李 婷，練 森，李保華，梁文星，王彩霞

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

由黑腐皮殼菌(Valsamalivar.mali，Vmm)引起的蘋果樹腐爛病是蘋果生產(chǎn)上的三大重要病害之一，該病在我國各蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，可造成果樹主干及整樹死亡，甚至毀園[1-2]。2008年，全國范圍內(nèi)蘋果樹腐爛病的總體發(fā)病率高達(dá)52.7%，且病情呈蔓延趨勢(shì)[3]；2011年，煙臺(tái)蘋果產(chǎn)區(qū)腐爛病再次大發(fā)生，發(fā)病程度明顯重于一般年份[4]?，F(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害防控研究室的有關(guān)專家認(rèn)為，我國蘋果生產(chǎn)正面臨腐爛病第5次發(fā)病高峰的威脅[2-3]。目前，由于缺乏對(duì)蘋果樹腐爛病菌致病機(jī)制的全面了解，導(dǎo)致該病尚無法得到有效控制。

蘋果樹腐爛病菌的主要致病機(jī)制，除產(chǎn)生毒素外，還可分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶，其中包括木聚糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲基半乳糖醛酸酶[5-7]。臧睿[8]研究發(fā)現(xiàn)蘋果樹腐爛病菌不同菌株的致病力與其分泌的果膠酶活性關(guān)系密切，許春景等[7]報(bào)道腐爛病菌的果膠裂解酶基因Vmpl4及多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8被敲除后，突變體菌株的致病力均有不同程度的降低。蘋果樹腐爛病菌侵染致病過程中，分泌的5種細(xì)胞壁降解酶中以木聚糖酶的活性最高，且對(duì)蘋果組織的浸漬能力最強(qiáng)[5]，史祥鵬[9]對(duì)腐爛病菌的木聚糖酶基因功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)敲除Xylanase突變體菌株的致病力和產(chǎn)生的木聚糖酶活性均顯著降低。以上研究表明，果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶和木聚糖酶基因在腐爛病菌致病過程中具有重要作用。

β-葡萄糖苷酶能夠水解結(jié)合于末端非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基，作為纖維素酶系的一個(gè)重要成員，β-葡萄糖苷酶在降解纖維素的過程中具有關(guān)鍵作用[10-13]。目前，已篩選到多種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物菌株，如里氏木霉菌(Trichodermareesei)、木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)和白色念珠菌(Candidaalbicans)等，并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域[14-17]。研究表明，多種植物病原菌也可分泌高活性的β-葡萄糖苷酶，在其致病性中發(fā)揮重要作用。張大智等[18]報(bào)道細(xì)菌性角斑病菌(Xanthomonascampestris)接種杧果葉片后4 d，β-葡萄糖苷酶活性到達(dá)峰值是對(duì)照的4.4倍；金勤等[19]測(cè)定了炭疽菌(Collectotrichumgloeosporioide)接種油茶葉片后β-葡萄糖苷酶的活性變化，于接種后6 d酶活性水平最高。陳曉林等[5]對(duì)蘋果樹腐爛病菌分泌的β-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨腐爛病菌的侵染和擴(kuò)展，β-葡萄糖苷酶活性持續(xù)升高，最大酶活性是對(duì)照的4.5倍。

隨著越來越多的β-葡萄糖苷酶基因被克隆和成功表達(dá)，為其基因結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要依據(jù)[20-21]。Waksman[22]克隆了油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的β-葡萄糖苷酶基因，并證實(shí)其原核表達(dá)蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。目前，有關(guān)其他植物病原菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在致病性中的作用機(jī)制研究還鮮有報(bào)道。本研究以蘋果樹腐爛病菌強(qiáng)致病力菌株LXS080601為材料，利用RT-PCR結(jié)合TA克隆技術(shù)獲得其β-葡萄糖苷酶基因序列，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定該基因在腐爛病菌侵染致病過程中的表達(dá)，以期為明確β-葡萄糖苷酶基因在蘋果樹腐爛病菌致病性中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株和植物材料：蘋果樹腐爛病菌菌株LXS080601采集自山東省煙臺(tái)富士蘋果園發(fā)病枝干，經(jīng)單菌絲分離后鑒定并保存。3-4年生富士蘋果(MalusdomesticaBorkh)幼樹栽植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。

