趙 艷，翟 瑩，李珊珊，楊曉杰，劉麗麗

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蔗糖是大多數(shù)高等植物光合作用同化碳的主要運輸形式，是植物生長發(fā)育中碳水化合物的主要來源。在蔗糖的長距離運輸中涉及很多的復(fù)合體、轉(zhuǎn)運蛋白等，其中有研究表明，蔗糖結(jié)合蛋白也參與蔗糖的轉(zhuǎn)運[1]。楊艷等[2]從大豆中分離了2個蔗糖結(jié)合蛋白基因GmSBP2 和GmSBPL。生物信息學(xué)分析表明，GmSBP2 編碼489 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，GmSBPL編碼 504 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，且2個基因編碼的蛋白均定位于細(xì)胞膜上。顏克亮等[3]利用抑制性消減雜交技術(shù)和半定量PCR，發(fā)現(xiàn)蔗糖結(jié)合蛋白基因在種子胚中高表達(dá)。此外，對于蔗糖結(jié)合蛋白基因(sbp)的研究較少。

為深入了解大豆sbp基因的功能，對大豆sbp基因的組織表達(dá)方式及不同逆境下的表達(dá)情況進行研究。根據(jù)NCBI中大豆sbp基因序列，通過qRT-PCR方法，檢測sbp基因在大豆各組織中(根、莖、葉、花、種子)的相對表達(dá)量；在鹽、干旱、低溫、ABA處理條件下sbp基因的表達(dá)?？寺bp基因5′端上游942 bp的序列，該序列的調(diào)控活性繼續(xù)在轉(zhuǎn)基因煙草中進行研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大豆(吉豆2號)和煙草(NC89)為齊齊哈爾大學(xué)分子生物學(xué)實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)和EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)購自北京索萊寶公司；TRIzol reagent 購自Invitrogen公司；Oligo(dT)18、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Recombinant RNase Inhibitor、ExTaq、pMD18-T克隆載體、SYBP Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒、限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NcoⅠ均購自TaKaRa公司；X-gluc購自Sigma公司；引物合成、測序由北京六合華大基因公司完成。

1.2 大豆材料處理

逆境及激素條件下材料處理：將大豆水培幼苗分別置于含有NaCl (200 mmol/L) 和PEG8000(20%)的Hoaglands營養(yǎng)液中進行鹽和干旱脅迫處理；大豆幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理；對大豆水培幼苗噴施脫落酸(200 μmol/L，ABA)[4]。在處理0，1，2，5，10，24 h分別取樣，迅速放于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

各組織的取材：分別取大豆根、莖、葉、花、成熟種子，迅速放于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 qRT-PCR

根據(jù)RNA提取試劑盒步驟，提取大豆各種備用材料的總RNA；cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄的步驟分別合成第一條鏈，作為qRT-PCR反應(yīng)的模板。選用大豆β-tubulin基因(GMU12286)作為內(nèi)參基因，上、下游引物分別為5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′和5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′[5]。根據(jù)NCBI中大豆sbp基因的核苷酸序列(L06038.1)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計檢測該基因的引物，上游引物(QF：5′-AAGAGGAGGAAAGCCGTGAA-3′)和下游引物(QR：5′-GAATCAAAGTGGCGAGGAGA

C-3′)。利用BIO-RAD CFX96實時定量PCR儀，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s。每次取樣點設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，試驗共設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)[6]。

1.4 克隆啟動子序列及預(yù)測分析

選取大豆幼嫩葉片為材料，采用CTAB法，提取大豆基因組DNA[7]。依據(jù)大豆基因組序列(http：//www.phytozome.net/soybean)和NCBI中大豆sbp基因序列，設(shè)計特異引物擴增大豆sbp基因ATG的5′ 端上游序列942 bp，命名為SP。PCR擴增中的上游、下游引物分別帶有PstⅠ與NcoⅠ 酶切位點，上游引物為SF：5′-GGGCTGCAGGAATTTAACAGTGCGTCA

