王立亮，高春輝，吳一超，黃巧云，蔡鵬

大腸桿菌是人和動物胃腸道的主要兼性厭氧菌群，包括共生性和致病性2種類型，既能在人或動物宿主體內(nèi)存活，也能在環(huán)境中傳播[1]。致病性大腸桿菌在環(huán)境中的傳播嚴重威脅人和動物的健康，每年造成大量的感染和嚴重的經(jīng)濟損失[2]。糞肥和污水中的致病性大腸桿菌可經(jīng)土壤傳播到農(nóng)作物的根系或表面，進入食品產(chǎn)業(yè)鏈，威脅人體健康[3-5]。

環(huán)境中的大腸桿菌能吸附在各種生物（植物根系或葉片）和非生物（土壤顆粒）表面，形成生物膜以存活和傳播[1]。生物膜的形成過程主要包括以下5個步驟。1）初始吸附，通常是可逆過程[6-7]；2）緊密吸附，即微生物通過分泌DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及多糖等胞外聚合物，改變自身的生理生化狀態(tài)，與表面發(fā)生緊密結(jié)合，通常是不可逆吸附[8]；3）形成微菌落：微生物不斷分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substances,EPS），并形成一層凝膠層將細胞包裹在內(nèi)部區(qū)域[9]；4）生物膜的成熟：微菌落內(nèi)的細胞持續(xù)分泌EPS，最終形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的成熟生物膜；5）生物膜的解體：受環(huán)境因子和細胞性質(zhì)等因素的影響，部分微生物從生物膜中逃離，重新分散到外部環(huán)境中[10]。在生物膜形成的多步驟過程中，微生物在固相表面的初始吸附是其形成生物膜的關鍵，該過程包括了微生物對固相表面的“感知”以及初始吸附后細胞的“響應”，這一過程被稱為微生物的表面感應[11]。

本文重點介紹了環(huán)境微生物-大腸桿菌表面感應相關研究進展，期望能為土壤環(huán)境中病原微生物的控制提供理論依據(jù)，同時也能加深對土壤生物膜的認識，最終能揭開土壤中這些具有活性的生物膜的神秘面紗，深入理解土壤生物過程的本質(zhì)，從而更好地調(diào)控生物膜參與的養(yǎng)分循環(huán)和污染物降解等過程，保障土壤健康。

1 表面感應概念內(nèi)涵

細菌生物膜形成的第一步是細胞與固相表面接觸，但細菌如何知道它正在靠近或已經(jīng)吸附在固相表面的這種由懸浮態(tài)向吸附態(tài)轉(zhuǎn)換的過程，實際上依賴于細菌對表面的“識別”和“響應”，即“表面感應”[12]。細菌表面感應包含多種行為，在細菌與表面接近的過程中，可利用表面結(jié)構(gòu)（如鞭毛和菌毛）感知固相表面，通過胞內(nèi)信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)細胞運動性和表面性質(zhì)調(diào)控吸附。例如：副溶血性弧菌利用鞭毛感知表面，刺激scrABC系統(tǒng)中的質(zhì)膜蛋白ScrC，誘導c-di-GMP水平上升，抑制細胞運動并促進吸附[13-14]；變形桿菌的鞭毛感知表面后，鞭毛基質(zhì)蛋白FliL能通過UmoA調(diào)節(jié)子調(diào)控鞭毛監(jiān)管蛋白FlhD，控制細胞運動性[15]；枯草芽孢桿菌利用鞭毛感知表面，觸發(fā)DegS-DegU機械開關，影響枯草芽孢桿菌的吸附和生物膜的形成[16]；銅綠假單胞菌利用Ⅳ型菌毛（TFP）接受表面信號，TFP相關蛋白PilY1刺激c-di-GMP水平上調(diào)，抑制鞭毛運動，促進細胞進入生物膜狀態(tài)[11]。

2 大腸桿菌表面感應模式系統(tǒng)

大腸桿菌是自然環(huán)境和哺乳動物胃腸道中普遍存在的重要微生物，是研究細菌表面感應的重要模式系統(tǒng)，其中，細胞的表面結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號系統(tǒng)是影響大腸桿菌表面感應的主要因素。大腸桿菌能通過鞭毛、Ⅰ型菌毛和膜蛋白感知表面，通過雙組分系統(tǒng)控制細胞運動性和表面性質(zhì)（表面結(jié)構(gòu)、細胞分泌、表面電荷和疏水性），調(diào)控大腸桿菌在不同表面的吸附。

