王曉敏，王耀輝，耿思宇，咸栓獅，杜春芳，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000）

油菜是一種重要的油料經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量及質(zhì)量對其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著非常重要的影響。油菜不僅是食用植物油的最主要來源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白源，而且還是目前用于解決全球能源危機(jī)方向之一的生物柴油的理想原料[1]。目前，油菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究體系已日趨成熟，用于轉(zhuǎn)化的目的基因也更加多樣化，通過將不同優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入油菜，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而提高油菜的產(chǎn)量、抗性，改善油菜的品質(zhì)。吳珣[2]研究表明，將BnSDIR1和BnRab7基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜提高了植株抗旱、耐鹽的能力。BONDARUK等[3]研究表明，將ACP基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜，提高了油菜種子中不飽和脂肪和硬脂酸的含量。WANG等[4]研究表明，在甘藍(lán)型油菜中導(dǎo)入LRP基因，提高了油菜種子中賴氨酸的含量。LIU等[5]研究表明，將孢子囊和幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒酥校玫降霓D(zhuǎn)基因油菜具有很強(qiáng)的抗小菜蛾和核盤菌的能力。ZHU等[6]研究表明，在油菜中轉(zhuǎn)入ThIPK2基因，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽、抗干旱、抗氧化等非生物逆境的能力。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種經(jīng)過雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的、過程非常保守的、可以導(dǎo)致同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。RNAi是生物體的一種保護(hù)自我的現(xiàn)象，具有重要的生理意義[7]：首先它能夠通過降解mRNA來抑制病菌復(fù)制[8]；其次還能夠阻止轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，保證細(xì)胞基因組和功能的完整性[9]；同時(shí)，RNAi還可以使基因沉默，而且是隨機(jī)的。所以，只要提供與目的基因相對應(yīng)的dsRNA，就能夠達(dá)到預(yù)想的目的，比基因敲除技術(shù)更為方便、快捷。

HKL1是一種己糖激酶類似物，沒有催化己糖磷酸化的活性，但在植株的生長發(fā)育過程中具有重要作用。HEAZLEWOOD等[10]研究認(rèn)為，HXK1和HKL1主要位于線粒體上，是植物呼吸過程中必不可少的酶之一。OBAYASHI等[11]研究表明，多種激素與HKL1基因的表達(dá)密切相關(guān)。己糖激酶（HXK）在植物的生長發(fā)育過程中是必不可少的[12]。

杜春芳等[13]的研究主要是對轉(zhuǎn)化方法的研究，杜建中等[14]雖然對轉(zhuǎn)入基因的功能進(jìn)行了研究，但是也僅限于表型的觀察等，更深層次的研究較少。

本試驗(yàn)是第1次采用花粉介導(dǎo)法將RNAi型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，并對其基因的表達(dá)量等也進(jìn)行了相應(yīng)的研究，且外源基因在各代中都穩(wěn)定遺傳?；ǚ劢閷?dǎo)法較農(nóng)桿菌侵染法、PEG法等省去了繁瑣的無菌苗組織培養(yǎng)過程，操作更為簡單，成本低，實(shí)用性更強(qiáng)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜品種7B為受體材料，其由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所油菜課題組提供。外源基因?yàn)閿y帶有目的基因HKL1的pCaMHKL1-RNAi質(zhì)粒，質(zhì)粒線性圖譜如圖1所示。該質(zhì)粒中含有GUS標(biāo)記基因，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因檢測，受35S啟動(dòng)子（CaMV35S）調(diào)控。HIndIII和 Xbal為酶切位點(diǎn)。NPTII為新氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因，是卡那霉素篩選標(biāo)記。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取 將RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，于LB培養(yǎng)基（Kan 100 mg/L）37℃，180 r/min進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用堿裂解法[15]從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，溶于TE溶液，備用。

