張金梅 楊遠(yuǎn)榮

作者單位：434020 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院藥學(xué)部

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一種能自我更新和增殖的多能干細(xì)胞，可分化為各種類型的神經(jīng)細(xì)胞，即神經(jīng)元[1]。1992年，NSCs最先從紋狀體組織和小鼠腦組織中分離出來。隨后人們對NSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布、發(fā)育及壽命、特性和潛能的認(rèn)識取得了重大進(jìn)展[2]。NSCs可從原代培養(yǎng)的皮層或在有絲分裂生長因子如表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子存在的條件下從傳代培養(yǎng)的海馬中分離得到。有絲分裂生長因子對NSCs的增殖很重要，并能維持其未分化狀態(tài)。多種信號的協(xié)同作用使胚胎NSCs在成熟大腦中形成許多各種各樣的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[2]。特異性轉(zhuǎn)錄因子在NSCs分化為神經(jīng)元時(shí)起重要作用。除了向嗅球提供神經(jīng)元外，NSCs對海馬的可塑性也很重要[3]。此外，在動物模型和人體試驗(yàn)中，由于NSCs的激活或被移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)可導(dǎo)致再生，因此其臨床應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。

一、磷脂酶D （phospholipase D，PLD）的結(jié)構(gòu)

PLD是一種廣泛存在的酶，水解磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC），產(chǎn)生磷脂酸和游離膽堿。在乙醇和1-丁醇等伯醇存在時(shí)，PLD優(yōu)先催化轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，而不是水解反應(yīng)，后者產(chǎn)生磷脂酰醇，而不是磷脂酸（phosphatidic acid，PA）[4]。PLD兩個(gè)主要的同工酶PLD1和PLD2在哺乳動物細(xì)胞中已被鑒定[5]。PLD1是一種表觀分子量為120 kDa、含有1 074個(gè)氨基酸的蛋白，含有2個(gè)HKD模體（HxKxxxxD序列、組氨酸“H”、任意氨基酸“x”、賴氨酸“K”和天冬氨酸“D”），這在體外和體內(nèi)都是酶促催化反應(yīng)的關(guān)鍵。PLD同工酶的其它高度保守結(jié)構(gòu)域還包括phox（PX）、結(jié)構(gòu)域PH和PI4、5P2結(jié)合域。5P2結(jié)合域是小GTPase ARF激活PLD1所必需的[4]。PX結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用，或者優(yōu)先與PI3,4,5P3結(jié)合[6]。PLD1還有一個(gè)保守的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，這個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域參與PLD1的自動抑制，刪除它后PLD1的基礎(chǔ)活性升高。

二、PLD1的功能

研究證明，PLD1參與炎癥、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)代謝及神經(jīng)發(fā)育等多種細(xì)胞機(jī)制[7-9]。PLD1已成為許多疾病如傳染病、癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的藥物作用靶點(diǎn)[8,10]。PLD1分布在整個(gè)細(xì)胞中，特別是在細(xì)胞核周圍、高爾基復(fù)合體和未受刺激細(xì)胞的早期內(nèi)涵體中。受到刺激后PLD1會重新分布到質(zhì)膜上。PLD1表達(dá)的增加、它的亞細(xì)胞定位和催化活性的改變對神經(jīng)元的增殖、分化、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞骨架的重排具有重要作用[11-12]。PLD1在功能各異的腦區(qū)表達(dá)，包括大腦皮層、海馬、腦干、脊髓和嗅球。最近的研究表明，PLD1的信號依賴性激活對NSCs的神經(jīng)元分化具有重要意義[13-14]。

三、PLD1促進(jìn)NSCs形成神經(jīng)元的作用機(jī)制

（一）轉(zhuǎn)錄激活因子3（activators of transcription 3，STAT3）信號通路

研究已證實(shí)，STAT3能促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs形成神經(jīng)元[14-15]。STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)。而且，STAT3與DNA的結(jié)合受ser727或（和） Tyr 705位點(diǎn)磷酸化的影響。STAT3與CBP/ p300和STAT/ p300/ Smad復(fù)合物的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合，作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性GFAP啟動子中的STAT結(jié)合元件，在誘導(dǎo)NSCs星形膠質(zhì)細(xì)胞分化方面尤其有效。含Sh2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶-1（shp-1）通過STAT3（Tyr705）的直接去磷酸化而對STAT3信號進(jìn)行負(fù)調(diào)控。重要的是，這種依賴于shp-1的STAT3抑制機(jī)制與NSCs中PLD1指導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞形成密切相關(guān)。PLD衍生的PA與shp-1相互作用并抑制其活性。外源性地添加PA可誘導(dǎo)NSCs中shp-1磷酸化和STAT3（Tyr 705）的去磷酸化。而且PLD1基因敲除可抑制shp-1的活性，影響STAT3（Tyr 705）的去磷酸化。因此，PLD1通過控制NSCs中shp-1/ STAT3的激活而促進(jìn)神經(jīng)元形成，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

