何叢 祝蔭 呂農(nóng)華

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢。重癥AP(SAP)早期，由于炎癥細胞因子大量釋放可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，后期可并發(fā)腸功能障礙和胰腺壞死組織感染(infected pancreatic necrosis，IPN)。IPN的感染細菌大多為腸道細菌，如常見的大腸桿菌、糞球菌和腸球菌等，腸源性感染可能是SAP患者發(fā)生IPN的始動因素。近年來，腸道菌群作為人體的第二大基因組，與人類健康和疾病的關(guān)系受到人們的廣泛關(guān)注。正常腸道菌群參與人體多種生命過程，在腸道發(fā)育和穩(wěn)態(tài)、腸道免疫系統(tǒng)的建立及防御病原體入侵等多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。

一、腸道菌群在AP中的改變

2015年Tan等[1]首次應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)變性梯度凝膠電泳法(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)分析發(fā)現(xiàn)，與輕癥AP(MAP)比較，SAP腸球菌相對豐度明顯升高，而乳酸桿菌豐度明顯下降，腸道菌群變化越顯著的SAP患者MODS和感染性并發(fā)癥的發(fā)生率越高，且血清炎癥因子IL-6水平與腸桿菌科和腸球菌豐度呈正相關(guān)而與乳酸桿菌呈負相關(guān)，血清內(nèi)毒素水平與腸球菌呈明顯正相關(guān)，提示炎癥反應(yīng)可能與腸道菌群失衡有關(guān)。Chen等[2]建立急性壞死性AP(acute necrotizing pancreatitis，ANP)動物模型并應(yīng)用16S rRNA高通量測序法研究腸道菌群的改變，同時檢測回腸中潘氏細胞抗菌肽分泌。主成分分析(principal component analysis，PCA)顯示ANP組腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常對照組存在顯著差異，其物種多樣性明顯減少，門水平表現(xiàn)為Saccharibacteria和Tenericutes減少，屬水平表現(xiàn)為大腸埃希菌-志賀菌和Phascolarctobacterium相對豐度明顯增加而Candidatus_Saccharimonas、Prevotellaceae_UCG-001、Lachnospiraceae_UCG-001、Ruminiclostridium_5和Ruminococcaceae_UCG-008則明顯下降。與此同時，潘氏細胞分泌的抗菌肽明顯減少，且與大腸埃希菌-志賀菌豐度呈負相關(guān)，提示ANP腸屏障功能的破壞可能與腸道菌群失衡以及潘氏細胞抗菌肽的減少有關(guān)。Huang等[3]在高脂血癥性ANP動物模型中同樣發(fā)現(xiàn)腸道菌群失衡與潘氏細胞抗菌肽的減少，兩者呈顯著的相關(guān)性，進一步證實不同病因ANP均存在腸道菌群失調(diào)及其與腸屏障功能障礙有關(guān)。

由于應(yīng)用PCR-DGGE法分析腸道菌群結(jié)構(gòu)靈敏度較低，僅能檢測腸道中高豐度微生物，具有一定局限性。我們團隊采用目前靈敏度較高的16S rRNA高通量測序法，檢測130例不同病情分級的AP患者(包括41例MAP、59例MSAP和30例SAP)及35例正常人腸道菌群結(jié)構(gòu)，分析兩者的差異，同時建立AP動物模型，從AP患者和動物模型兩個層面研究AP對腸道菌群的影響及其與腸屏障及炎癥反應(yīng)的關(guān)系。研究結(jié)果顯示AP患者腸道菌群組成發(fā)生顯著改變，其物種多樣性明顯減少，并且通過建立數(shù)學(xué)模型分析發(fā)現(xiàn)35種細菌改變與AP顯著相關(guān)，其預(yù)測敏感性達84%。而且這些細菌的改變與炎癥反應(yīng)及腸屏障受損有關(guān)。進一步比較發(fā)現(xiàn)AP患者和動物模型中腸道內(nèi)機會致病菌(如大腸埃希菌-志賀菌、腸球菌和某些腸桿菌)相對豐度均明顯增加，而維持腸黏膜屏障的有益菌屬則明顯減少，由此推測AP早期腸道菌群的失衡可能破壞腸屏障，使腸道內(nèi)致病菌通過損傷的腸黏膜釋放入血，導(dǎo)致細菌易位從而繼發(fā)腸源性感染。因此，腸道菌群失衡可能是促進AP病情進展和后期并發(fā)癥發(fā)生的重要因素，但其因果關(guān)系及確切的分子機制有待進一步深入研究。

