周小利，楊詩(shī)怡，陳志蕓，索文龍，牛永志，馬文廣，廖菊夠，顧 菁，陳穗云

（1云南大學(xué)云南省高校植物病蟲(chóng)害生物防控工程研究中心，昆明650091；2玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南玉溪653100；3云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南玉溪653100）

0 引言

植物雄性不育(male sterility，MS)是指雌配子正常發(fā)育，雄配子發(fā)育異常，能接受外來(lái)正?；ǚ凼芫Y(jié)實(shí)的現(xiàn)象。目前為止，有610個(gè)植物種被報(bào)道存在雄性不育類(lèi)型[1]，包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)和細(xì)胞核雄性不育(GMS)，前者由線粒體基因偶聯(lián)核基因共同控制，后者僅由核基因單獨(dú)導(dǎo)致[2]。雄性不育植株一般表現(xiàn)為3種類(lèi)型：一是花藥退化和干癟，僅花絲部分殘存；二是花藥內(nèi)不產(chǎn)生花粉；三是產(chǎn)生的花粉敗育。其中花粉敗育可能是由于溫度過(guò)低或者嚴(yán)重干旱等外界因素，使花粉母細(xì)胞不能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，導(dǎo)致不能形成正常發(fā)育的花粉；另外，絨氈層細(xì)胞異常，也會(huì)造成花粉敗育。迄今為止，細(xì)胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象己經(jīng)在水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、高粱、大豆等主要農(nóng)作物和洋蔥、辣椒、菜豆、向日葵等園藝作物中發(fā)現(xiàn)。雜種優(yōu)勢(shì)是雜合體在一種或多種性狀上優(yōu)于2個(gè)親本的現(xiàn)象[3]，利用雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生了巨大的全球作物生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[4]。在雜交育種實(shí)踐中，利用雄性不育可以免去人工去雄節(jié)約勞力，是雜交種子生產(chǎn)的理想材料。利用胞質(zhì)雄性不育系、恢復(fù)系和保持系的三系配套制種，已成為國(guó)際制種業(yè)的主要趨勢(shì)，可節(jié)省大量的人力物力，并能提高雜交種子的純度和雜交親和性[5]。CMS已被廣泛運(yùn)用于玉米、水稻、油菜和向日葵等的雜交育種實(shí)踐[6-7]，取得了良好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)又稱(chēng)為核質(zhì)互作雄性不育，由線粒體不育基因和核恢復(fù)基因(restorer of fertility,Rf)共同調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)線粒體基因產(chǎn)物導(dǎo)致雄性不育，而細(xì)胞核育性恢復(fù)基因(Rf)產(chǎn)物能改變線粒體中不育基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，使不育系恢復(fù)育性[8]。CMS不僅是植物生殖生物學(xué)研究中的一個(gè)重要性狀，也是研究作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，在作物育種和分子生物學(xué)研究中具有重要地位[9]，CMS系還是研究植物核質(zhì)互作的理想模型。前人針對(duì)不同物種CMS的遺傳調(diào)控機(jī)制開(kāi)展了大量研究，希望能揭示CMS的作用機(jī)制和途徑。以往的研究主要集中在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面，近幾年來(lái)，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展下，植物基因組的研究也在不斷深入，CMS分子機(jī)制的研究發(fā)展主要包括確定了細(xì)胞質(zhì)雄性不育的相關(guān)區(qū)域，以及該區(qū)域相關(guān)的轉(zhuǎn)錄與翻譯譜、細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的形成機(jī)制、恢復(fù)基因的作用機(jī)制及相關(guān)育性恢復(fù)基因的鑒定等方面[10]。CMS方面的研究主要是針對(duì)線粒體雄性不育基因的鑒定及其作用機(jī)制研究，細(xì)胞核育性恢復(fù)基因的鑒定，及其通過(guò)何種途徑影響線粒體不育基因，并恢復(fù)育性。但多數(shù)研究都是針對(duì)某一個(gè)特定的物種而言，并沒(méi)有系統(tǒng)介紹過(guò)有關(guān)植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育和育性恢復(fù)調(diào)控機(jī)制方面的內(nèi)容。而且隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，更多的研究都注重育性恢復(fù)基因的克隆和鑒定，細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的作用模型及育性恢復(fù)的調(diào)控機(jī)制研究甚少。

