李鵬 郭修田

作者單位：200071 上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科

骨骼肌是人體最豐富的組織，約占人體體重的40﹪。它的損傷會導致肌肉和功能的喪失，而手術(shù)治療并不能完全恢復損傷的骨骼肌，尤其在大量肌肉丟失的患者[1]。損傷部位周圍的衛(wèi)星細胞作為肌源性干細胞，在骨骼肌損傷后能夠迅速的活化，增殖，遷移至損傷區(qū)域，產(chǎn)生成肌細胞并形成新生的多核纖維或與損傷的肌纖維融合，從而促進骨骼肌再生。但是，衛(wèi)星細胞在通過肌組織和內(nèi)皮細胞層時受到限制，并且在肌肉注射衛(wèi)星細胞1 d 后僅有不足1﹪的成肌細胞存活[2-3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細胞在體外很難純化擴增，體內(nèi)移植不僅移植率低，還會很快衰老死亡[4]。不僅如此，早期組織學研究發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細胞的比例從出生后的35﹪～40﹪下降到成年時的1﹪～ 4﹪[5]。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）因其四大特性而廣泛用于組織工程學研究，包括：多向分化潛能，旁分泌潛能，免疫調(diào)節(jié)與抑制功能，便捷的分離和擴增[6-8]。本篇綜述旨在介紹BMSC的成肌分化潛能在骨骼肌修復與再生中的應用。

一、BMSC的特性

BMSC作為成體干細胞，不僅擁有自我復制的潛能，還可分化為其他多種細胞系，如脂肪細胞，軟骨細胞，肌細胞，神經(jīng)元以及內(nèi)皮細胞等[9-11]。國際細胞治療協(xié)會提出定義間充質(zhì)干細胞的最低標準：首先必須擁有貼壁特性與成纖維細胞樣形態(tài)；其次必須表達CD105，CD73和CD90，并且缺乏CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79α 或 CD19和HLA- DR表面分子的表達；最后可分化為成骨細胞，軟骨細胞和脂肪細胞等[12]。近年來，BMSC在再生醫(yī)學領(lǐng)域受到重視，BMSC的分化潛能和旁分泌特性使其成為組織修復的關(guān)鍵選擇，通過分泌可溶性因子和釋放外泌體以促進組織的修復與再生[13-15]。Nakamura等[16]采用BMSC來源的外泌體治療由心臟毒素損傷的大鼠脛骨前肌，發(fā)現(xiàn)外泌體可顯著促進成肌分化與血管再生，雖然成纖維細胞生長因子2、粒細胞集落刺激因子、血小板衍生因子等肌肉修復相關(guān)因子水平較低，但卻有大量的與肌肉修復相關(guān)的miRNA產(chǎn)生，深入研究發(fā)現(xiàn)BMSC來源的外泌體促進成肌分化和血管再生的作用一部分是由miR-494介導的。許多研究證實BMSC擁有免疫調(diào)節(jié)的潛能，它可通過與先天和適應性免疫細胞相互作用，也可通過細胞間的直接接觸和分泌可溶性因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[6,17-18]。BMSC的多種潛能使其能夠在組織器官等修復與再生方面發(fā)揮重要作用。

二、BMSC在成肌分化的角色

在1998年，F(xiàn)errari等[19]最初采用BMSC治療損傷的肌肉，發(fā)現(xiàn)它會遷移至損傷部位，并產(chǎn)生成肌分化從而促進損傷肌纖維的再生。在此之后，許多學者都致力于BMSC對于損傷肌肉的修復與再生方面的研究。

