榮 斌，原 野，吳純啟，李曉旭，王全軍*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650504；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒物藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家北京藥物安全評價研究中心，北京 100039）

嵌合抗原受體（CAR，Chimeric antigen receptor）-T細(xì)胞免疫療法是一種腫瘤過繼細(xì)胞免疫療法，基本原理是利用基因工程修飾T淋巴細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體，以非MHC（major histocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體）限制性的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR的優(yōu)點(diǎn)在于能非MHC依賴性識別腫瘤蛋白質(zhì)和脂類抗原，不需要經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC），目前已經(jīng)發(fā)展到第四代，早期主要用于治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL），慢性淋巴細(xì)胞性白血病和B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤[2]，近年來也用于治療實(shí)體瘤、HIV等。雖然CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中取得了顯著的效果，但同時也出現(xiàn)了諸多安全性問題，包括細(xì)胞因子釋放綜合征、腫瘤溶解綜合征、神經(jīng)毒性和脫靶效應(yīng)等[3]。

1 CAR-T細(xì)胞免疫療法及原理

1.1 CAR-T設(shè)計原理

正常T細(xì)胞的活化有賴于雙信號：第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物（p-MHC）啟動；第二信號由T細(xì)胞和APC間共刺激分子的相互作用啟動（即B7/CD28協(xié)同刺激信號）[4]。而CAR-T細(xì)胞技術(shù)的設(shè)計原理是使T細(xì)胞不需要依賴MHC分子和APC，將識別腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的單鏈抗體（scFv）、跨膜的共刺激結(jié)構(gòu)域（如CD28和CD4-1BB）和T細(xì)胞的活化基序結(jié)合為一體，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞通過表達(dá)單鏈抗體增強(qiáng)結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力，同時激活T細(xì)胞，使其增殖并激活其細(xì)胞毒活性，使其能特異性地識別和殺傷腫瘤細(xì)胞[5]。

1.2 CAR結(jié)構(gòu)

CAR基本結(jié)構(gòu)（即第一代CAR結(jié)構(gòu)）包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是由單克隆抗體的重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合區(qū)組成的單鏈可變片段（scFv），能夠識別特定的腫瘤抗原；跨膜結(jié)構(gòu)域有CD4、CD7、CD8、CD28 和 CD3ζ等蛋白分子；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)門細(xì)胞受體TCR/CD3ζ鏈或免疫球蛋白Fc 受體FcεRIγ鏈，含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[6]。

隨后的CAR大多遵循相同的結(jié)構(gòu)模式，第1代CAR在胞內(nèi)只有1個T細(xì)胞CD3ζ受體的信號區(qū)；第2代CAR增加了1個共刺激分子信號〔如CD27、CD28、OX40、可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）或CD137（4-1BB）等〕，可實(shí)現(xiàn)協(xié)同刺激分子和細(xì)胞內(nèi)信號的雙重活化，使T細(xì)胞持續(xù)增殖并釋放細(xì)胞因子，提高T細(xì)胞的抗腫瘤能力；第三代增加了2個共刺激分子信號，相比第二代，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前，用于臨床治療研究的主要為第2代和第3代CAR-T細(xì)胞技術(shù)，其中用來攜帶CAR的載體主要來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。第四代CAR（或TRUCKs）在前三代的基礎(chǔ)上增加了一個或多個可以編碼CAR及其啟動子的載體，在T細(xì)胞激活時可以產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子（如IL-12），從而調(diào)節(jié)局部微環(huán)境并輔助CAR-T細(xì)胞功能。

1.3 CAR的表達(dá)

外源基因?qū)爰?xì)胞中通常需要運(yùn)輸工具，因此，將CAR基因整合到T細(xì)胞中（即轉(zhuǎn)染）使其成功表達(dá)于T細(xì)胞表面需要借助特殊的方法，包括病毒法和非病毒法[7]。病毒類載體如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒（γ逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒）可以通過病毒整合酶的作用，將其逆轉(zhuǎn)錄到T細(xì)胞DNA中，從而成為該細(xì)胞基因組的一部分。但是，由于良好操作規(guī)范下的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)耗費(fèi)時間且費(fèi)用昂貴，因此有些研究小組采用非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法來實(shí)現(xiàn)永久性轉(zhuǎn)導(dǎo)，如采用特定的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)，包括“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[8]和piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子[9]。但是，通過這些方法成功表達(dá)CAR的T細(xì)胞需要在體外擴(kuò)增到足夠的數(shù)量才能輸入體內(nèi)產(chǎn)生治療效果。