本研究系統(tǒng)總結(jié)了前人在細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)制和作用模型、細(xì)胞質(zhì)線粒體不育基因、細(xì)胞核育性恢復(fù)基因鑒定、功能和作用途徑，及二者互作機(jī)理研究方面的進(jìn)展，以更好地指導(dǎo)將來(lái)對(duì)核質(zhì)互作遺傳調(diào)控機(jī)理的研究，從而使細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在雜種優(yōu)勢(shì)遺傳育種中發(fā)揮更好的作用。

1 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)制和作用模型

在CMS植株中，線粒體基因和核基因相互作用，控制植物的雄性特異性、育性發(fā)生和恢復(fù)。線粒體不育基因可能通過(guò)多種途徑導(dǎo)致雄性不育：一是線粒體DNA重排，引起嵌合基因或新的orf表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物多為毒蛋白，這些蛋白產(chǎn)物影響線粒體呼吸鏈反應(yīng)和絨氈層發(fā)育，導(dǎo)致雄性不育[11]；二是受異質(zhì)的核背景可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合酶基因序列出現(xiàn)缺失、突變等，造成基因編碼產(chǎn)物在氨基酸序列、親疏水性和不同結(jié)構(gòu)層次的改變，并影響線粒體電子傳遞鏈及氧化磷酸化過(guò)程相關(guān)酶的正常功能，造成雄性不育[12,13]；三則可能通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，如研究指出線粒體編碼蛋白產(chǎn)物的基因存在廣泛的翻譯后編輯現(xiàn)象，主要是C-U類(lèi)型的編輯，這種翻譯后編輯與雄性不育密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)揮作用的不同機(jī)制，前人提出了不同的作用模型，包括細(xì)胞毒害模型、能量缺乏模型和細(xì)胞程序性死亡模型等[9,14]。

1.1 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的細(xì)胞毒害模型

在細(xì)胞毒害模型中，CMS毒蛋白直接殺死正常細(xì)胞。第一次發(fā)現(xiàn)的CMS系毒蛋白是玉米CMS-T的urf13基因產(chǎn)物，該蛋白對(duì)大腸桿菌[15-16]和許多真核細(xì)胞有毒[17-18]。自從urf13被發(fā)現(xiàn)以后，一些CMS毒蛋白，如向日葵CMS-pet1的ORF 522[19]，蘿卜CMS-Ogu的ORF 138[20]，新型甘藍(lán)型CMS-Hau的ORF 288[21]、水稻CMS-BT的ORF 79相繼被發(fā)現(xiàn)[22-23]，而水稻CMS-WA的WA352也被證明對(duì)大腸桿菌有毒。CMS毒蛋白影響孢子體和配子體線粒體功能，導(dǎo)致雄性不育[18]。大多數(shù)CMS蛋白質(zhì)是10 k～35 kDa的跨膜蛋白，具有一個(gè)疏水區(qū)，這是典型的細(xì)胞毒蛋白特征。CMS-WA的WA 352蛋白對(duì)大腸桿菌的毒性依賴(lài)于特定的跨膜結(jié)構(gòu)，但在植物中表達(dá)WA 352蛋白不含跨膜區(qū)域的片段仍然導(dǎo)致雄性不育[23]，表明CMS毒蛋白WA 352誘導(dǎo)植物雄性不育不依賴(lài)跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的能量缺乏模型

