劉思含，耿德勤，吳明鳳，劉芷含

雙環(huán)己酮草酰二腙(CPZ)誘導(dǎo)的脫髓鞘動(dòng)物模型是CNS脫髓鞘疾病常見的研究模型之一。拉喹莫德(LAQ)是一種新型的免疫調(diào)節(jié)藥物，近年來(lái)它被建議作為多發(fā)性硬化治療的口服制劑。過(guò)去動(dòng)物研究表明，它有抗炎、抑制抗原表達(dá)的基因等作用，但目前拉喹莫德作用機(jī)制尚未充分理解。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，拉喹莫德能減輕實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)及CPZ造模小鼠胼胝體區(qū)髓鞘脫失癥狀，但目前它保護(hù)神經(jīng)功能的機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)應(yīng)用拉喹莫德，觀察其對(duì)CPZ誘導(dǎo)的CNS脫髓鞘小鼠胼胝體區(qū)髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及其分泌的TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響，以探討LAQ對(duì)髓鞘保護(hù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 80只健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量23～25 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(20只)、CPZ模型組(40只)及LAQ處理組(20只)。

1.1.2 主要試劑和儀器 CPZ(美國(guó)Sigma公司)；LAQ (ABR-215062)；羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠抗MBP(美國(guó)Abcam公司)；雞抗GFAP(美國(guó)Abcam公司)；IL-1β 小鼠ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司)；TNF alpha小鼠ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam 公司)；冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；正置顯微鏡(日本Olympus BX60)。

1.2 方法

1.2.1 CPZ模型及藥物干預(yù)方法 將CPZ摻入正常飼料組成0.3%的混合粉末。正常組給予正常飼料喂養(yǎng)，CPZ組給予喂養(yǎng)含有0.3% CPZ混合飼料，LAQ處理組喂食0.3% CPZ混合飼料同時(shí)給予LAQ灌胃(25 mg/kg)，每日1次，共8周。

1.2.2 MBP及GFAP免疫熒光檢測(cè) 采用免疫熒光法檢測(cè)腦組織MBP及GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分布。制備小鼠脫髓鞘后, 將CPZ組各時(shí)間點(diǎn)(0 d, 3 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)小鼠(均隨機(jī)取3只)經(jīng)10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟。經(jīng)左心室快生理鹽水沖洗，4 ℃多聚甲醛灌注、固定24 h。常規(guī)冰凍切片包埋劑(OCT)包埋后，在冰凍切片機(jī)上行連續(xù)冠狀面切片(片厚20 μm)，選取小鼠前囟前后胼胝體部位，進(jìn)行MBP和GFAP雙重染色，并行DAPI熒光染色后置于正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 MBP及GFAP蛋白水平的檢測(cè) 采用免疫印跡法檢測(cè)小鼠胼胝體區(qū)的MBP及GFAP蛋白的水平。每組于各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只小鼠，深麻醉后迅速處死，快速剝離腦組織，冰上操作去除皮質(zhì)只保留胼胝體組織；取新鮮胼胝體組織300 mg。加入蛋白裂解液(RIPA裂解緩沖液)，勻漿，12 000 r/min離心30 min，分離上清。利用二辛可酸(BCA)法蛋白定量加入等體積的5×SDS buffer，99 ℃煮沸10 min變性，-80 ℃保存?？偟鞍咨蠘?；經(jīng)過(guò)SDS-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、硝酸纖維素膜(NC)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，加入一抗或β-actin抗體4 ℃抗體過(guò)夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h；洗膜，采用Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)拍照，利用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，計(jì)算MBP及GFAP蛋白條帶總灰度與β-actin蛋白條帶總灰度的比值作為MBP和GFAP蛋白相對(duì)水平。