（二）抗凋亡蛋白Bcl-2信號途徑

抗凋亡蛋白Bcl-2是細(xì)胞凋亡信號通路中重要的調(diào)控因子，抑制細(xì)胞死亡[16]。Bcl-2家族蛋白影響神經(jīng)細(xì)胞的分化和凋亡，在Bcl-2缺陷的胚胎中，神經(jīng)元突起延伸的能力下降[17]。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，Bcl-2對神經(jīng)元的譜系分化至關(guān)重要[18]。而且，修飾抗凋亡基因可促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞和NSCs的神經(jīng)元分化[19]。

研究表明，Bcl-2與PLD1介導(dǎo)的神經(jīng)元分化有關(guān)。PLD1在多種細(xì)胞中調(diào)控Bcl-2的表達(dá)[20-21]。例如，PLD1通過c-Jun氨基末端激酶/ STAT3信號通路調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)，從而導(dǎo)致H19-7細(xì)胞的神經(jīng)元分化[17]。另有研究報(bào)告，PLD1可增加Bcl- 2的表達(dá)量并促進(jìn)NSCs中Bcl-2介導(dǎo)的信號傳遞[13]。這些結(jié)果表明PLD1通過調(diào)控Bcl-2的表達(dá)而影響NSCs的神經(jīng)分化。

四、PLD1在NSCs向神經(jīng)分化中的作用

神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PLD1表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)元分化[22]。PLD1也參與堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)H19-7細(xì)胞的突起生長[17]。PLD1還可糾正家族性阿茲海默癥患者變異神經(jīng)元中受損神經(jīng)突起的生長能力[23]。Yoon等[24]首次報(bào)道PLD1是NSCs向神經(jīng)元分化中突起生長所必需的調(diào)節(jié)分子。

（一）PLD1在神經(jīng)命運(yùn)決定中的作用

在大腦發(fā)育過程中，每個(gè)神經(jīng)元都發(fā)育成一個(gè)軸突和多個(gè)神經(jīng)突起，最終形成突觸[25-26]。為了確保神經(jīng)元的精確連接，神經(jīng)元是由多個(gè)步驟發(fā)育而成，其中包括軸突的生長及分支、引導(dǎo)和突觸形成[26]。細(xì)胞骨架重排是神經(jīng)形態(tài)形成的動力學(xué)支持。在Rho家族蛋白的GTPase中，其成員RhoA、Cdc42和Rac1是典型的細(xì)胞骨架重排的重要調(diào)節(jié)因子。Rho家族GTPase作為一個(gè)分子開關(guān)，從不活躍的5'-二磷酸鳥苷結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為活躍的5'-三磷酸鳥苷結(jié)合狀態(tài)。一旦被激活，它們就可以與特定的效應(yīng)分子相互作用。RhoA、Rac1和Cdc42在樹突發(fā)育中起核心作用。在發(fā)育的大腦皮層中，與Rho相關(guān)的GTPase的差異激活有助于形態(tài)多樣性的產(chǎn)生。Rac1和Cdc42促進(jìn)神經(jīng)突起的形成和生長。相反，RhoA的激活抑制神經(jīng)突起的形成并引起神經(jīng)細(xì)胞收縮。因此，Rho家族GTPase的調(diào)控對于指導(dǎo)下游生物反應(yīng)如軸突生長以及神經(jīng)元發(fā)育過程中的突觸成熟至關(guān)重要。

Rho家族GTPase是PLD活性的重要調(diào)節(jié)者，尤其是PLD1的活性是與Rho家族的GTPase相互作用來調(diào)節(jié)[27]。轉(zhuǎn)染RhoA、Cdc42或者Rac1能激活PLD1[28]，PLD1與肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控有關(guān)[27]。通過這一機(jī)制，PLD1能調(diào)控許多生理功能如細(xì)胞遷移和神經(jīng)元軸突的形成。在NSCs的神經(jīng)元分化期間，Cdc42和RhoA的表達(dá)水平上升，PLD1和Cdc42位于神經(jīng)突起中，而RhoA位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中[28]。Cdc42與PLD1結(jié)合，形成無活性的Cdc42N17，PLD1活性受阻，神經(jīng)突起生長。

