宋玲玲,董曉娟,苗鐵錚

（延安大學(xué) 創(chuàng)新學(xué)院,陜西 西安 710100）

前 言

小花玄參是一種原產(chǎn)于中國(guó)四川、青海、甘肅的草本植物，具有與同科同屬如玄參相似的化學(xué)成分，因此應(yīng)該也有類似的藥用價(jià)值。小花玄參分布極廣，資源豐富，尚未被開發(fā)利用，具有較高的經(jīng)濟(jì)發(fā)展?jié)摿1]。總黃酮是中藥特別是解熱鎮(zhèn)痛類中藥的重要成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)其具有消炎、抑菌、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)腦缺氧缺血等作用[2]。研究總黃酮提取工藝及化學(xué)成分具有重要意義。但目前有關(guān)于小花玄參的研究較少，本次研究嘗試測(cè)定小花玄參化學(xué)成分，測(cè)定總黃酮含量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采集自然野生比較成熟的小花玄參，經(jīng)鑒定后自然晾曬干重量500g左右。

1.2 儀器與試劑

精密電子天平、各種速度的離心機(jī)、標(biāo)準(zhǔn)篩、高速粉碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋、超聲波清洗機(jī)。紫外線可見分光光度計(jì)、高壓液相色譜儀、色譜數(shù)據(jù)工作站、Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理工作站，SIMCA-P13.0數(shù)據(jù)處理軟件等。試劑：乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、蘆丁對(duì)照品、二苯乙烯苷、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，亞硝酸鈉，氫氧化鈉溶液，硝酸鋁等。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

清水清洗，去泥，恒溫干燥箱30℃至恒重，粉碎，攪拌，烘箱中60℃烘干至恒重，或采用超聲粉碎機(jī)直接粉碎，獲得粉末，過(guò)4號(hào)篩。

1.3.2 提取工藝

進(jìn)行交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，取粉末每份100g,分別采用超聲提取法、連續(xù)回流法、冷浸法提取，結(jié)果顯示提取率分別為0.9%、1.1%、0.7%、0.53%。故首選連續(xù)回流法提取，以提高提取率。而后進(jìn)行針對(duì)溶劑類型（甲醇、乙醇、丙酮）、濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、 回 流 時(shí) 間（30min、60min、90min、120min、150min）、回流次數(shù)（1、2、3 次）、水溫（60℃、70℃、80℃、90℃）五個(gè)變動(dòng)參數(shù)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。獲得濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收，加入離子水，冷凍除渣，重復(fù)2次，乙醚萃取，水層濃縮干燥，精密稱量初提物，共進(jìn)行了28次正交試驗(yàn)。試驗(yàn)后，進(jìn)行變量分析，結(jié)果顯示最佳的提取方式為：70%甲醇為溶劑，回流時(shí)間120min，回流2次，提取溫度80℃，紫外線可見分光光度計(jì)結(jié)果顯示510nm達(dá)到最大的吸光度。提取液作為總黃酮的監(jiān)測(cè)。同時(shí)采用乙醇提取液、石油醚提取液，前者作為強(qiáng)心苷的監(jiān)測(cè)，后者用于甾體類、三萜類物質(zhì)的檢測(cè)。

1.3.3 各類成分

各類成分的檢測(cè)定性分析采用配置手冊(cè)[3,4]。

1.3.4 檢測(cè)