BMSC的免疫調(diào)節(jié)能力使其能夠有效的改善肌肉損傷的局部炎癥反應。Helal等[20]將1.5×106個BMSC注射在大鼠短收肌損傷處，28 d后與對照組相比，發(fā)現(xiàn)BMSC組可顯著降低促炎因子的表達，如：白介素6（interleukin,IL- 6），白介素 1β，腫瘤壞死因子 α，轉(zhuǎn)化生長因子 β1，干擾素α，并能上調(diào)IL-10的水平，認為局部注射BMSC可通過抑制炎癥細胞因子的釋放與抗炎細胞因子的活化改善損傷處的免疫反應與促進骨骼肌的再生。BMSC還可通過降低TGF-β1的水平以抑制由骨骼肌損傷導致的纖維化。然而，Gala等[21]將BMSC移植在肌肉后卻發(fā)現(xiàn)損傷部位的促炎細胞因子 IL-1β，IL-1α，IL-6 升高，尤其是 IL-1β，并伴隨白細胞和巨噬細胞的浸潤，提示BMSC移植在骨骼肌后會產(chǎn)生局部急性炎癥。

Anabel等[22]將LacZ標記的BMSC注射在免疫缺陷小鼠的由心臟毒素損傷的脛骨前肌后，發(fā)現(xiàn)β半乳糖苷酶陽性細胞從注射區(qū)域遷移至脛骨前肌損傷處，并且混合肌纖維的數(shù)量顯著增加，提示BMSC移植有助于改善心臟毒素損傷的脛骨前肌的再生和重塑。而Winkler等[23-24]則采用不同數(shù)量的BMSC治療比目魚肌開放性損傷，發(fā)現(xiàn)107個細胞對于肌肉收縮力的恢復達到最好的效果，并且移植BMSC的數(shù)量與肌收縮力的恢復呈對數(shù)關(guān)系，提示BMSC可促進骨骼肌功能的恢復。此外，他又通過對比損傷后立即移植BMSC與損傷后一周的延遲移植對于受損的比目魚肌肌力的恢復療效，發(fā)現(xiàn)兩種移植方式對于肌收縮力的恢復并沒有顯著差異。

Von等[25]通過研究BMSC移植對骨骼肌損傷的恢復與性別的關(guān)系，移植相同數(shù)量的BMSC至損傷的比目魚肌，發(fā)現(xiàn)BMSC可顯著促進骨骼肌力量的恢復，而且雄性與雌性鼠并無差別。在此之后，他[26]同樣采用比目魚肌損傷模型，移植2.5×106個BMSC到損傷部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，治療組肌收縮力顯著增高，但組織學分析顯示兩組并沒有顯著差異，提示自體BMSC移植引起的收縮力的改善也許是通過損傷處的慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)換的方式引起的。

三、生物材料的應用

雖然BMSC移植可促進損傷肌肉的再生，但它在損傷處的生存率及數(shù)量卻較低，這大大縮減了移植干細胞的治療效果。在移植前，對干細胞進行預處理能夠顯著改善干細胞的特性及生存率。細胞外基質(zhì)在骨骼肌的再生和恢復中尤為重要，它可為BMSC提供一種適宜的生存環(huán)境，并能夠產(chǎn)生多種細胞因子從而促進BMSC的增殖和分化[27]。Merritt等[28]將肌肉來源的細胞外基質(zhì)移植在面積為1 cm2×1 cm2腓腸肌全層損傷處，7 d 后再將BMSC移植在相應細胞外基質(zhì)上，與對照組相比，實驗組顯示更多的血管和肌纖維的生成，以及更短的恢復時間。