2.1 表面結(jié)構(gòu)

大腸桿菌在表面吸附的初始階段，細胞表面結(jié)構(gòu)如鞭毛、菌毛、脂多糖、膜蛋白等是影響細菌在表面吸附的主要因素[17]，環(huán)境因素如pH、離子強度和溫度也可通過表面結(jié)構(gòu)影響細菌在表面的吸附。

細菌鞭毛能幫助細胞克服環(huán)境中的流體作用力和細胞與表面間的靜電斥力，從而誘發(fā)初始吸附[18]；當細胞靠近表面，鞭毛旋轉(zhuǎn)受阻，結(jié)構(gòu)發(fā)生形變，鞭毛在細胞與表面間起到橋接作用[12]。由鞭毛介導的可逆吸附階段主要受環(huán)境因素（如pH、離子強度、溫度）和表面性質(zhì)（褶皺、疏水性）影響[18]。PRATT等[19]利用轉(zhuǎn)座子隨機插入法制備大腸桿菌突變體，篩選了聚氯乙烯（polyvinyl chloride,PVC）表面生物膜形成能力有缺陷的突變體菌株，發(fā)現(xiàn)有超過半數(shù)的突變體菌株有鞭毛功能缺陷，這暗示了鞭毛運動性與大腸桿菌生物膜形成密切相關，這可能是由于大腸桿菌必須依賴鞭毛運動才能靠近PVC表面，也可能因為鞭毛是大腸桿菌與PVC表面直接接觸的橋梁。WOOD等[20]制備大腸桿菌鞭毛突變株（fliA）和運動性缺陷突變株（motA），對比菌株形成生物膜的差異，發(fā)現(xiàn)運動性最好的野生型細胞成膜能力最強（≈43 μm厚，表面覆蓋率21%～34%），含有鞭毛結(jié)構(gòu)的運動性缺陷突變株motA成膜能力次之（≈13 μm厚，表面覆蓋率41%～58%），無運動性也沒有鞭毛結(jié)構(gòu)的突變株fliA成膜能力最差（表面覆蓋率小于5%）。這些結(jié)果證實了鞭毛運動性和結(jié)構(gòu)對大腸桿菌生物膜形成至關重要。

菌毛是大腸桿菌與表面在不可逆吸附階段起主要功能的細胞器，可促進細胞發(fā)生不可逆吸附[21]。大腸桿菌的Ⅰ型菌毛（主要由fim基因編碼的FimA菌毛蛋白組成，末端含有特異性吸附素FimH）和P型菌毛（主要由pap基因編碼的PapA菌毛蛋白組成，末端含有特異性吸附素PapG）在大腸桿菌初始吸附過程中起著重要作用。在大腸桿菌與PVC的吸附體系中，fim（Ⅰ型菌毛）基因突變株在PVC表面的成膜量較低，其主要原因是突變株在PVC表面的初始吸附量較少。Ⅰ型菌毛上的定位吸附蛋白-FimH既能誘導大腸桿菌與生物表面甘露糖的特異性結(jié)合，也能調(diào)控大腸桿菌在無機表面（如PVC）的非特異性吸附。這些結(jié)果表明，Ⅰ型菌毛是大腸桿菌在無機表面初始吸附過程中必不可少的組分[19,22]。在大腸桿菌與聚苯乙烯的吸附體系中，編碼菌毛的csgA基因突變株成膜量顯著降低，ompR基因突變株顯著提高csgA表達量，表明菌毛是大腸桿菌在惰性表面形成生物膜的關鍵結(jié)構(gòu)，且受EnvZ-OmpR雙組分系統(tǒng)調(diào)控[23]。

除了細胞膜外部結(jié)構(gòu)，一些鑲嵌在細胞膜上的跨膜蛋白也能調(diào)節(jié)細胞吸附，膜蛋白在表面結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)信號系統(tǒng)間傳遞信號。通過雙向電泳發(fā)現(xiàn)，吸附在涂有金膜石英晶體表面的大腸桿菌OmpA、OmpX、Slp和TolC等4種膜蛋白表達量下調(diào)，ompX突變株提高了細胞Ⅰ型菌毛和胞外多糖的表達量，降低了細胞運動性[24]。外膜脂蛋白NlpE能通過誘導Cpx系統(tǒng)響應表面吸附引發(fā)的細胞膜擾動，激活細菌對無機疏水性表面的響應。例如，在大腸桿菌K-12與玻璃珠混合的體系中，cpxR與nlpE突變株在玻璃表面的吸附量顯著降低，約為野生型菌株吸附量的1/3；在吸附4 h的過程中，野生型大腸桿菌表達了大量的CpxR蛋白，而cpxR與nlpE突變株幾乎不表達CpxR蛋白，表明NlpE蛋白能通過激活Cpx系統(tǒng)刺激大腸桿菌在玻璃表面的吸附[25]。

脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁最外層的一層較厚（8～10 nm）的類脂多糖類物質(zhì)，由類脂A、核心多糖和O-特異側(cè)鏈組成[26]。LPS能將細胞固定在距離表面20 nm處的位置，并在細胞與表面之間形成氫鍵[27]。LPS也能通過調(diào)控細胞表面疏水性影響細胞對不同表面的吸附性。LPS有2種形態(tài)：A-LPS和B-LPS。A-LPS提高細胞表面疏水性，B-LPS提高細胞表面親水性。B-LPS含量越高，細胞對親水性玻璃表面的吸附量就越高。A-LPS和B-LPS的相對含量受環(huán)境因子控制，通過改變細胞表面性質(zhì)可以選擇合適的表面以供吸附，有助于細菌在環(huán)境中的存活[28]。LPS缺失，則降低了大腸桿菌在無機表面的吸附能力[29]。例如：在大腸桿菌K-12與聚苯乙烯的吸附體系中，細胞表面LPS結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變降低了菌株的吸附量（約為野生型菌株吸附量的50%～80%）；細胞在軟瓊脂平板上的運動性實驗也表明，LPS突變株的運動性顯著低于野生型菌株；利用斑點印跡法分析野生型和LPS突變株的Ⅰ型菌毛的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)LPS突變株的Ⅰ型菌毛含量只有野生型細胞的20%～60%。這些結(jié)果表明，LPS能通過影響Ⅰ型菌毛的產(chǎn)量和細胞運動性影響大腸桿菌在聚苯乙烯表面的吸附[29]。

胞外聚合物（EPS）是大腸桿菌生物膜的主要組分，在大腸桿菌生物膜的形成過程中具有重要作用。大腸桿菌與表面的吸附能促進EPS的分泌，但EPS對初始吸附和生物膜形成的影響卻不同。莢膜異多糖酸是大腸桿菌EPS的主要組分。DANESE等[30]檢測了野生型大腸桿菌K-12和莢膜異多糖酸突變株在PVC表面的吸附量，發(fā)現(xiàn)二者吸附量沒有顯著差異；進一步利用熒光顯微鏡觀察野生型大腸桿菌K-12和莢膜異多糖酸突變株生物膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)莢膜異多糖酸突變株的生物膜只有薄薄的一層，且表面沒有復雜的三維結(jié)構(gòu)。

2.2 細胞密度

除了細胞表面結(jié)構(gòu)，細胞密度（懸浮密度和沉積密度）也能影響細胞在表面的吸附。大腸桿菌的懸浮密度通常在1.06～1.13 g/mL之間，此時懸浮液中的細胞緩慢向固體表面沉積[31]。當大腸桿菌進入穩(wěn)定期，細胞懸浮密度增加，促進細胞在表面上的快速聚集[32]。MAUTER等[33]通過改變離子強度控制大腸桿菌K-12在石英柱表面上的沉積密度，運用基因芯片和代謝組學技術測量了不同沉積密度對大腸桿菌吸附過程中基因表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離子強度越高，大腸桿菌吸附量越高，細胞沉積密度也越高；細胞沉積密度越高，大腸桿菌中琥珀酸、脯氨酸、焦谷氨酸和色氨酸的催化基因含量越低，導致胞內(nèi)的代謝物濃度越高；在高沉積密度條件下，吸附態(tài)細胞的菌毛含量比懸浮態(tài)細胞高出了約4倍；色氨酸的代謝產(chǎn)物能作為群體感應的信號調(diào)節(jié)大腸桿菌的運動性，表明表面細胞沉積密度能通過改變大腸桿菌的代謝強度、群體感應和表面結(jié)構(gòu)影響細菌在無機表面的吸附。

2.3 胞內(nèi)雙組分信號系統(tǒng)