花藥的孢子體和配子體細(xì)胞需要的生物合成能量比其他器官的細(xì)胞能量要多，因此花藥細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)增加線粒體數(shù)目或通過(guò)增加線粒體的代謝活性產(chǎn)生更多的能量，線粒體通過(guò)mtETC呼吸鏈傳遞生產(chǎn)的ATP對(duì)花粉發(fā)育至關(guān)重要。在能量缺乏模型中，線粒體CMS蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致線粒體的能量代謝缺陷，而不能滿足雄性生殖發(fā)育能量需求。在向日葵CMS-PET1中，ORF 522編碼含有19個(gè)氨基酸蛋白的嵌合基因orfB，該基因產(chǎn)物可能危及F1F0-ATP酶活性[24]，導(dǎo)致CMS-PET1植物的ATP酶活性明顯低于可育植株。其它物種的CMS蛋白含有類(lèi)似orfB序列，包括蘿卜ORF 138和ORF 125、白菜的ORF 224和ORF 222、胡蘿卜CMS的orfB，都可能通過(guò)相似的機(jī)制導(dǎo)致雄性不育。另外，CMS蛋白質(zhì)還可能會(huì)影響線粒體膜的完整性，導(dǎo)致質(zhì)子泄漏和能量產(chǎn)生不足或通過(guò)功能性同源競(jìng)爭(zhēng)mtETC F1F0-ATP酶復(fù)合物，形成無(wú)效或低效mtETC或F1F0-ATP酶復(fù)合物干擾ATP的產(chǎn)生[25]，從而調(diào)控育性。

1.3 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的異常細(xì)胞程序性死亡模型

細(xì)胞程序性死亡(PCD)是指生物體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，由自身基因編碼、主動(dòng)和有序的死亡進(jìn)程，是生物體新陳代謝過(guò)程中正常的生理反應(yīng)[26]。如果啟動(dòng)PCD程序的基因發(fā)生突變，或由于環(huán)境因素的改變使PCD程序不能啟動(dòng)或死亡程序執(zhí)行過(guò)程中被提前終止都會(huì)使花粉育性發(fā)生變化。植物中雄性不育是從小孢子發(fā)生到雄配子體發(fā)育成熟的不同階段，小孢子或雄配子體發(fā)生了異常的PCD，其中一部分是由絨氈層細(xì)胞過(guò)早或過(guò)晚發(fā)生PCD而造成的，還有一部分是在減數(shù)分裂過(guò)程中特定階段的PCD異常所引起的。目前，已在擬南芥[27]、水稻[28]、板栗[29]、白菜[30]中發(fā)現(xiàn)因相關(guān)的程序性死亡而引起的雄性不育現(xiàn)象，并且已在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步證實(shí)是通過(guò)細(xì)胞程序性死亡過(guò)程引起的雄性不育。

2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)的機(jī)制

如上所述，線粒體不育基因及其產(chǎn)物是導(dǎo)致CMS的主要原因。抑制CMS基因的表達(dá)，或抵消其不育產(chǎn)生的負(fù)面作用是恢復(fù)育性的重要途徑，細(xì)胞核育性恢復(fù)基因(Rf)在該過(guò)程中扮演了重要角色。除玉米R(shí)f2編碼乙醛脫氫酶外，矮牽牛Rf0[31]，油菜Rf0[32]、水稻Rf1a[33]、Rf1b[34]，蘿卜Rfk1[35]及高粱Rf1 和Rf2[36]都編碼的是由PPR基序串聯(lián)組成的PPR蛋白[37]。PPR是高等植物中最大的基因家族之一，在介導(dǎo)植物細(xì)胞器基因的表達(dá)上起著重要作用，能調(diào)節(jié)葉綠體和葉綠體基因的表達(dá)或RNA的剪接、編輯、加工和翻譯等[38]。Rf基因及其產(chǎn)物PPR蛋白可以在不同的分子水平上通過(guò)各種機(jī)制使育性恢復(fù)。關(guān)于恢復(fù)基因的作用機(jī)制：第一是恢復(fù)基因編碼的產(chǎn)物，彌補(bǔ)了由線粒體基因重排導(dǎo)致的育性相關(guān)基因不能正常表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，使育性恢復(fù)；第二是恢復(fù)基因抑制了不育基因相關(guān)ORF的表達(dá)，消除或削弱了不育基因產(chǎn)物毒蛋白的影響。