TATG-3′，下游引物為SR：5′-GGGCCATGGGGCTTG

GCAGTGAGGAACA-3′。PCR擴增的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸8 min，4 ℃保溫。用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴增片段，回收片段通過連接試劑盒連接到pMD18-T克隆載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-SP，雙酶切鑒定后測序。利用DNAMAN軟件，對克隆測序片段與大豆基因組中相應(yīng)片段進行同源性比對。啟動子預(yù)測分析軟件BDGP (http//：www.fruitfly.org/)和PlantCARE(http：//www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/signalscan.htmL)預(yù)測該啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點和順式作用元件。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化煙草

用PstⅠ和NcoⅠ 2個酶，分別雙酶切pMD18-T-SP質(zhì)粒和pCAMBIA1301載體，酶切pMD18-T-SP重組質(zhì)粒，得到小片段，酶切pCAMBIA1301載體得到大片段，將大、小片段進行連接，得到SP與gus基因融合的表達(dá)載體，命名為pCAM-SP。將pCAM-SP載體通過凍融法轉(zhuǎn)入到根瘤農(nóng)桿菌EHA105中。葉盤法轉(zhuǎn)野生型煙草，獲得T0轉(zhuǎn)基因煙草植株。對T0轉(zhuǎn)基因煙草植株進行潮霉素(Hyg)抗性篩選、PCR和RT-PCR分子檢測[8-9]，PCR檢測引物為SF(5′-GGGCTGCAGGAATTTAACAGTGCGTCATATG-3′)和UR(5′-CCCACACTTTGCCGTAATGAG-3′)，RT-PCR檢測引物為YF(5′-TTCTACACAGCCATCGGTCCA-3′)和YR(5′-TGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′)。同樣篩選、鑒定出陽性T1轉(zhuǎn)基因煙草。

1.6 GUS 組織化學(xué)染色

GUS 組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson等[10]的方法進行。陽性T1轉(zhuǎn)基因煙草的幼苗進行干旱處理，條件同處理大豆幼苗的方法；各種處理材料和各組織的收集同大豆幼苗的方法。將處理后的煙草葉片或取自不同組織的煙草葉片，放入GUS染色液中(50 mmol/L 磷酸緩沖液 (pH值7.0)，0.5 mmol/L K3(Fe(CN)6)，0.5 mmol/L K4(Fe(CN)6)，10 mmol/L EDTA，0.1%Triton X-100 和2 mmol/L X-gluc)，37 ℃染色12 h，之后材料先后用50%，75%，100%乙醇漂洗，至完全脫色。肉眼觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆sbp基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法，在干旱(PEG)、鹽(NaCl)、低溫(4 ℃)和激素(ABA)不同條件、不同時間處理下，對大豆sbp基因的相對表達(dá)量進行分析。結(jié)果顯示：大豆sbp基因在干旱脅迫下，隨著處理時間的延長，表達(dá)量逐漸升高，當(dāng)處理24 h，相對于沒有任何處理的對照，表達(dá)量為8.84，說明大豆sbp基因受干旱誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)表達(dá)量隨處理時間增強(圖1)。

大豆sbp基因在鹽脅迫處理下，相對于沒有任何處理的對照，當(dāng)處理為1.00 h，相對表達(dá)量下降80倍左右，以后的2，5，10，24 h處理時間下，相對表達(dá)量與處理1 h的表達(dá)量基本相同(圖2)。大豆sbp基因在低溫、ABA條件處理下，表現(xiàn)出與鹽脅迫處理下相似的規(guī)律(圖3，4)。說明大豆sbp基因受鹽、低溫、ABA誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)下降，下降的表達(dá)量不隨處理時間而變化。

圖1 干旱脅迫下大豆植株中sbp基因的表達(dá)Fig.1 Relative quantity of soybean sbp gene under drought treatment

圖2 鹽脅迫下大豆植株中sbp基因的表達(dá)Fig.2 Relative quantity of soybean sbp gene under salt treatment

