趙雅清, 付冬梅, 劉艷芳, 梁鑫淼, 薛慧清*

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué), 基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太原 030001; 2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116021)

中醫(yī)藥學(xué)凝聚了中華民族幾千年的健康養(yǎng)生理念與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),是中國古代科學(xué)的珍寶,深入研究中醫(yī)藥學(xué)對于推動生命科學(xué)以及醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展意義深遠(yuǎn)。然而,由于中藥成分的復(fù)雜性,從常量成分(mg/g)到微量組分(pg/g)通常包含上百種化合物,因此對中藥組分的分離、分析是當(dāng)前中藥分析領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。對于中藥復(fù)雜樣品的分離,傳統(tǒng)的一維色譜法往往不能提供足夠的分辨率和峰容量,色譜峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重;而通過串聯(lián)兩種或兩種以上不同分離機(jī)制的色譜柱,構(gòu)建多維色譜分離系統(tǒng),則可以極大地提高對復(fù)雜中藥樣品的分離能力[1]。

與一維液相色譜法相比,二維液相色譜法(2D- LC)具有更高的峰容量以及分離度,對復(fù)雜體系以及低含量物質(zhì)的分離有明顯的優(yōu)勢[2]。二維色譜有離線和在線兩種方式。與離線模式相比,在線模式在技術(shù)上仍存在一定的挑戰(zhàn),如流動相的兼容性、分離速度的兼容性、一維與二維洗脫強(qiáng)度的兼容性等問題[3,4]。離線二維色譜法適用成本低,溶劑選擇性廣,峰容量大[5],每一維的分離條件可獨(dú)立優(yōu)化,同時(shí)第二維沒有分析時(shí)間的限制,在優(yōu)化的條件下能夠達(dá)到最佳的分離能力,且不受流動相兼容問題的影響[6]。

目前,隨著色譜柱填料類型的多樣化、商品化,以及高壓/超高壓液相色譜系統(tǒng)的出現(xiàn)和數(shù)據(jù)軟件的完善,建立二維液相色譜方法更加簡便,應(yīng)用范圍更廣[7]?；谥苽湫鸵合嗌V的中藥化學(xué)組分制備技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[8]。Jin等[9]利用C3和C18色譜柱構(gòu)建2D- LC系統(tǒng),對忍冬的各成分進(jìn)行了分離制備,結(jié)果獲得了純度大于99%的7個(gè)化合物。Fan等[10]建立了2D- 正相液相色譜/反相液相色譜方法分離制備甘草中的黃酮類化合物,共得到24個(gè)高純度化合物。賈有梅等[11]建立了親水/反向二維液相制備色譜分離純化絡(luò)石藤中化學(xué)成分的方法,最終得到14個(gè)高純度化合物。Li等[12]應(yīng)用離線二維液相色譜對蓽撥中的化學(xué)成分進(jìn)行分離,最終得到25個(gè)生物堿化合物。Guo等[13]使用XUnion C18與XAmide色譜柱構(gòu)建離線二維色譜,對三七葉子的25個(gè)一維目標(biāo)流分進(jìn)行分離,最終得到8個(gè)皂苷成分。二維液相色譜對樣品有預(yù)處理、分離的功能,能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高峰容量,越來越多地運(yùn)用于中藥成分的分離分析[14]。鑒于離線二維色譜不涉及二維色譜之間的閥切換,對儀器要求不高,對復(fù)雜樣品具有較好的分離能力和分辨率,本文選用巴天酸模作為模型中藥建立離線二維液相色譜分離體系。

巴天酸模(RumexpatientiaL.),蓼科酸模屬植物,中藥土大黃的植物來源之一,具有化痰止咳、清熱通便、涼血止血、燥濕殺蟲止癢等功效[15],富含蒽醌、單寧、萘及萘醌衍生物[16]。劉景等[17]應(yīng)用硅膠柱色譜、Sephadex LH- 20分離純化巴天酸模根的化學(xué)成分,得到大黃酚- 8-O-β- D- 葡萄糖苷、大黃素- 6-O-β- D- 葡萄糖苷、大黃素甲醚- 8-O-β- D- 葡萄糖苷等7個(gè)單體化合物。迄今為止,對巴天酸模的分離仍采用硅膠柱層析等傳統(tǒng)方法。