二、腸道菌群失衡促進AP進展的可能機制

1．腸道菌群穩(wěn)態(tài)被打破從而影響腸黏膜屏障功能：腸黏膜屏障包括機械屏障、免疫屏障與生物屏障。機械屏障由腸上皮細胞、細胞間緊密連接和上皮表面的菌膜三者共同構(gòu)成，能有效阻止腸腔內(nèi)細菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過腸黏膜進入血液。腸道正常菌群如Lactobacillus sakei OK67可通過增加結(jié)腸腸上皮細胞緊密連接蛋白的表達修復(fù)腸黏膜機械屏障，抑制炎癥反應(yīng)。Zhu等[4]報道，給予黃連素的小鼠通過增加腸道內(nèi)有益菌Akkermansia促進腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達，使腸黏膜黏液層增厚從而維持腸屏障功能。腸道菌群還可促進腸上皮細胞的增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌GG分泌的p40蛋白可反式激活腸上皮細胞表皮生長因子受體(EGFR)，從而抑制腸上皮細胞的凋亡，保護腸屏障功能[5]。生物屏障主要由正常的腸道菌群構(gòu)成，形成一個對抗病原體的重要保護屏障，具有影響腸道運動、調(diào)節(jié)宿主免疫、加強上皮屏障的功能。腸道內(nèi)有益菌還可直接與致病微生物相互作用，通過替代、排斥和競爭機制抑制致病菌生長和黏附定植；或通過空間位點和營養(yǎng)競爭等阻斷其對腸黏膜破壞和血行轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗感染作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)AP患者腸屏障功能指標即血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸水平明顯升高；AP動物模型的腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達明顯下降，均提示存在腸屏障功能受損。Li等[6]在AP患者血液中檢測到大腸桿菌、志賀菌等的DNA，進一步證實腸道內(nèi)機會致病菌可通過破損的腸屏障進入AP患者血循環(huán)，從而加重疾病的進展和感染性并發(fā)癥的發(fā)生。

2．腸道菌群代謝產(chǎn)物失衡從而影響腸黏膜屏障功能：短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)大多由腸腔內(nèi)未經(jīng)消化的碳水化合物等經(jīng)腸道菌群酵解產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs對宿主具有氧化供能、抗炎抗腫瘤和維持腸黏膜屏障的功能，可以增加跨上皮電阻和緊密連接蛋白表達，從而加強腸黏膜屏障功能，降低腸黏膜通透性和細菌易位，避免或減輕病理反應(yīng)。初級膽汁酸在肝臟中合成，隨膽汁進入腸道，在腸道產(chǎn)膽鹽水解酶細菌的作用下解離和脫羥基分解為次級膽汁酸。膽汁酸一方面可以幫助消化膳食脂質(zhì)，另一方面可以作為信號分子激活特異受體TGR5和FXR維持腸黏膜屏障的完整。有研究顯示，TGR5基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin表達下降，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加[7]。另有研究報道，F(xiàn)XR激活劑奧貝膽酸通過上調(diào)膽汁淤積性肝損傷大鼠回腸中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin表達，從而保護腸黏膜屏障、阻止細菌易位、減輕腸道炎癥[8]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和微量蛋白質(zhì)的復(fù)合物，LPS是其主要抗原性和致病性部分，是細菌死亡或解體后釋放出來的一種具有廣泛生物活性的細菌結(jié)構(gòu)成分。SAP時腸道菌群失衡特別是致病菌大量生長、繁殖并釋放大量內(nèi)毒素，不但可以直接引起腸黏膜屏障損傷，也可引起腸源性內(nèi)毒素易位，從而導(dǎo)致炎癥遞質(zhì)大量釋放，最終引發(fā)SIRS和MODS。目前在AP發(fā)生發(fā)展過程中腸道菌群代謝產(chǎn)物的改變及其對腸黏膜屏障、后期并發(fā)癥的影響尚不明確，有待進一步研究。

