅檢測獲悉：其中有1份的生豬尿液通過快速檢測試紙條法檢測后顯示克倫特羅含量＞5ng/mL，呈陽性。而利用ELISA方法對73個豬尿樣本進(jìn)行測試時，沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣品，即是表明鹽酸克倫特羅含量5ng/L。最后利用GC-MS分析法對73份樣本進(jìn)行確證，樣本中其含量都未達(dá)到5ng/L，即GC-MS分析方法測試為陰性。

4 結(jié)語

通過此次試驗，筆者認(rèn)為，為確保測試的精確性，利用ELISA方法對樣本豬尿液中的鹽酸克倫特羅進(jìn)行檢測后，再利用GC-MS分析方法對可疑的、呈陽性的樣本進(jìn)行確證，這樣檢測的效果相比鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條法更好，同時也節(jié)約了人力與成本。

[1]張貴云.豬尿液中鹽酸克倫特羅(瘦肉精)殘留量檢測方法比較[J].北京農(nóng)業(yè),2010(3):34-36.