2.2 大豆sbp基因的組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法，大豆β-tubulin基因為內(nèi)參，在大豆根、莖、葉、花、種子中，檢測sbp基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖5)：當(dāng)莖中的相對表達(dá)量為1.00時，大豆sbp基因在根、葉、花和種子中表達(dá)活性分別為0.13，15.17，4.88，680.84，種子中相對表達(dá)是根、莖、葉、花中表達(dá)量的45～5 237倍，可以看出，sbp基因在大豆根、莖、葉、花中的相對表達(dá)量低，而在大豆種子中的相對表達(dá)量較高。

圖3 低溫脅迫下大豆植株中sbp基因的表達(dá)Fig.3 Relative quantity of soybean sbp gene under cold treatment

圖4 ABA誘導(dǎo)大豆植株中sbp基因的表達(dá)Fig.4 Relative quantity of soybean sbp gene under ABA treatment

圖5 qRT-PCR檢測sbp基因在大豆各組織中的表達(dá)Fig.5 The expression of soybean sbp gene in tissues of soybean by qRT-PCR

2.3 啟動子SP序列的克隆

根據(jù)NCBI中大豆sbp基因的序列，及大豆基因組序列，擴增sbp基因ATG上游序列，獲得長度為942 bp的片段，命名為SP(圖6)。將SP片段連接到pMD18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-SP。從大腸桿菌菌液中提取質(zhì)粒，用PstⅠ和NcoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果得到與預(yù)期相符的片段(圖7)。利用DNAMAN軟件，對SP序列的測序結(jié)果與大豆基因組中相對應(yīng)的該段序列進行同源性比對，同源性達(dá)到100%，說明SP序列在不同大豆品種間無差別。

M.2 000 bp DNA Marker；1. PCR擴增產(chǎn)物SP。M.2 000 bp DNA Marker；1. PCR amplification of SP.

M.2 000 bp DNA Marker；1. 雙酶切鑒定。 M.2 000 bp DNA Marker；1. Enzyme digestion indentification.

2.4 大豆SP啟動子的預(yù)測分析

啟動子在線預(yù)測軟件分析結(jié)果表明，根據(jù)真核生物啟動子序列的特點及啟動子預(yù)測軟件分析，轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)為892 bp處的A。此外，在SP啟動子中，含有多種常出現(xiàn)在種子特異性啟動子中的元件，如對種子特異性表達(dá)基因的高水平表達(dá)具有重要作用的元件(RY-repeat)[11]，胚表達(dá)的順式作用元件(SEF3 motif和SEF4 motif)[12]，常出現(xiàn)在參與三?；视秃铣珊椭参锓N子特異表達(dá)基因的啟動子中的元件(E-box)[13]，種子特異表達(dá)的順式作用元件(Skn-1 motif、AATAAA、AACA和ACGT)[14-17]及與激素、逆境誘導(dǎo)相關(guān)元件，如ABRE(脫落素響應(yīng)元件)[18]、W-box(WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點)[19]、DOF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點[20](圖8)。

2.5 構(gòu)建表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因煙草檢測

雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-SP得到的小片段，與雙酶切pCAMBIA1301質(zhì)粒載體得到的大片段進行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌和雙酶切鑒定，獲得植物表達(dá)載體pCAM-SP(圖9)。通過凍融法，將重組質(zhì)粒pCAM-SP轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中(圖10)。通過葉盤法，侵染無菌苗煙草葉片，在含有5 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，待生根后轉(zhuǎn)移土壤中繼續(xù)生長。利用PCR法和RT-PCR法進行檢測，獲得陽性T1轉(zhuǎn)煙草植株7株。

圖8 SP啟動子序列中預(yù)測的順式作用元件Fig.8 Cis-elements of SP promoter

M.2 000 bp DNA Marker；1. pCAM-SP載體的雙酶切。M.2 000 bp DNA Marker；1. Enzyme digestion of pCAM-SP vector.