（二）PLD1在神經(jīng)分化、成熟中的作用

神經(jīng)系統(tǒng)的形成和發(fā)育經(jīng)過一系列組織有序的NSCs增殖過程，其遷移距離相當(dāng)遠(yuǎn)，最終分化成數(shù)十億的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成大腦[29]。在此過程中，Ca2+信號對大腦的發(fā)育非常重要[30]。Ca2+水平的上升可調(diào)節(jié)PKCα的活性和從基質(zhì)到細(xì)胞膜的易位[31]。在多個(gè)細(xì)胞系和原代細(xì)胞中，PKCα調(diào)節(jié)Ca2+依賴性分化，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平后可在突觸可塑性中發(fā)揮重要作[13,32]。PLD催化PC水解成PA和膽堿。PA本身作為細(xì)胞內(nèi)信使或由PA磷酸水解酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二酰基甘油，這對C激酶的激活十分重要[33]。PLD1的激活和磷酸化是由C激酶調(diào)節(jié)的，PLD和C激酶亞型在多種細(xì)胞類型中也有這種類似的關(guān)系[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加影響NSCs中PKCα的激活和軸突生長[13-14]。此外，PKCα特異性抑制劑在NSCs的分化中可降低PLD1的活性,影響PLD1信號強(qiáng)度[13-14]。再者，細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過與海馬鈣蛋白（hippocalcin，HPCA）形成復(fù)合物，使PKCα轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞形成。于是，NSCs中PKCα通過與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1直接結(jié)合而被激活。PKCα的上游信號PLD1引起神經(jīng)突起生長[14]。

另一個(gè)重要的Ca2+信號因子-磷脂酶C（PLCγ），在多種細(xì)胞中也影響PLD1信號[13,17]。當(dāng)用某些生長因子處理時(shí)，PLCγ被磷酸化并產(chǎn)生二?；视秃?1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），從而激活PKCα，增加胞內(nèi)Ca2+[34]。研究表明，PLCγ信號通路可提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)節(jié)新皮層神經(jīng)元祖細(xì)胞遷移和神經(jīng)分化[13,35]。此外，在NSCs向神經(jīng)元的分化期間采用特異性抑制劑抑制PLCγ，可減少PKCα的磷酸化和激活[13]。以上結(jié)果表明，PLD1參與了細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號分子包括PLCγ、PKCα對NSCs的神經(jīng)分化調(diào)節(jié)作用。

HPCA是一種高親和力的鈣結(jié)合蛋白，這僅限于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞最豐富的部位。在大腦發(fā)育過程中，HPCA的表達(dá)急劇增加，同時(shí)伴隨突觸的形成。HPCA屬于神經(jīng)元Ca2+傳感器蛋白家族，該蛋白具有一個(gè)CA2+/肉豆蔻?；_關(guān)，可使其在細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加時(shí)易位到細(xì)胞膜上[14]。HPCA也受Ca2+介導(dǎo)的PLD1信號通路的調(diào)控[14]。在NSCs的神經(jīng)分化中神經(jīng)生長因子如NT-3、NT-45和BDNF的表達(dá)依賴于Ca2+的結(jié)合和HPCA的肉豆蔻?；痆14]。HPCA直接與PKCα結(jié)合可促進(jìn)PKCα調(diào)節(jié)的激酶級聯(lián)反應(yīng)；PKCα依賴的PLD1的激活是神經(jīng)突起生長所必需的。并且，PLD1和HPCA甚至在胚胎14 d時(shí)在大鼠大腦皮層同時(shí)出現(xiàn)，HPCA依賴的PLD1激活是NSCs向神經(jīng)元分化的必要條件。它們的協(xié)同作用對NSCs的神經(jīng)形成有深刻的影響[14]。

PLD1在細(xì)胞生長、存活、分化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞骨架組織等多種功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PLD1在NSCs向神經(jīng)的分化中也起關(guān)鍵調(diào)控作用。PLD1參與多種信號通路包括Rho家族GTP酶和Ca2+信號等的調(diào)節(jié)，影響軸突生長、突觸發(fā)育及其可塑性。因此，PLD1是NSCs向神經(jīng)元分化的重要調(diào)節(jié)者。研究PLD1對NSCs向神經(jīng)分化中的調(diào)控作用，對深入研究NSCs的分化和神經(jīng)元的再生有重要的指導(dǎo)意義，并有望用于修復(fù)受損的神經(jīng)元，因此具有一定的臨床價(jià)值。