2 CAR-T細(xì)胞免疫療法的臨床應(yīng)用

過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療（adoptive cell transfer therapy，ACT），是指從腫瘤患者中分離免疫活性細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定，然后向患者轉(zhuǎn)輸，從而直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞。ACT包括非特異性免疫治療和特異性免疫治療，CAR-T細(xì)胞免疫療法屬于后者。接受CAR-T細(xì)胞免疫療法的患者，需要從其體內(nèi)分離免疫T細(xì)胞，利用基因工程將CAR表達(dá)于T細(xì)胞；然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細(xì)胞；最后把擴(kuò)增好的CAR-T細(xì)胞輸回病人體內(nèi)，嚴(yán)密監(jiān)護(hù)病人。

2.1 CAR-T細(xì)胞免疫療法在B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用。

2.1.1 非霍奇金淋巴瘤

CAR-T細(xì)胞免疫療法的早期臨床試驗(yàn)主要集中在治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）。貝勒醫(yī)學(xué)院（BCM）、希望之城和弗雷德哈欽森癌癥研究中心（FHCRC）[7]等研究團(tuán)隊和Memorial Sloan Kettering癌癥中心（MSKCC）的研究組[8]以及Savoldo等人[9]證明了用靶向CD19的含有CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR-T細(xì)胞免疫療法治療慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–LL）或?yàn)V泡性淋巴瘤取得了較好的療效，且第二代CAR明顯促進(jìn)了T細(xì)胞的擴(kuò)增、增強(qiáng)了T細(xì)胞持久性。盡管總體療效較好，但偶爾出現(xiàn)的毒性反應(yīng)如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）說明CAR-T細(xì)胞免疫療法需要進(jìn)一步評估。

近兩年的各項研究正逐步改善早期臨床試驗(yàn)中治療NHL出現(xiàn)的各項問題。在FHCRC研究人員的最新一項臨床試驗(yàn)中[9]，34名復(fù)發(fā)/難治性NHL的患者接受19BBz CAR治療。絕大多數(shù)患者有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL，n=18），其余為濾泡型淋巴瘤（n=6），CLL（n=6）或套細(xì)胞淋巴瘤（n=4）。注入的CD19 CAR-T細(xì)胞具有確定的亞群，即比例為1:1的CD8+T中央型記憶細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞。他們還比較了用環(huán)磷酰胺＋氟達(dá)拉賓或環(huán)磷酰胺（沒有氟達(dá)拉賓）的預(yù)處理方案，結(jié)果顯示：用氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺治療的患者中，CAR-T細(xì)胞的持久性和擴(kuò)增性增加，且與僅用環(huán)磷酰胺治療的患者相比，CR率得到改善。在由FHCRC治療的最佳預(yù)處理方案的隊列中，DLBCL的CR率為38%（3/8），濾泡性淋巴瘤的CR率為67%（2/3）。此外，CLL的CR率為50%（n=3/6），表明CLL早期試驗(yàn)的結(jié)果得到改善，最有可能的原因是改善了調(diào)節(jié)化療。他們還證明了由于細(xì)胞介導(dǎo)的抗鼠scFv T細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致CAR T細(xì)胞持續(xù)性差的潛在原因。因此，在調(diào)節(jié)化療中加入氟達(dá)拉濱的益處是使對CAR的宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答最小化。UPENN研究人員在由Kite Pharma贊助的I/II期臨床試驗(yàn)中[11]再次證實(shí)DLBCL對19-28zCAR-T細(xì)胞敏感。

自從首次報道針對非霍奇金淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞免疫療法的8年以來，諸多研究小組經(jīng)過不懈努力，他們的累積研究工作已經(jīng)確定了一個更優(yōu)化的的調(diào)理化療方案、有效和安全的CAR-T細(xì)胞劑量范圍以及最佳的CAR設(shè)計方案。盡管取得了這些成功，但其他類型的NHL仍然有更多的工作要做，比如CLL。由于不適宜的腫瘤微環(huán)境，這種疾病可能對免疫干預(yù)更具抵抗力，或者來自這些患者的T細(xì)胞可能比其他B細(xì)胞惡性腫瘤持續(xù)受損更嚴(yán)重，需要進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)處理方案。

2.1.2 B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病

國內(nèi)對CAR-T細(xì)胞免疫療法治療急性B淋巴細(xì)胞白血病的研究取得了巨大進(jìn)展。根據(jù)第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院血液科的臨床觀察[12]，2015年4月～2016年1月期間，3例復(fù)發(fā)/難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病患者采用CAR-T細(xì)胞治療。3例患者均為多次誘導(dǎo)化療不能達(dá)到完全緩解，或復(fù)發(fā)后再次誘導(dǎo)治療無效。均采集自體外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)。回輸前以氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺方案預(yù)處理，回輸CAR-T細(xì)胞數(shù)量為0.97至1.0×106/kg。結(jié)果2例患者在CAR-T細(xì)胞輸注后1月內(nèi)達(dá)到完全緩解，1例患者無效。達(dá)到緩解的2例患者在CAR-T細(xì)胞治療后的第3和第6個月復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后的1例患者出現(xiàn)CD19陰性克隆復(fù)發(fā)；在整個治療過程中，未發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此得出結(jié)論：CAR-T細(xì)胞可以有效的治療復(fù)發(fā)/難治CD19抗原陽性急性淋巴細(xì)胞白血病，能夠降低耐藥患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，甚至達(dá)到完全緩解。