試劑：TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st StrandcDNA Synthesis Kit、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR Master Mix、Prime STAR Max DNA Polymerase、pMD18-T克隆載體，寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker DL2000，青島擎科梓熙生物公司；大腸桿菌菌株DH5α，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；氨芐青霉素、Oligo(dT)18，生工生物工程(上海)股份有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 000 mL；LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，氯化鈉5 g，定容至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果樹腐爛病菌總RNA提取與cDNA合成 蘋果樹腐爛病菌于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后刮取菌絲，用TRIzol法提取總RNA。超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。以1 μg總RNA為模版，Oligo dT18為反轉(zhuǎn)錄引物，參照cDNA合成試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蘋果樹腐爛病菌VmGluI基因cDNA序列的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期蘋果樹腐爛病菌基因組序列結(jié)果，利用Oligle 7軟件設(shè)計(jì)β-葡萄糖苷酶基因的上下游引物(VmGluIFwd：5′-ATGGCCCGGATAATTTCGATG-3′；VmGluIRev：5′-TTATGTCTCCTGGTATATGTTGAACATATT-3′)。以第一鏈cDNA為模版，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 0.25 μL、ddH2O 11.25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸8 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收純化后連接至克隆載體pMD18-T，熱擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，委托青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 蘋果樹腐爛病菌VmGluI序列的生物信息學(xué)分析 將克隆到的VmGluI序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行Blast驗(yàn)證和同源性分析，并利用DNAMAN對(duì)蘋果樹腐爛病菌VmGluI和其他不同來源β-葡萄糖苷酶基因編碼氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。采用軟件MEGA 5.1以鄰接法構(gòu)建VmGluI蛋白分子系統(tǒng)發(fā)育樹。使用ExPASy生物信息學(xué)網(wǎng)站(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)VmGluI編碼蛋白的理化性質(zhì)，使用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsautomat.pl)在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4 蘋果樹腐爛病菌VmGluI的表達(dá)分析 選取長(zhǎng)勢(shì)良好且粗細(xì)一致的1-2年生富士蘋果枝條，用電烙鐵造成直徑約1～2 mm燙傷，活化培養(yǎng)3 d的腐爛病菌在菌落邊緣處打取菌餅，接種于枝條的燙傷處，用保鮮膜固定并保濕[4]。接種后6，12，24，48，72 h分別取病健交界處組織，提取樣品總RNA，利用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)VmGluI基因序列，設(shè)計(jì)合成定量PCR引物VmGluI-qF(5′-ACAAACAAGACATTGCTCGGAT-3′)和VmGluI-qR(5′-ATTATCTGCTCGTCCAACCAC-3′)。以真菌EF1α基因作為內(nèi)參[23]，合成引物EF1α-qF (5′-TGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAA-3′)和EF1α-qR (5′-TGTCCATCTTGTTGATGGCGACGA-3′)。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，去離子8.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA梯度稀釋后作為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定2對(duì)引物的擴(kuò)增效率[24-25]。以PDA上培養(yǎng)的蘋果樹腐爛病菌作為對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算VmGluI在腐爛病菌侵染致病過程中的相對(duì)表達(dá)量[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果樹腐爛病菌VmGluI的克隆和序列分析

提取蘋果樹腐爛病菌LXS080601的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模版，用VmGluIFwd和VmGluIRev特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，約1 700 bp處有一特異性條帶(圖1)。進(jìn)行克隆測(cè)序獲得1 689 bp的核苷酸序列，經(jīng)預(yù)測(cè)該基因編碼562個(gè)氨基酸殘基，BlastN比對(duì)結(jié)果顯示，該基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列相似性均不高；再用BlastP軟件將該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與蘋果(登錄號(hào)KUI68239.1)和梨樹(登錄號(hào)KUI56905.1)腐爛病菌的β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列相似性分別高達(dá)98.7%和87.8%。由此判斷，所克隆序列為蘋果樹腐爛病菌β-葡萄糖苷酶基因，命名為VmGluI，并將基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(ID：KY646110)。

M.DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1.VmGluI PCR產(chǎn)物。M.DNA Marker DL2000；1.PCR product of VmGluI.

2.2 VmGluI編碼蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Expasy Proteomics Server的在線軟件Protparam預(yù)測(cè)VmGluI編碼蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白由562個(gè)氨基酸組成，分子式為C2868H4253N715O847S15，相對(duì)分子質(zhì)量62.7 kDa，理論等電點(diǎn)pI為4.64，脂肪系數(shù)79.29，不穩(wěn)定系數(shù)38.02，預(yù)測(cè)為穩(wěn)定蛋白。利用ProtScale進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性預(yù)測(cè)，使用Hphob./Kyte&Doolittl算法，總平均親水性(Grand average of hydropathicity)為-0.162(圖2)，表明VmGluI蛋白為親水蛋白。氨基酸組成中帶正電殘基(Arg+Lys)為34，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為58，Gly (G)和Thr (T)使用頻率較高，而Cys (C)、His (H)和Met (M)使用頻率較低。此外，該基因編碼的氨基酸序列有信號(hào)肽，在24與25位氨基酸之間存在裂解位點(diǎn)。

利用SOMPA在線軟件對(duì)VmGluI蛋白的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)VmGluI的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖3)，其中有562個(gè)氨基酸殘基組成的α-螺旋含量最高，占35.59%，其次為無規(guī)則卷曲，含量占34.70%，最少的是β-轉(zhuǎn)角，僅占9.79%，說明VmGluI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，VmGluI的87-555區(qū)段為糖基水解酶家族1功能域(Pfam：00232，E-value：4.75e-113)，且存在酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)。

圖2 蘋果樹腐爛病菌VmGluI蛋白親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted the hydrophobicity/hydrophilicity of VmGluI protein from Vmm

h.α-螺旋；e.延伸鏈；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲。h.Alpha helix；e.Extended strand；t.Beta turn；c.Random coil.