1.2.2 植物轉(zhuǎn)化 采用花粉介導(dǎo)法[16]進(jìn)行RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。供試材料甘藍(lán)型油菜品種7B種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)地內(nèi)，2015年4月初開花。在開花期進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前將即將開花的主莖或1次分支上的花蕾去雄，第2天上午取當(dāng)天開花的花粉，置于0.25 mol/L蔗糖溶液中，加入質(zhì)粒，進(jìn)行超聲波處理。然后，將處理過的花粉授于去雄的雌花柱頭上，套袋并標(biāo)記，同時(shí)記錄授粉花蕾數(shù)。5～6 d后去袋。于當(dāng)年5月收獲種子。

1.2.3 植物DNA提取及PCR轉(zhuǎn)基因鑒定 2015年11月將收獲的T0種子播種于溫室進(jìn)行生長。觀察幼苗在生長過程中的表型變化，并拍照記錄。當(dāng)植株長出5～6片真葉時(shí)，采用CTAB法提取植物的總DNA。由于RNAi質(zhì)粒攜帶有GUS標(biāo)記基因，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)GUS基因的上下游引物分別為5′-GTGAATCCGCACCTCTGG-3′和 5′-ATCGCCGC TTTGGACATA-3′。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，3 min；變性 94 ℃，30 s；退火 56 ℃，30 s；延伸 72℃，1 min；終延伸72℃，7 min；30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，配置1%的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳分析，統(tǒng)計(jì)PCR結(jié)果。2016年7月將收獲的部分T2種子先播種于小花盆，置于4℃，16 h光照、8 h黑暗的生化培養(yǎng)中進(jìn)行春化處理，后再將其移入溫室進(jìn)行生長。

1.2.4 qRT-PCR檢測基因的表達(dá)量 qRT-PCR用于檢測T2轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物中HKL1基因的相對表達(dá)量。用Trizol（TaKaRa）從樣品中提取植物總RNA，凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。通過PrimeScript RT gDNA Eraser（TaKaRa） 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，將油菜Actin基因的相對擴(kuò)增作為內(nèi)部對照。利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)HXK1L和Actin基因的上下游引物HXK1L：5′-TGAAGAAGCAACGAGAAGAGC-3′；5′-ATAGGCAGAGATGGAAGCGGA-3′，Actin：5′-CCCT GGAATTGCTGACCGTA-3′；5′-TGGAAAGTGCTGC TGAGGGATGC。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，15min；95 ℃，10 s；57 ℃，15 s；60 ℃，10 s；72 ℃，20 s；40 個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用ABI 7500 SDS軟件（Applied Biosystems）分析qRT-PCR數(shù)據(jù)，并用比較Ct法（2-ΔΔCt）處理數(shù)據(jù)[17]。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS20.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉介導(dǎo)法獲得擬RNAi植株

2015年4月利用花粉介導(dǎo)法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化，于當(dāng)年5月收獲種子，結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)如表1所示，T0植株中，去雄總數(shù)295個(gè)，結(jié)果莢數(shù)63個(gè)，結(jié)果莢率為21.36%，收獲種子總數(shù)為221粒。

表1 轉(zhuǎn)基因處理后植株結(jié)實(shí)情況

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2015年11月從中選取129粒種子播種于溫室，待植物長出5～6片真葉時(shí)，提取其基因組DNA（圖2），通過PCR擴(kuò)增檢測樣品中的GUS標(biāo)記基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定（圖3）。結(jié)果表明，播種的129粒T1油菜種子，生長過程死亡9棵，剩余的120棵油菜植株中42棵為轉(zhuǎn)基因植物，其中，38棵植株收獲T2種子。T2種子在2016年7春化處理后種植于溫室，PCR擴(kuò)增進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。轉(zhuǎn)基因植物中GUS基因的分離比如表2所示。從表2可以看出，轉(zhuǎn)基因植物株系BT2-1，BT2-10和BT2-11中顯示出預(yù)期的3∶1（轉(zhuǎn)基因∶非轉(zhuǎn)基因植物）的GUS基因的分離比，意味著這些T2轉(zhuǎn)基因株系是雜合子。而在植株株系BT2-9和BT2-12中的T2轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為GUS陽性，意味著這些T2轉(zhuǎn)基因株系是純合子。