三、調(diào)節(jié)腸道菌群在AP治療中的作用

通過應(yīng)用益生菌糾正腸道菌群失衡治療AP一直是近年來的研究熱點，一方面益生菌可維持腸道微生態(tài)平衡，增加內(nèi)在的防御屏障；另一方面益生菌能改善腸黏膜的免疫防御屏障，從而防止腸道產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)。2002年來自匈牙利學(xué)者首次針對益生菌乳酸桿菌治療AP療效進行了一項隨機雙盲對照試驗，結(jié)果顯示益生菌治療組患者感染性胰腺壞死、胰腺膿腫等感染性并發(fā)癥的發(fā)生率顯著低于對照組，提示益生菌在一定程度上可改善AP的預(yù)后[9]。然而2008年《Lancet》發(fā)表了一項來自荷蘭的為期4年的PROPATRIA多中心隨機雙盲對照研究卻得出相反的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)預(yù)防性應(yīng)用益生菌反而增加SAP患者的死亡風(fēng)險，而感染性并發(fā)癥的發(fā)生率無明顯下降。此外，益生菌治療組中9例患者發(fā)生腸缺血，而對照組無1例發(fā)生[10]。2016年Bongaerts等[11]對該研究進行重新評估，提出益生菌使用時間晚、劑量低以及治療前器官衰竭發(fā)生率較對照組高可能是益生菌治療組死亡率高于對照組的原因，建議SAP患者應(yīng)用益生菌的時機應(yīng)盡早且劑量需增加(1012-1014CFU/d)，同時限制多糖的攝入，從而防止腸道自身菌群過度生長。

目前，益生菌的安全性主要存在以下幾方面問題：(1)益生菌的潛在感染能力。在SAP等危重情況下應(yīng)用益生菌可能發(fā)生益生菌易位并誘發(fā)感染和敗血癥等。(2)益生菌攜帶的多種酶(如硝基還原酶、氨基脫羧酶和糖苷酶等)產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物對機體尤其是胃腸道系統(tǒng)可能產(chǎn)生不利影響。(3)益生菌的免疫效應(yīng)可能引起超敏反應(yīng)。(4)益生菌的耐藥性。一旦某些潛在致病性益生菌成為致病菌則會增加抗感染治療的難度。2013年國際胰腺協(xié)會與美國胰腺協(xié)會制定的AP診治指南中不推薦使用益生菌預(yù)防AP感染性并發(fā)癥，同年我國AP診治指南提出益生菌可調(diào)節(jié)腸道免疫和糾正腸道菌群失調(diào)，從而重建腸道微生態(tài)平衡。目前糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染已被寫入美國醫(yī)學(xué)指南，此外FMT在治療潰瘍型結(jié)腸炎、腸易激綜合征和代謝綜合征等疾病中也顯示出良好的前景，但迄今為止尚無FMT應(yīng)用于AP的報道。目前美國NIH Clinical trials網(wǎng)站上已注冊相關(guān)臨床研究，對于其臨床療效我們拭目以待。

四、結(jié)語與展望

人體腸道菌群作為一個重要的“器官”參與人體生理和病理過程，與人體形成復(fù)雜的共生體。目前AP病程中存在腸道菌群失衡，腸黏膜屏障受損，細菌易位導(dǎo)致疾病進展，影響預(yù)后較為明確，但腸道菌群紊亂與AP的重癥化是否存在因果關(guān)系，機制如何還需要更多的實驗研究加以證實，而腸道微生態(tài)制劑和糞菌移植在AP治療中的應(yīng)用也需要更多的臨床研究以資明確。

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