1.2.4 TNF-α、IL-1β含量的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胼胝體，用冰生理鹽水在冰浴下制成20%的混懸液。4 ℃ 4000 r/min 離心15 min，取上清液于-20 ℃冰箱待測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)受試小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)腦胼胝體中TNF-α、IL-1β蛋白含量，具體操作步驟嚴(yán)格按TNF-α、IL-1β定量ELISA說(shuō)明書。

2 結(jié) 果

2.1 CPZ組小鼠腦組織胼胝體區(qū)MBP及GFAP染色情況 見圖1。給予CPZ口服藥物后立即處死小鼠觀察發(fā)現(xiàn)胼胝體區(qū)MBP分布均勻，呈絲網(wǎng)狀(圖1A)；其中散在稀疏且形態(tài)纖細(xì)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(圖1B)。造模3 d后，MBP陽(yáng)性細(xì)胞分布較前減少(圖1E)，GFAP細(xì)胞體增生，總體細(xì)胞形態(tài)稍肥大(圖1F)。脫髓鞘7 d后，MBP陽(yáng)性細(xì)胞分布減少(圖1I)，GFAP數(shù)量顯著增多，著色深，胞體腫脹，突起增多且長(zhǎng)(圖1J)；脫髓鞘2周后，MBP陽(yáng)性細(xì)胞分布稀疏而短小(圖1M)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞體腫大，突起顯著增長(zhǎng)，分布密集(圖1N)。脫髓鞘4周后，MBP陽(yáng)性細(xì)胞著色淺，呈散在分布(圖1Q)；GFAP陽(yáng)性細(xì)胞密度增加、胞體腫脹且突起增多，病灶邊緣處增生更明顯(圖1R)。脫髓鞘8周后MBP分布稍增多(圖1U)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)肥大、突起交錯(cuò)，已形成膠質(zhì)瘢痕(圖1V)。

2.2 各組小鼠腦組織胼胝體區(qū)MBP和GFAP蛋白的比較 見圖2、表1。正常組小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)未有髓鞘堿性蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的顯著改變。與CPZ組比較，LAQ組在4周、8周時(shí)MBP表達(dá)量增多(均P<0.05)；GFAP于7 d、2周、4周和8周表達(dá)量顯著減少(均P<0.05)。

2.3 各組小鼠腦組織胼胝體區(qū)TNF-α及IL-1β含量的比較 見表2。CPZ組和LAQ組的兩種炎癥因子表達(dá)均高于正常組(均P<0.05)。與CPZ組相比，LAQ組TNF-α及IL-1β表達(dá)隨著時(shí)間的增加而逐漸下降，于2周、4周和8周蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1CPZ組胼胝體區(qū)MBP和GFAP表達(dá)MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為紅色絮狀物，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為綠色條索樣物，細(xì)胞核為藍(lán)色顆粒；V圖箭頭指向CPZ組8周出現(xiàn)的膠質(zhì)瘢痕(免疫熒光染色，×400)

圖2 CPZ組和LAQ組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MBP及GFAP蛋白的表達(dá)。A：CPZ組；B：LAQ組

表2 各組小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)胼胝體區(qū)TNF?α及IL?1β表達(dá)的比較(x±s)組別指標(biāo)(pg/ml)0d7d2周4周8周正常組msTNF?α97．52±18．2598．12±1．26101．20±19．31100．53±7．92105．83±7．20CPZ組msTNF?α100．32±19．29127．12±3．50142．30±12．64162．16±19．43187．39±20．11LAQ組msTNF?α93．19±18．23122．19±9．23#130．92±29．12?#141．45±19．43?#159．39±19．21?#正常組msIL?1β93．74±20．4197．10±13．63#93．72±1．34#102．32±20．30#103．83±12．34#CPZ組msIL?1β94．28±27．52140．21±15．34#153．52±3．25#183．23±3．23#228．74±19．64#LAQ組msIL?1β93．02±21．95130．46±19．54#139．67±1．56?#148．40±2．89?#160．13±21．34?# 注：與CPZ組比較?P<005，與正常組相比較#P<005