隨著科技的發(fā)展，越來越多的生物材料用于組織工程學研究以達到促進組織再生的目的。這些生物材料與細胞外基質(zhì)作用相同，都具有生物相容性，不僅可作為干細胞移植載體，還能為干細胞營造一種三維的類似體內(nèi)的細胞微環(huán)境，甚至一些還可誘導干細胞向骨骼肌定向分化。Kheradmandi等[29]將BMSC移植在殼聚糖聚乙烯醇納米纖維載體上，再將其移植在兔子下肢肌肉損傷處，發(fā)現(xiàn)能夠促進細胞增殖，并能降低免疫反應。Zhao等[30]將沒有成肌細胞因子誘導的BMSC移植在一種復合材料上——聚乙烯乙二醇多壁納米薄膜，發(fā)現(xiàn)成肌細胞標志物如成肌細胞分化蛋白 1（myogenic differentiation1，MyoD1），結(jié)蛋白，肌球蛋白重鏈2（myosin heavy chain2，MHC-2）以及骨骼肌特異性標志物（肌鈣蛋白C，蘭尼堿受體）高表達，但并沒有出現(xiàn)脂肪，軟骨，成骨等標志物，提示此種納米薄膜可定向促進BMSC向成肌細胞分化，從而促進骨骼肌修復。

近來，水凝膠被廣泛用于干細胞，許多研究證明它能促進干細胞的增殖、分泌、分化。Xu等[31]將BMSC壓縮在彈性膨脹系數(shù)為20 Kpa的溫敏性水凝膠中，發(fā)現(xiàn)可顯著促進BMSC成肌分化，并表達最高的成肌細胞標志物，如MHC，肌生成素，MyoD1，MHC-2，證實溫敏性水凝膠能夠促進干細胞的成肌分化與骨骼肌再生。在一個大鼠壓力性尿失禁模型中，Du等[32]采用BMSC聯(lián)合藻酸鈣凝膠治療，與對照組相比，BMSC組不僅有更多的結(jié)蛋白，平滑肌肌動蛋白α產(chǎn)生，而且漏尿壓顯著增高，證實BMSC在壓力性尿失禁的微環(huán)境中可分化為肌細胞。

Egusa等[33]將培養(yǎng)BMSC的成肌分化培養(yǎng)基放置在一種可產(chǎn)生周期性張力的裝置，RT-PCR發(fā)現(xiàn)骨骼肌成肌標志物基因顯著上調(diào)，包括成肌調(diào)節(jié)因子5，肌生成素，成肌調(diào)節(jié)因子4，但沒有平滑肌標志物基因，如心肌蛋白，平滑肌激動蛋白α，并在治療5 d后產(chǎn)生肌球蛋白和肌生成素陽性的肌管，提示采用這種裝置可定向促進BMSC成肌分化。Haghighipour等[34]將BMSC培養(yǎng)在Ⅰ型膠原纖維包被的硅膠膜上，并將其置于10﹪，1 Hz的循環(huán)單軸應變力裝置添加胰島素樣生長因子1，發(fā)現(xiàn)同時采用裝置和胰島素樣生長因子1可顯著促進肌細胞生成素和成肌調(diào)節(jié)因子6的表達，提示循環(huán)單軸應變力可促進BMSC向骨骼肌分化。

近來，一些磁力裝置也被用來提高干細胞的歸巢和定植能力。研究發(fā)現(xiàn)低頻電磁場可影響B(tài)MSC的黏附力、增殖、分化以及生存能力[35]。磁力細胞定位系統(tǒng)與磁力細胞輸送系統(tǒng)可促進移植的干細胞在損傷部位定植，Oshima等[36]發(fā)現(xiàn)將移植在損傷部位的105個BMSC處于強度為1.5 T，持續(xù)時間為10 min的磁場中可顯著增強損傷的肌肉恢復。而Nakabayashi等[37]將磁力細胞輸送系統(tǒng)用于采用鐵羧葡胺和魚精蛋白作為磁性標記的BMSC治療脛骨前肌損傷，通過生物發(fā)光成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)實驗組有更多的BMSC定植在損傷部位與更好的骨骼肌功能恢復。