2.1 恢復(fù)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的作用

恢復(fù)基因可以抑制相關(guān)CMS基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低不育基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，恢復(fù)育性。在CMS-S型玉米中，恢復(fù)基因Rf3能夠減少與不育有關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄[39]；在菜豆中，恢復(fù)基因Rf2使育性恢復(fù)植株中CMS特異轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性下降，基因表達(dá)量也下降[40]。蘿卜的恢復(fù)基因Rf0編碼3個(gè)高度相似的PPR蛋白(PPR-A、PPR-B、PPR-C)，免疫沉淀顯示在體內(nèi)PPR-B與ORF l38 mRNA相關(guān)，直接或間接的作用于ORF 138 mRNA，調(diào)控ORF 138 mRNA轉(zhuǎn)錄[41]。

恢復(fù)基因也能影響CMS相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的加工、編輯，如在甘藍(lán)型油菜恢復(fù)基因Rfp影響Pol型不育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的加工，使單順?lè)醋觓tp6轉(zhuǎn)錄的豐度增加[42-43]；在高粱A3細(xì)胞質(zhì)中，恢復(fù)基因Rf3切割線粒體基因ORF l07 mRNA的核苷酸位點(diǎn)，這種切割是育性恢復(fù)的必要條件[44]；實(shí)驗(yàn)也證實(shí)煙草atp 9基因的編輯和育性恢復(fù)相關(guān)[45]；另外在CMS-Ogura蘿卜中也發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)基因Rft能夠?qū)RF138轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加工，并調(diào)控育性[46]。在CMS-WA水稻中發(fā)現(xiàn)，與可育系相比，不育系線粒體基因組中的orfB轉(zhuǎn)錄物未被編輯[47]。CMS-HL水稻中的恢復(fù)基因Rf5所編碼的蛋白是育性恢復(fù)復(fù)合體的組成成分，該復(fù)合體在體外能夠切割CMS相關(guān)轉(zhuǎn)錄物[48]。

2.2 恢復(fù)基因在蛋白水平上的作用

恢復(fù)基因也可能通過(guò)減少不育基因編碼的蛋白質(zhì)積累量而恢復(fù)育性[49]。在CMS-C型向日葵中，育性被Rf基因恢復(fù)的雜種與不育系轉(zhuǎn)錄模式相同，Rf基因不影響不育基因RNA的編輯，但育性恢復(fù)的雜種花藥中，不育基因編碼的16 kDa蛋白產(chǎn)物顯著減少[50]；CMS-Ogura型油菜的恢復(fù)基因恢復(fù)育性的雜種轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯變化，但不育基因蛋白質(zhì)的豐富度卻大大降低[51]；在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)育性恢復(fù)植株與不育植株的線粒體不育基因ORF 138的轉(zhuǎn)錄效率相同，但恢復(fù)基因編碼產(chǎn)物可能降低了ORF 138編碼蛋白的穩(wěn)定性，從而使ORF 138蛋白積累減少[52]；在CMS-Ogura蘿卜中也發(fā)現(xiàn)，Rf0并不改變ORF l38轉(zhuǎn)錄豐度，但是顯著降低葉片和花器官中ORF 138蛋白的含量[53]。