2.2 CAR-T細(xì)胞免疫療法在實(shí)體瘤中的應(yīng)用

CAR-T細(xì)胞免疫療法在治療血液腫瘤方面取得了顯著的成功，尤其是CD19-CARs在治療急性和慢性B淋巴細(xì)胞白血病和患有淋巴瘤和惡性腫瘤的患者的臨床試驗(yàn)中均顯示出良好的治療效果。目前越來越多的臨床試驗(yàn)集中在實(shí)體瘤，靶向表面蛋白包括癌胚抗原（CEA）、糖基化血紅蛋白GD2、間皮素、白細(xì)胞介素13受體α（IL-13Rα）、人表皮生長因子受體2（HER2）和（FAP）和L1細(xì)胞粘附分子（L1CAM）等。

2.2.1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實(shí)體瘤，主要起源于腎上腺，NB發(fā)病早、惡性程度高、預(yù)后差，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放療、化療以及造血干細(xì)胞移植等多重療法介入，NB患兒總體生存率已有所提高，但高?；純号R床預(yù)后仍不佳，因此CAR-T細(xì)胞免疫療法有望成為較好的治療備選方案。

神經(jīng)節(jié)苷脂GD2作為腫瘤相關(guān)糖類抗原，與腫瘤的增殖、擴(kuò)散、血管生成、代謝、免疫相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，GD2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中呈高密度表達(dá)，而在其他神經(jīng)源性腫瘤低密度表達(dá)，因此GD2-CAR-T細(xì)胞免疫療法已在臨床試驗(yàn)中作為治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的最佳方案。Chrystal U. Louis等合成了GD2-CAR-T細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，且在EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（EBV-CTL）和活化T細(xì)胞（ATC）中表達(dá)了兩種可以區(qū)分形式的CAR，在之前的研究中他們已證實(shí)：表達(dá)GD2-CAR（CAR-CTL）的EBVCTL在灌注早期比GD2-CAR ATC（CAR-ATC）有更高水平的傳播。在他們最新的研究中，報道了19例高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者輸注GD2-CAR-T細(xì)胞的長期臨床和免疫學(xué)結(jié)果：輸注緩解8例，活動性疾病11例。11例活動性疾病患者中有3例完全緩解。因此，GD2-CAR-T細(xì)胞免疫療法治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤效果良好。

2.2.2 惡性黑色素瘤

惡性黑色素瘤（malignantmelanoma）是起源于胚胎期神經(jīng)嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預(yù)后差，以皮膚惡性黑色素瘤最常見。針對惡性黑色素瘤的手術(shù)治療，即使進(jìn)行早期進(jìn)行根治手術(shù)，患者5年生存率也低于70%，晚期患者5年生存率僅5%-10%。因此，越來越多的科學(xué)家將關(guān)注點(diǎn)放在CAR-T細(xì)胞免疫療法應(yīng)用于治療惡性黑色素瘤上。

黑色素瘤攜帶大量突變基因，其表達(dá)的腫瘤新抗原可以被患者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識別，因此近年來新抗原被確定為潛在靶標(biāo)。在Efrat Merhavi-Shoham等科學(xué)家進(jìn)行的ACT治療惡性黑色素瘤試驗(yàn)[13]結(jié)果中顯示：使用VEGFR2-CAR-T細(xì)胞的ACT的24名患者中，緩解率為4%。目前正在進(jìn)行GD2-CAR-T細(xì)胞治療黑色素瘤的I期臨床試驗(yàn)。

3 CAR-T細(xì)胞免疫療法的毒性

3.1 腫瘤靶向毒性

造成腫瘤靶向毒性的原因是攜帶CAR的T細(xì)胞快速、大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的炎性細(xì)胞因子短時間內(nèi)迅速釋放，造成細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS），癥狀以寒顫、發(fā)熱為主。同時，由于CAR成功結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的靶抗原，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放，從而造成以高鉀、高磷、高尿酸、低鈣癥狀為主的腫瘤溶解綜合征（Tumor lysis syndrome，TLS）[14]。第二代CD19-CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)中，患者出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、譫妄現(xiàn)象等癥狀，可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、釋放大量炎性因子(如IL-6)有關(guān)[15]。