表2 T2轉(zhuǎn)基因油菜植株中GUS基因的分離

2.3 QRT-PCR測定HKL1基因的相對表達(dá)量

提取轉(zhuǎn)基因植株的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，利用qRT-PCR試驗(yàn)測定了部分RNAi植株和野生型植株中HKL1基因的相對表達(dá)量（圖4），結(jié)果表明，RNAi植株中HKL1基因的相對表達(dá)量為野生型植株的24.6%～67.9%，不同RNAi植株中HKL1基因的表達(dá)量各不相同，基因表達(dá)量不同是因?yàn)槠洳迦胛稽c(diǎn)不同。

2.4 RNAi植株在生長發(fā)育過程的表型變化

在T2植株的生長過程中，觀察到與野生型植株相比，RNAi型轉(zhuǎn)基因植株真葉長出的時(shí)間較晚（圖5-A，B），株型也較?。▓D5-C）。RNA干擾油菜植株中的HKL1基因的表達(dá)，會(huì)影響植株的生長發(fā)育。KARVE等[18]研究表明，在擬南芥中，HKL1負(fù)調(diào)控植株的生長發(fā)育。

3 討論

本試驗(yàn)采用花粉介導(dǎo)法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化，相比較于農(nóng)桿菌侵染、PEG等轉(zhuǎn)化方法省去了繁瑣的組織培養(yǎng)過程，操作方便、成本低、實(shí)用性強(qiáng)。但是花粉介導(dǎo)法也有其局限性：只有在植物開花期才能采取該方法，有一定的時(shí)間局限性；需要人工去雄，將含苞的花蕾剝開摘取雄蕊（這一過程要小心，避免破壞花蕾，影響后期的轉(zhuǎn)化效率）；需要超聲波輔助將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入花藥細(xì)胞中，超聲時(shí)間、功率、次數(shù)和每次超聲的間隔時(shí)間等都會(huì)對質(zhì)粒DNA導(dǎo)入花藥細(xì)胞和花粉的活力產(chǎn)生較大的影響，而且不同植物的花粉量和花藥的活力等不盡相同，要根據(jù)具體的試驗(yàn)材料確定其合適的超聲參數(shù)。所以，利用花粉介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，要選擇合適的轉(zhuǎn)化條件，提高外源基因的轉(zhuǎn)化率。

本試驗(yàn)是第1次利用花粉介導(dǎo)法將一個(gè)RNAi型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，旨在探究用花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化RNAi型質(zhì)粒的效率，并簡要研究HKL1基因?qū)τ筒酥仓晟L和發(fā)育的影響。結(jié)果表明，利用花粉介導(dǎo)法可以成功地進(jìn)行RNAi型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，而且目的基因可以在后代植株中穩(wěn)定遺傳，其基因分離也符合基本的孟德爾定律。

目前，對己糖激酶（HXK）在植物中的相關(guān)研究主要集中在少數(shù)模式植物上（如擬南芥、煙草等），TAO等[19]以甘薯為試驗(yàn)材料，研究了其不同組織中HXK的表達(dá)量，結(jié)果表明，HXK的表達(dá)量在甘薯的初始膨大塊根中最高，在成熟葉片中最低。KARVE等[20]研究認(rèn)為，己糖激酶在植物中經(jīng)常以多基因家族的方式出現(xiàn)。H?USLER等[21]研究發(fā)現(xiàn)，植物中HXKs可以把葉綠體生成的糖信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)光合反應(yīng)中有關(guān)基因的表達(dá)。KELLY等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥和番茄中過表達(dá)HXK1，能夠降低擬南芥氣孔導(dǎo)度和蒸騰作用。

在甘藍(lán)型油菜中HXKs的研究尚未報(bào)道，對油菜中HXK基因表達(dá)的時(shí)空變化、對非生物脅迫的響應(yīng)以及在油菜中的作用仍不清楚。所以，研究甘藍(lán)型油菜中的HXK及其功能是有必要的。本試驗(yàn)結(jié)果可以為HXKs在植物中的表達(dá)情況及其相關(guān)的功能研究提供一些理論依據(jù)，以完善HXKs在植物方面的相關(guān)研究。

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