胞內(nèi)信號系統(tǒng)主要通過改變細胞表面結(jié)構(gòu)和響應環(huán)境壓力2種方式調(diào)控表面感應。調(diào)控大腸桿菌表面感應的系統(tǒng)主要是Cpx、Rcs和EnvZ-OmpR雙組分系統(tǒng)。雙組分系統(tǒng)是細菌的“神經(jīng)中樞”，是最先感應到環(huán)境信號的組分，主要由位于內(nèi)膜上的組氨酸激酶（histidine kinases,HK）和胞內(nèi)的反應調(diào)節(jié)子（response regulator,RR）組成。當HK檢測到環(huán)境信號，首先自磷酸化，然后將磷酸基傳遞給RR，誘導一系列下游基因表達變化[34]。

調(diào)控菌毛的表達量是胞內(nèi)信號系統(tǒng)調(diào)控表面感應的重要途徑（圖1）。Cpx系統(tǒng)中的CpxR蛋白是csgA的負調(diào)節(jié)因子，cpxA基因能通過CpxR的去磷酸化增加csgA轉(zhuǎn)錄水平，提高菌毛表達量[35]；Rcs系統(tǒng)能調(diào)節(jié)csgDEFG的表達，RcsA和RcsB能激活csgD，抑制csgBA的表達，從而降低菌毛合成[36]；EnvZOmpR系統(tǒng)中的OmpR蛋白能與csgD啟動子結(jié)合刺激其轉(zhuǎn)錄，CsgD激活編碼菌毛的csgBA啟動子，提高菌毛表達量[37]。不同信號系統(tǒng)也能互相影響，OmpR只能特異性的與csgD啟動子結(jié)合，而CpxR能與多個位點結(jié)合，當CpxR的識別位點與csgDOmpR結(jié)合位點重疊時，能抑制菌毛表達[38]。

圖1 大腸桿菌表面感應模型Fig.1 Model of Escherichia coli surface sensing

胞內(nèi)信號系統(tǒng)也能通過響應環(huán)境壓力（滲透壓、pH）調(diào)控表面感應（圖1）。當環(huán)境pH高于7.4，Cpx系統(tǒng)能激活virF基因，提高IpaBCD蛋白含量，促進細菌入侵宿主細胞；當pH低于6.0，virF的表達受到抑制[39]。大腸桿菌K-12在微量滴定板上的生物膜量隨滲透壓的升高而降低。相對于低滲透壓環(huán)境，在高滲透壓條件下CpxR蛋白合成量提高40%，總CpxR蛋白磷酸化水平從25%提高到超過50%，表明Cpx系統(tǒng)可以從轉(zhuǎn)錄和翻譯2個水平響應滲透壓變化[38]。

胞內(nèi)信號系統(tǒng)對環(huán)境壓力的響應和對表面結(jié)構(gòu)的調(diào)控是一個互相聯(lián)系的網(wǎng)絡。在低滲透壓條件下，OmpR和H-NS激活csgD轉(zhuǎn)錄，Rcs系統(tǒng)中的RcsB抑制csgD表達；在高滲透壓條件下，CpxR磷酸化水平上升1倍，抑制csgD的表達，而H-NS仍能激活csgD[38]；EnvZ-OmpR系統(tǒng)中的OmpA蛋白能感應滲透壓變化，通過Cpx系統(tǒng)抑制纖維素產(chǎn)物，并提高大腸桿菌成膜量[40]；通過抑制表面蛋白OmpX的產(chǎn)量可降低細胞表面疏水性和電負性，抑制EPS產(chǎn)量并增強細胞的群集運動，增強細胞對抗生素（丁胺卡那霉素、頭孢菌素、慶大霉素、新生菌素和萘啶酸）的抗性，促進細胞在疏水性無機表面的吸附[41]。

3 展望

大腸桿菌的表面感應是一個復雜的、多步驟的、互相協(xié)調(diào)的過程，通過一套復雜的系統(tǒng)調(diào)控生物膜的形成。目前已知大腸桿菌的菌毛和鞭毛能感知表面，但其他表面結(jié)構(gòu)是否具有感知表面的能力還不得而知；而且胞內(nèi)雙組分系統(tǒng)如何改變表面結(jié)構(gòu)，特別是從細胞接收信號到改變細胞行為這一過程，具體的機制仍然未知；多重調(diào)控系統(tǒng)共存時，系統(tǒng)間的互作及對表面感應的影響也不清楚，這些工作是大腸桿菌表面感應研究今后需著重解決的主要科學問題[42-43]。對于土壤系統(tǒng)，由于其固相組成復雜，影響大腸桿菌存活和傳播的因子眾多，從生物學角度去理解大腸桿菌對土壤組分的表面感應機制還是空白，這也是值得土壤學工作者今后研究的方向。

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