2.3 VmGluI編碼氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將VmGluI編碼的氨基酸序列與蘋果和梨樹腐爛病菌中β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，圖4結(jié)果顯示，3條序列相似性高達(dá)94.2%，2個(gè)蘋果樹腐爛病菌β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列中有7個(gè)位點(diǎn)存在差異，其中6個(gè)位點(diǎn)集中在第235-304位氨基酸，而與梨樹腐爛病菌β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列的差異位點(diǎn)分布則較均勻。靠近N端的94位和靠近C端的532位谷氨酸Glu (G)是2個(gè)關(guān)鍵活性殘基，前者為親子供體，后者為親核試劑，與糖基水解酶家族1特有的保守氨基酸序列一致。

利用氨基酸BlastP比對(duì)功能進(jìn)行同源性搜索，選取11條不同真菌來源的β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法對(duì)包含VmGluI在內(nèi)的12個(gè)β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)果表明，蘋果樹腐爛病菌2個(gè)分離物β-葡萄糖苷酶基因所編碼的氨基酸序列同源性最高，與梨樹腐爛病菌(V.malivar.pyri，登錄號(hào)KUI56905.1)氨基酸序列親緣關(guān)系最近，并且與向日葵莖潰瘍病菌(Diaporthehelianthi，登錄號(hào)OCW40953.1)氨基酸序列相似性較高為71.0%，其聚在一個(gè)獨(dú)立分支上，Bootstrap值為100%，而與其他真菌β-葡萄糖苷酶基因同源關(guān)系較遠(yuǎn)。白曲霉菌(Aspergilluskawachii，登錄號(hào)GAA82784.1)、黑曲霉菌(Aspergillusniger，登錄號(hào)XP 001401684.2)、青霉菌(Penicilliumsubrubescens，登錄號(hào)OKO99982.1)和短梗霉菌(Aureobasidiumnamibiae，登錄號(hào)XP 013431390.1)聚在一個(gè)大的獨(dú)立分支，與蘋果樹腐爛病菌VmGluI的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，可能與他們同屬于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌，而非植物病原真菌有關(guān)。

Vmm.蘋果樹腐爛病菌；Vmp.梨樹腐爛病菌；圖中黑色區(qū)域代表100%的相似度；灰色代表大于50%的相似度。Vmm.V.mali var.mali；Vmp.V.mali var.pyri；Blank areas indicate 100% similarity；Gray areas indicate at least 50% similarity.

圖5 蘋果樹腐爛病菌與其他真菌來源β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic analysis of β-glucosidase genes from Vmm and other species

2.4 蘋果樹腐爛病菌侵染致病過程中VmGluI的表達(dá)分析

蘋果樹腐爛病菌LXS080601分別燙傷接種富士離體和活體枝條，接種后48～72 h可觀察到明顯的發(fā)病癥狀，隨接種時(shí)間延長(zhǎng)，病斑不斷擴(kuò)展。于接種后定期取樣，采用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了蘋果樹腐爛病菌VmGluI表達(dá)量的時(shí)序變化。未接種蘋果樹腐爛病菌的枝條中無VmGluI的表達(dá)，接種病原菌的組織中均可檢測(cè)到VmGluI表達(dá)，且基因表達(dá)量存在顯著差異。圖6-A結(jié)果顯示，腐爛病菌接種離體枝條6～24 h后，VmGluI表達(dá)量相比PDA(0 h)對(duì)照無顯著差異，接種48 h后，基因表達(dá)量開始顯著升高為對(duì)照的3.4倍，接種72 h后，VmGluI表達(dá)量為對(duì)照6.3倍。蘋果樹腐爛病菌接種活體枝條后，VmGluI表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)(圖6-B)。接種6 h后，基因表達(dá)與PDA對(duì)照(0 h)無明顯差異，但接種12 h后，基因表達(dá)量已顯著升高為對(duì)照的11.2倍，之后表達(dá)量逐漸降低，于接種48 h后基因表達(dá)量出現(xiàn)低谷，但仍顯著高于對(duì)照；隨后，VmGluI表達(dá)水平快速升高，接種96 h后，基因表達(dá)水平量為對(duì)照的16.8倍，表明蘋果樹腐爛病菌在侵染離體和活體枝條過程中，VmGluI表達(dá)水平和時(shí)序變化存在明顯差異。

圖中不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著。Different letters indicate significant difference at P<0.05 level by Duncan′s multiple range test.