2.6 組織化學(xué)染色檢測

大豆sbp基因在大豆植株中受干旱誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)量隨處理時間增強(圖11)。繼續(xù)對轉(zhuǎn)化pCAM-SP的煙草植株進行干旱處理，如圖11所示，不同處理時間下，煙草葉片被染成藍(lán)色的程度不同，隨著處理時間增加染色程度增強，當(dāng)處理24 h時，葉片的染色程度最深，與sbp基因的表達(dá)趨勢相似。說明SP啟動子具有干旱誘導(dǎo)活性，且隨誘導(dǎo)時間的增長活性增加。

M.2 000 bp DNA Marker；1. 轉(zhuǎn)化pCAM-SP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的PCR檢測產(chǎn)物。M.2 000 bp DNA Marker；1. PCR products of transformed Agrobacterium with pCAM-SP vector.

相對于大豆根、莖、葉、花各組織，大豆sbp基因在種子中的相對表達(dá)量很高(圖5)。對轉(zhuǎn)化pCAM-SP的煙草植株的根、莖、葉、花和種子進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖12所示，煙草的根、莖、葉基本沒有被染色，而種子染色相對較深，說明SP啟動子具有種子表達(dá)特異性。

圖11 干旱脅迫不同時間下轉(zhuǎn)基因煙草葉片的GUS組織化學(xué)染色Fig.11 GUS histochemical assays in the transgenic tobacco leaves under drought with different treatment time

圖12 轉(zhuǎn)基因煙草各組織GUS組織化學(xué)染色Fig.12 GUS histochemical assays with the transgenic tobacco different tissues

3 結(jié)論與討論

本研究在大豆植株中對大豆sbp基因在不同逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)情況進行分析。大豆sbp基因在干旱處理下，表達(dá)呈上調(diào)趨勢，表達(dá)量在24 h達(dá)到最大值，是對照表達(dá)量的8.84倍，說明sbp基因受干旱上調(diào)誘導(dǎo)明顯。在鹽、低溫和ABA處理條件下，sbp基因的表達(dá)量均下降，說明sbp基因受鹽、低溫和ABA的下調(diào)誘導(dǎo)。以上現(xiàn)象可能與大豆sbp基因啟動子中存在逆境、激素誘導(dǎo)相關(guān)順式元件，及其位置有關(guān)。

本研究在大豆植株中對大豆sbp基因在各組織中的差異表達(dá)情況進行分析。sbp基因在大豆種子中相對表達(dá)活性很高，是根、莖、葉、花中表達(dá)量的45～5 237倍，可能與該時期蔗糖的積累、轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。從大豆sbp基因在各組織中的表達(dá)情況看，該基因為種子特異表達(dá)基因。繼續(xù)克隆sbp基因5′端上游的啟動子序列，基因的5′端上游序列中常含有許多的順式調(diào)控元件，往往可能位于距離ATG的5′端上游更遠(yuǎn)端，所以很多研究中在不明確有效啟動子序列時，通?？寺TG上游2 000 bp的序列，盡可能的包含了較多的調(diào)控元件(增強子等)。但是本研究中通過大豆基因組序列發(fā)現(xiàn)，sbp基因ATG上游1 000 bp以上為另一基因序列，因此，本研究中克隆了sbp基因ATG上游942 bp作為推測的啟動子序列。

本研究繼續(xù)在轉(zhuǎn)基因煙草中，對SP啟動子進行了干旱脅迫誘導(dǎo)和組織表達(dá)分析。通過GUS組織化學(xué)染色試驗，可以看出SP啟動子在煙草中具有干旱誘導(dǎo)表達(dá)活性，且隨著處理時間的增長活性增強；此外，SP啟動子在煙草中具有調(diào)控下游gus基因在種子中高表達(dá)的特性，說明SP啟動子兼具脅迫誘導(dǎo)型啟動子和種子特異性啟動子的特性，在轉(zhuǎn)基因大豆中，SP啟動子是否仍具有這兩方面的調(diào)控活性，仍需試驗繼續(xù)驗證。

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