（1）總黃酮含量的：①取過(guò)篩的粉末，70%甲醇為溶劑，回流時(shí)間120min，回流2次，提取溫度80℃，回收溶劑，干燥后70%乙醇溶解作為供試液；②以干燥恒重2mg蘆丁對(duì)照品＋70%乙醇制得0.1mg/mL溶液；③分別取3mL對(duì)照品溶液、供試品溶液，依次加入0.3mL的5%亞硝酸鈉、0.3mL的10%硝酸鋁、4mL的氫氧化鈉溶液，每次搖勻后靜置6min，然后再添加下一種試劑，添加70%乙醇稀釋至10mL刻度，搖勻，靜置15min，在400～720nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)；④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確稱取對(duì)照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，同法操作，在510nm長(zhǎng)度下測(cè)定吸光度，以橫坐標(biāo)數(shù)字為濃度c，以吸光度A作為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程；⑤最后進(jìn)行精密度、回收率、穩(wěn)定性試驗(yàn)，精密度實(shí)驗(yàn)采用同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示精密度、穩(wěn)定性相對(duì)保留時(shí)間 RSD（%）分別為 0.126、1.05，均小于 3%，說(shuō)明儀器的精密度符合要求，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗(yàn)，相對(duì)保留時(shí)間RSD（%）均小于3%，說(shuō)明穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好。總黃酮含量=[（c×V×N）×10-3/m]×100%，其中c為比色管測(cè)定溶液中的總黃酮濃度（g/L），V為比色管測(cè)定溶液體積（mL）,N為稀釋倍數(shù)，m為小花玄參粉末的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

對(duì)照品濃度c與吸光度A存在線性關(guān)系，A=2.264c-0.025，r=0.984，線性范圍 0.020～0.15mg/mL，呈現(xiàn)高度線性相關(guān)。而后進(jìn)行6次重復(fù)檢驗(yàn)，總黃酮含量分別為5.904%、5.587%、5.830%、5.714%、5.671%、5.518%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差2.510%，RSD%=2.46%＜3%，精密度良好。留置24h，隨機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示吸光度RSD%=0.884%，提示總黃酮在供試品中的含量非常穩(wěn)定，吸光度穩(wěn)定。重復(fù)性檢測(cè)RSD%=1.16%，重現(xiàn)性檢驗(yàn)效果較好。平均回收率為99.99%，回收率較高。

表1 總黃酮對(duì)照品濃度c與吸光度A線性分析Table 1 The linear analysis of concentration （c） and absorbance（A）of total flavonoids reference substance

對(duì)于得到的分離液體，試驗(yàn)顯示樣本中分離的化合物包括三萜類、甾體、揮發(fā)油物質(zhì)，進(jìn)行進(jìn)一步分析，包括熔點(diǎn)、波譜解析，確認(rèn)了一種物質(zhì)—烏蘇酸。對(duì)于獲得的黃酮類物質(zhì)，干燥后為淡黃色、灰白色混合針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)111～163℃。

3結(jié) 論

本次研究嘗試構(gòu)建了小花玄參總黃酮物質(zhì)提取的方法，結(jié)果顯示最佳的提取條件為70%甲醇為溶劑，回流時(shí)間120min，回流2次，提取溫度80℃。最終提取的物質(zhì)，再根據(jù)對(duì)照品，進(jìn)行總黃酮的檢測(cè)，便能夠測(cè)出小花玄參的含量。

對(duì)小花玄參進(jìn)行了化學(xué)成分的定性、總黃酮含量分析，總黃酮濃度c與吸光度A存在線性關(guān)系，A=2.264c-0.025，r=0.984，線性范圍 0.020～0.15mg/mL，精密度、穩(wěn)定性相對(duì)保留時(shí)間RSD（%）分別為2.46%、1.16%，回收率99.99%,具有一定的參考價(jià)值，初步鑒定出烏蘇酸，后續(xù)需要分析其他物質(zhì)的含量。

［1］ 包錦淵,盧群林,溫馨,等．小花玄參中微量金屬元素分析［J］．分子科學(xué)學(xué)報(bào),2014,30（4）:299～303．

［2］ 包錦淵,李軍喬．響應(yīng)面法優(yōu)化小花玄參總皂苷提取工藝研究［J］．食品科技,2015,40（11）:213～220．

［3］ 宣偉．黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)林副特產(chǎn),2017（1）:66～69．

［4］ 吳立軍．天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］北京:人民衛(wèi)生出版社,2011．