3 討 論

多發(fā)性硬化是一種CNS自身免疫系統(tǒng)疾病[3]。它的病理機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是髓鞘脫失、軸索變性、炎癥浸潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞增生填充組織缺損區(qū)域形成硬化斑有關(guān)[4]。近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在白質(zhì)脫髓鞘的作用越來(lái)越受到重視。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架和特異性標(biāo)記物被廣泛研究。曾有研究[5]發(fā)現(xiàn)，0.2% CPZ混合飼料喂食6周恢復(fù)正常飲食后，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以減輕髓鞘脫失的損害。然而，另一些學(xué)者[6]認(rèn)為慢性脫髓鞘疾病中活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以激活核因子-kB通路，產(chǎn)生和釋放TNF-α、IL-17等細(xì)胞炎性因子，最終生成神經(jīng)毒性物質(zhì)如一氧化氮，抑制了髓鞘的再生[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用CPZ脫髓鞘動(dòng)物模型后發(fā)現(xiàn)新型免疫調(diào)節(jié)劑LAQ對(duì)小鼠胼胝體區(qū)域少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其炎性因子的分泌存在一定的作用。以往實(shí)驗(yàn)采用EAE模型模擬CNS脫髓鞘的病理狀態(tài)，但相比EAE模型，CPZ作為一種選擇性銅離子螯合劑，可以穩(wěn)定的誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致髓鞘的瓦解。因而，它更有利于開展脫髓鞘和髓鞘再生修復(fù)的研究[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠喂食CPZ混合飼料后胼胝體區(qū)MBP標(biāo)記的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，分布稀疏且松散，并于4周降至最低，8周時(shí)可見少許髓鞘再生；以上結(jié)果均表明了CPZ模型建立成功。然而隨著脫髓鞘時(shí)間的延長(zhǎng)，胼胝體區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增殖、活化，胞體腫脹，突起粗大、卷曲，填補(bǔ)缺損，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量于4周時(shí)增至峰值，8周稍降低。隨后本研究又采用了免疫印跡法分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MBP及GFAP蛋白的動(dòng)態(tài)水平，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢(shì)與免疫熒光結(jié)果一致。綜上所述，本研究認(rèn)為CPZ導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、活化有關(guān)。

已有臨床實(shí)驗(yàn)[10-11]證明，LAQ作為一種口服新型試驗(yàn)性免疫調(diào)節(jié)藥物對(duì)復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(RRMS)有抗炎和神經(jīng)保護(hù)性能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[12]顯示它可以使Th1(T輔助Ⅰ細(xì)胞，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子)向Th2(T輔助Ⅱ細(xì)胞，產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子)的具有抗炎性特征的轉(zhuǎn)化。另一實(shí)驗(yàn)[13]證明，EAE模型小鼠服用LAQ后脊髓損害部位脫髓鞘程度顯著降低，從而保護(hù)了脊髓軸突和神經(jīng)元的功能。然而，目前尚未有明確結(jié)論解釋LAQ保護(hù)髓鞘的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)LAQ治療CPZ脫髓鞘小鼠后髓鞘標(biāo)記物MBP蛋白表達(dá)量于4周、8周顯著升高，而GFAP蛋白表達(dá)量于7 d、2周、4周及8周顯著降低；提示了LAQ可能通過(guò)抑制了活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了脫髓鞘模型后期髓鞘修復(fù)及再生的過(guò)程。