3 討論

β-葡萄糖苷酶能夠破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使病原菌易于侵入和擴(kuò)展，已證實(shí)該酶是蘋果樹腐爛病菌侵染致病過程中分泌的一種細(xì)胞壁降解酶，說明其在腐爛病菌致病中具有重要作用[5]。本研究以強(qiáng)致病力菌株LXS080601為材料，首次克隆了蘋果樹腐爛病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的cDNA序列，該基因開放閱讀框1 689 bp，編碼562個(gè)氨基酸，蛋白分子量62.7 kDa，房偉等[27]從海洋微生物中克隆到一個(gè)新型β-葡萄糖苷酶基因bgl1B，編碼449個(gè)氨基酸，蛋白分子量51.0 kDa，而陳輝等[28]克隆的斑玉蕈β-葡萄糖苷酶基因bgl1 cDNA全長(zhǎng)2 574 bp，編碼857個(gè)氨基酸，說明不同微生物來源的β-葡萄糖苷酶基因片段長(zhǎng)度存在較大差異。已知的大部分β-葡萄糖苷酶pI酸性范圍為3.5～5.5，VmGluI編碼的蛋白預(yù)測(cè)pI (4.64)也為酸性。經(jīng)Protparam預(yù)測(cè)VmGluI編碼的蛋白為分泌型蛋白，1～24位氨基酸為信號(hào)肽序列，推測(cè)該基因?qū)Σ≡那秩灸芰吞匦跃哂兄匾饔肹29]。

序列分析發(fā)現(xiàn)，VmGluI核苷酸序列與GenBank中提交序列相似性均不高，但其推導(dǎo)的氨基酸序列與蘋果和梨樹腐爛病菌β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列一致性分別為98.7%和87.8%，且與向日葵莖潰瘍病菌氨基酸序列相似性也高達(dá)71.0%，但這些序列均來自全基因組測(cè)序，未對(duì)β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行克隆和序列分析。VmGluI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因編碼的氨基酸序列與蘋果和梨樹腐爛病菌、向日葵莖潰瘍病菌的親緣關(guān)系最近，聚在一個(gè)單獨(dú)的分支；而與其他非植物病原真菌β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列相似性較低，均不足40%，說明β-葡萄糖苷酶基因編碼蛋白在植物病原真菌中具有相對(duì)保守性，但不同物種間存在很大的變異，從而使得其能在不同生物物種中發(fā)揮獨(dú)特功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，接種蘋果樹腐爛病菌的富士枝條組織中，VmGluI表達(dá)量顯著上調(diào)，表明在病原菌侵染過程中VmGluI起到了重要的作用，但該基因在離體和活體枝條中的表達(dá)水平和時(shí)序變化存在顯著差異。蘋果樹腐爛病菌接種離體枝條48 h后，VmGluI表達(dá)量開始顯著升高為對(duì)照的3.4倍，而活體枝條接種12 h后，基因表達(dá)水平已升高至對(duì)照的11.2倍，推測(cè)腐爛病菌侵染活體蘋果枝條要克服寄主的防御反應(yīng)，需分泌更多的β-葡萄糖苷酶用于分解植物細(xì)胞壁?；铙w枝條接種腐爛病菌24～48 h后，VmGluI的表達(dá)量急劇下降，分析可能是寄主與腐爛病菌互作競(jìng)爭(zhēng)時(shí)寄主的防御反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，抑制了VmGluI表達(dá)；接種72～96 h后，該基因表達(dá)量快速上升，說明腐爛病菌在寄主組織中已成功侵染，此時(shí)可觀察到明顯的發(fā)病癥狀。這與王彩霞等[30]和雍道敬等[31]的報(bào)道結(jié)果一致，富士愈傷組織和葉片接種蘋果樹腐爛病菌后1～2 d，多酚氧化酶、過氧化物酶等多種防御酶活性顯著升高并到達(dá)峰值，其可催化木質(zhì)素和酚類氧化產(chǎn)物的形成，加厚細(xì)胞壁，形成阻止病原菌入侵的機(jī)械屏障，隨接種時(shí)間延長(zhǎng)防御酶活性快速降低至對(duì)照水平。纖維素酶各酶組分單獨(dú)作用時(shí)效果不是很明顯，但當(dāng)其協(xié)同作用時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的分解活性[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種腐爛病菌的蘋果枝條中，VmGluI的表達(dá)量顯著低于木聚糖基因[9]，但VmGluI與其他纖維素酶基因表達(dá)是否存在協(xié)同作用，以及該基因的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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