四、藥物、細胞因子及細胞共培養(yǎng)在BMSC促進骨骼肌再生中的作用

5-氮雜胞苷（5-Azacytidine，5-AZA）是一種與胞嘧啶核苷類似的DNA甲基化抑制劑，15 μmol/L的5-AZA治療BMSC可促進心肌和骨骼肌相關(guān)基因的表達[38]。研究證明由聚乙酸內(nèi)酯構(gòu)成的電紡纖維是一種與細胞外基質(zhì)類似的裝置，與5-AZA在肌管的生成和成熟方面起協(xié)同作用，并可促進5-AZA誘導的BMSC成肌分化能力[39]。BMSC可向多種細胞分化，但分化的產(chǎn)量一直處于較低水平，而Conforti等[40]為了克服這一缺陷，采用濃度為50 nm的逆轉(zhuǎn)素預處理BMSC，發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進BMSC大量分化為骨骼肌細胞。

干細胞治療的最大障礙是不能歸巢到損傷部位及低存活率，而采用一些細胞因子可有效改善這一缺陷。Xinaris等[41]發(fā)現(xiàn)在移植前采用胰島素樣生長因子1對BMSC進行預處理可增強遷移能力并能促進急性腎衰后功能的恢復。SDF-1/CXCR4與Notch信號通路可調(diào)節(jié)BMSC的遷移和功能，在BMSC遷移至損傷區(qū)域與促進創(chuàng)面肌肉血管再生方面起著不可或缺的作用[42-45]。雖然基質(zhì)細胞衍生因子1（Stromal cell-derived factor1，SDF-1）并不會影響成肌細胞的分化與成肌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達，但是它不僅可增強骨骼肌再生，還可促進成肌細胞與CD34或CXCR4陽性細胞的遷移，并且發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9活性的增加有關(guān)，提示采用SDF-1預處理可增強BMSC修復骨骼肌的能力[46]。四跨膜蛋白超家族中的CD9和CD81蛋白在成肌細胞的融合和保護肌管的免受凋亡方面起重要作用[47]。在骨骼肌再生時，成肌細胞的CD9和CD81的表達會上調(diào)，但在肌再生過程中若同時缺乏CD9和CD81，便會迅速產(chǎn)生離散的營養(yǎng)不良的肌纖維，并發(fā)生肌管頻繁的融合，從而導致異常的肌肉再生[48]。Brzoska等[49]采用SDF-1預處理BMSC，發(fā)現(xiàn)CD9蛋白水平和mRNA水平顯著增高是通過活化CXCR4實現(xiàn)的。采用SDF-1預處理的BMSC與C2C12細胞共培養(yǎng)，顯示有更多的混合肌管產(chǎn)生，從而證實SDF-1是通過以CXCR4依賴性的方式上調(diào)CD9的表達，從而誘導BMSC的遷移并促進成肌分化。在骨骼肌再生過程中，Pax3和Pax7是成肌分化中的關(guān)鍵基因，而Pax3作為胚胎肌源性程序的主要調(diào)節(jié)者，它的活化可抑制BMSC的成脂，成骨，成軟骨分化，但卻可促進BMSC成肌分化[50]。

Beier等[51]將BMSC與成肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)肌細胞增強因子2顯著上調(diào)，當堿性成纖維細胞生長因子和地塞米松加入培養(yǎng)基時，顯示更多的混合肌管生成。Witt等[52]發(fā)現(xiàn)將BMSC與成肌細胞共培養(yǎng)之后加入胰島素樣生長因子1和低氧誘導因子能夠促進BMSC成肌分化，并表達結(jié)蛋白，肌細胞增強因子2、平滑肌肌動蛋白α及肌球蛋白重鏈2。

五、結(jié)論

BMSC的多向分化潛能使其在組織工程領(lǐng)域得到重視。大量研究已證實BMSC在損傷的骨骼肌修復與再生中的優(yōu)勢，但局部移植的BMSC歸巢與存活率低仍是當前應用的最大障礙。肌肉再生是一個復雜的生物學過程，并且BMSC向骨骼肌分化的機制還不是完全清晰，未來不僅需要更多的實驗以探索BMSC成肌分化的相關(guān)機制，還需要更多的臨床研究證實BMSC在人體骨骼肌修復與再生的效果。