為了進(jìn)一步探討拉喹莫德保護(hù)髓鞘的機(jī)制，本研究在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 d，7 d，2周，4周，8周)采用ELISA技術(shù)檢測(cè)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎性因子IL-1β和TNF-α的動(dòng)態(tài)改變。Sugama等[14]認(rèn)為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放IL-1β從而啟動(dòng)腦內(nèi)免疫過(guò)程。解迪等[15]證明了膿毒癥新生幼鼠腦胼胝體內(nèi)的IL-1β與IL-1R1相互作用抑制ERK通道的激活導(dǎo)致少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟障礙，最終導(dǎo)致軸突低髓鞘化。TNF-α也是參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞之一[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[17]證實(shí)了TNF-α可通過(guò)少突膠質(zhì)細(xì)胞的TNF/p55TNF信號(hào)通路導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。以上均提示IL-1β和TNF-α可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAQ組IL-1β和TNF-α表達(dá)逐漸降低，相比CPZ組于2周、4周、8周有顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LAQ可以減輕CPZ介導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及其分泌的炎癥因子的表達(dá)有關(guān)；從而達(dá)到保護(hù)髓鞘和神經(jīng)系統(tǒng)的功能。

[1] Wegner C, Stadelmann C, Pf?rtner R, et al. Laquinimod interferes with migratory capacity of T cells and reduces IL-17 levels, inflammatory demyelination and acute axonal damage in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2010, 227: 133.

[2] Brück W, Pf?rtner R, Pham T, et al. Reduced astrocytic NF-κB activation by laquinimod protects from cuprizone-induced demyelination[J]. Acta Neuropathol, 2012, 124: 411.

[3] Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis[J]. Semin Neurol, 2016，36: 115.

[4] Popescu BF, Pirko I, Lucchinetti CF. Pathology of multiple sclerosis: where do we stand?[J]. Continuum (Minneap Minn), 2013, 19: 901.

[5] 宋大為，范凱，張艷麗，等．星形膠質(zhì)細(xì)胞在cuprizone介導(dǎo)的急性脫髓動(dòng)物模型中的變化及其意義[J]．中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2007，25：540.

[6] Raasch J, Zeller N, Van Loo G, et al. IkappaB kinase 2 determines oligodendrocyte loss by non-cell-autonomous activation of NF-kappaB in the central nervous system[J]. Brain, 2011, 134: 1184.

[7] Smith KJ, Kapoor R, Felts PA. Demyelination: the role of reactive Oxygen and Nitrogen species[J]. Brain Pathol, 1999, 9: 69.

[8] Matsushima GK, Morell P. The neurotoxicant, cuprizone,as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system[J]. Brain Pathol, 2001,11: 107.

[9] Ransohoff RM. Animal models of multiple sclerosis: the good, the bad and the Bottom line[J]. Nat Neurosci, 2012, 15: 1074.

[10] 周官恩，安中平．多發(fā)性硬化口服藥物研究新進(jìn)展[J]．中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2012，12：147.

[11] Moore S, Khalaj AJ, Yoon J, et al. Therapeutic laquinimod treatment decreases inflammation, initiates axon remyelination, and improves motor deficit in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Brain Behav, 2013, 3: 664.

[12] Brunmark C, Runstr?m A, Ohlsson L, et al. The new orally active immunoregulator laquinimod (ABR-215062) effectively inhibits development and relapses of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2002, 130: 163.

[13] Yang JS, Xu LY, Xiao BG, et al. Laquinimod (ABR-215062) suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis, modulates the Th1/Th2 balance and induces the Th3 cytokine TGF-beta in Lewis rats[J]. J Neuroimmunol, 2004, 156: 3.

[14] Sugama S, Takenouchi T, Sekiyama K, et al. Immunological responses of astroglia in the rat brain under acute stress: interleukin 1 beta co-localized in astroglia[J]. Neuroscience, 2011, 192: 429.

[15] 解迪，曾紅科，陳純波，等．IL-1β對(duì)膿毒癥新生幼鼠胼胝體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志，2015，31：385.

[16] Edwards MM, Robinson SR. TNF alpha affects the expression of GFAP and S100B: implications for Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 2006, 113: 1709.

[17] Akassoglou K, Bauer J, Kassiotis G, et al. Oligodendrocyte apoptosis and primary demyelination induced by local TNF/p55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: models for multiple sclerosis with primary oligodendrogliopathy[J]. Am J Pathol, 1998, 153: 801.