3.2 非腫瘤/靶向毒性

CAR識別的抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（Tumor associated antigen，TAA），而腫瘤相關(guān)抗原并非腫瘤細(xì)胞所特有，其在健康組織上也存在不同程度的表達(dá)。這種CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會攻擊正常組織造，這種毒性即非腫瘤靶向毒性，該毒性機(jī)制造成的毒性效應(yīng)稱為脫靶效應(yīng)。Beatty等科學(xué)家在治療惡性胸膜間皮瘤、轉(zhuǎn)移性胰腺癌的臨床試驗(yàn)中表明，脫靶效應(yīng)可造成患者心臟驟停、呼吸衰竭、等副反應(yīng)，原因是間皮素可在正常腹膜、胸膜及心包間皮細(xì)胞上表達(dá)，CAR識別了正常組織、細(xì)胞上的間皮素并且對其產(chǎn)生殺傷作用，導(dǎo)致較為嚴(yán)重的后果。

3.3 非腫瘤/靶向外毒性

顧名思義，該毒性即CAR-T細(xì)胞對健康組織、非靶向抗原造成的毒性。該毒性機(jī)制最近出現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞療法的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，其原理是CAR-T細(xì)胞發(fā)生效應(yīng)后T細(xì)胞的活性持續(xù)下降且存在于體內(nèi)時間較長，從而間接影響體內(nèi)局部微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引起毒性效應(yīng)[16]。Kalaitsidou M等科學(xué)家報道了接受CD19靶向的第二代CAR-T細(xì)胞治療的小鼠出現(xiàn)了Th1型的細(xì)胞因子驅(qū)動的急性毒性，同時報道了由于CD4+CAR-T細(xì)胞的慢性活性造成的骨髓細(xì)胞響應(yīng)于Th2型細(xì)胞因子驅(qū)動的慢性毒性，這種慢性毒性導(dǎo)致髓樣細(xì)胞的特異性擴(kuò)增。最終尸檢證明，受影響的動物呈現(xiàn)脾腫大，淋巴結(jié)充滿肉芽腫樣細(xì)胞；細(xì)胞因子分析顯示Th2細(xì)胞因子水平升高，特別是IL-10和IL-1，并且假定該細(xì)胞因子來源于在次級淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)內(nèi)鑒定的大量CD4+CAR T細(xì)胞。然而受影響的動物基本上沒有CD8+CAR-T細(xì)胞和B細(xì)胞，因此這項研究最終證明了CAR-T細(xì)胞長期在體內(nèi)長期刺激時會存在自身毒性的潛能。

4 結(jié) 語

CAR-T細(xì)胞免疫療法作為近期內(nèi)最熱門的研究領(lǐng)域，F(xiàn)DA在2017年分別受理了諾華和凱特制藥CAR-T療法的生物制品申請，同時，全球第一個CAR-T療法上市；該療法早期主要集中于治療淋巴瘤和白血病，近年來在治療黑色素瘤、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等疾病的臨床試驗(yàn)中也取得了巨大進(jìn)展，在腫瘤的過繼細(xì)胞免疫治療方面有著有人的前景。

針對出現(xiàn)的一系列包括細(xì)胞因子釋放綜合征、脫靶效應(yīng)在內(nèi)的較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，國內(nèi)外科學(xué)家也研究出諸多應(yīng)對措施，如導(dǎo)入自殺基因、構(gòu)建抑制性CAR、構(gòu)建雙靶抗原CARs、改變T細(xì)胞輸注途徑等[17]。目前最常用的就是導(dǎo)入“安全開關(guān)”（自殺基因），導(dǎo)入自殺基因即在CAR內(nèi)導(dǎo)入一個共表達(dá)的自殺基因，當(dāng)CAR-T細(xì)胞增殖且發(fā)揮效應(yīng)過快時激活自殺基因，誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞凋亡，從而終止治療[19]。常見的自殺基因有誘導(dǎo)型半胱天冬酶9（iC9）基因[18]、編碼單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）[20]。Lihua E. Budde1、Carolina Berger等人的研究團(tuán)隊激活已用iC9自殺開關(guān)證明導(dǎo)入自殺基因的CAR-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能有效除去轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，該工作證明了以安全和更有效的方式治療CD20+惡性腫瘤的方法的可行性和前景，并且該研究團(tuán)隊計劃進(jìn)行這種方法治療復(fù)發(fā)性無痛性B-NHL的I期臨床試驗(yàn)[21]。

綜上，在短短幾十年內(nèi)，CAR-T細(xì)胞免疫療法從二十世紀(jì)八十年代晚期首次被人們提出作為一種抗癌策略，到近幾年變成了可實(shí)際操作的方案治療難治且致命的腫瘤，彰顯出這一領(lǐng)域的光明前景。在國內(nèi)外科學(xué)家的努力和創(chuàng)新下，CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)必將成為眾多惡性腫瘤患者的福音。