3 存在問(wèn)題及展望

許多物種CMS不育基因和相應(yīng)的Rf基因被鑒定，加深了人們對(duì)核質(zhì)互作的雄性不育的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)遺傳調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，水稻CMS-WA、甜菜CMSOwen和胡椒CMS-Peterson等作物的不育系已成功運(yùn)用于雜交育種和生產(chǎn)實(shí)踐。然而，CMS/Rf在一些農(nóng)作物如煙草、小麥、高粱等上的研究卻一直停滯不前，另外，在胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)中，CMS蛋白和Rf蛋白相互作用和線粒體逆行調(diào)節(jié)信號(hào)尚未確定，CMS蛋白特異性積累并誘導(dǎo)雄性不育的機(jī)制仍不清楚。雖然分子生物學(xué)技術(shù)和理論的迅速發(fā)展對(duì)CMS的研究起到了巨大的促進(jìn)作用，但CMS過(guò)程涉及花發(fā)、配子體發(fā)育過(guò)程中能量的調(diào)配，基因在時(shí)間和空間上的相互作用，由于受到許多方面因素的影響，該領(lǐng)域的研究一直都是模糊不清的。鑒于不育系在作物遺傳育種中的重要性，需要研究更多的農(nóng)作物CMS系統(tǒng)并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，以避免遺傳脆弱性，筆者認(rèn)為在今后一段時(shí)間內(nèi)CMS的生物學(xué)研究和應(yīng)用將集中在以下幾個(gè)方面。

（1）伴隨新的研究技術(shù)發(fā)展，通過(guò)全基因組測(cè)序技術(shù)加大植物基因組研究的范圍，鑒定更多作物育性恢復(fù)系中的Rf基因；如在水稻和蘿卜中[54-56]，測(cè)定CMS系的完整線粒體基因組序列測(cè)序，提供了尋找新的不育候選ORF的有效途徑，增加了對(duì)CMS/Rf系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，更助于解決目前在研究CMS/Rf系統(tǒng)方面的挑戰(zhàn)。

（2）在機(jī)制研究上，需要更詳細(xì)地了解線粒體ORF編碼的蛋白質(zhì)對(duì)花粉育性影響的具體機(jī)制，以便揭示更多植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育與不育的現(xiàn)狀，闡明CMS/Rf的相互作用即兩者基因間相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物的相互作用。從目前已克隆的植物CMS的Rf基因中，多數(shù)都含有PPR基序，因此一種更加方便可行的方法就是通過(guò)對(duì)基因組PPR基序的篩選來(lái)克隆植物CMS的rf基因。

（3）在雄性不育系應(yīng)用方面，雄性不育系對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)明顯，在更多的植物中構(gòu)建雄性不育系的植株對(duì)農(nóng)作物等有巨大作用。通過(guò)利用基因工程的方法來(lái)創(chuàng)造不同植物種的雄性不育系，從而避免了大多數(shù)雄性不育系是通過(guò)人工雜交篩選獲得、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，也避免了利用原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)創(chuàng)造雄性不育系實(shí)際應(yīng)用中占的比例很小的局限。隨著對(duì)CMS育性恢復(fù)機(jī)制研究深入，已經(jīng)證明線粒體基因組中的開(kāi)放閱讀框是造成不育的重要原因，但是利用這些開(kāi)放閱讀框的特異性表達(dá)影響育性的研究還需更加深刻，因此，線粒體開(kāi)放閱讀框在不育系構(gòu)建上的應(yīng)用也是將來(lái)需要研究的一個(gè)重要方面。此外，利用葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化毒素基因構(gòu)建不育系[57]的研究成功為今后對(duì)CMS的研究和應(yīng)用開(kāi)辟了新的思路。

（4）可以借助高通量測(cè)序技術(shù)，綜合各種組學(xué)研究，從全基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、表觀基因組、表形組等多個(gè)水平對(duì)植物CMS的分子機(jī)制進(jìn)行全面深入的研究，為挖掘CMS候選基因以及深入解釋CMS的分子機(jī)制提供豐富的信息，加速對(duì)植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育和育性恢復(fù)調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)程。