本文建立了反相/反相離線二維色譜分離系統(tǒng),通過優(yōu)化色譜柱類型和流動相條件,對巴天酸模根提取液乙酸乙酯萃取層一維分離的18個(gè)流分分別進(jìn)行進(jìn)一步的二維分析。本方法的建立為快速、有效地從巴天酸模根中制備標(biāo)準(zhǔn)品、篩選活性組分以及對潛在微量活性化合物的制備提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng),包括四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)、2998光電二極管陣列檢測器、2489雙波長檢測器和Empower工作站(美國Waters公司);環(huán)氧四氮唑色譜柱(250 mm×4.6 mm, 7 μm,批號:R2016053003,實(shí)驗(yàn)室自制); Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 7 μm,批號:Z2013040901,華譜新創(chuàng)科技有限公司);甲酸(色譜純)購自美國Acros公司;甲醇(色譜純)、石油醚(分析純)和乙酸乙酯(分析純)購自天津科密歐公司;超純水由Milli- Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備得到。

藥材巴天酸模于2015年6月18日采自北京市延慶區(qū)井莊鄉(xiāng)馮家廟村南通往蓮花灘村的馬路兩側(cè),經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為蓼科植物土大黃(巴天酸模屬)。

1.2 樣品的前處理

取巴天酸模根部藥材粉碎,精密稱取藥材粉末10 g置于燒瓶中,依次用100、80、60 mL的95%乙醇分別超聲提取,每次1 h,合并濾液(記為BTS- 醇),減壓濃縮至不含乙醇,溶于150 mL水,依次用150 mL的石油醚、乙酸乙酯萃取,得到石油醚層(標(biāo)記為BTS- PE)、乙酸乙酯層(標(biāo)記為BTS- ET),萃取完剩余水層標(biāo)記為BTS- 水。將各萃取液減壓濃縮、冷凍干燥后,稱取5～8 mg樣品,加甲醇溶解,過0.45 μm微孔濾膜,作為分析樣品。取乙酸乙酯萃取得到的分析樣品,配制質(zhì)量濃度為103.38 g/L的溶液,過0.45 μm微孔濾膜,作為一維分離的樣品。

1.3 巴天酸模根提取液各萃取層的HPLC分析

用Waters 2695- 2998色譜系統(tǒng)分別對BTS- 醇、BTS- PE、BTS- ET和BTS- 水4個(gè)樣品進(jìn)行分析,采用Unitary C18柱(250 mm×4.6 mm)作為分析柱,流動相由0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B)組成。梯度洗脫條件:0～5 min, 5%B; 5～45 min, 5%B～95%B; 45～50 min, 95%B。流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃,檢測波長:210～400 nm,進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 二維分離條件

1.4.1一維色譜

用Waters 2695- 2489色譜系統(tǒng)對巴天酸模根乙酸乙酯層進(jìn)行分離,采用環(huán)氧四氮唑色譜柱(250 mm×4.6 mm),流動相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。梯度洗脫條件:0～5 min, 25%B; 5～50 min, 25%B～90%B; 50～55 min, 90%B。流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:266 nm;上樣量:30 μL。按峰收集流分F1～F18,共制備3次,合并相同流分,分別濃縮至約1 mL。

1.4.2二維色譜

用Waters 2695- 2998色譜系統(tǒng)對一維流分F1～F18進(jìn)行分析,采用Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm),流動相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B);梯度洗脫條件:0～5 min, 25%B; 5～50 min, 25%B～90%B; 50～55 min, 90%B。流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:210～400 nm;上樣量:20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 巴天酸模根各萃取層的HPLC分析

對藥材的4個(gè)萃取層BTS- 醇、BTS- PE、BTS- ET和BTS- 水按照1.3節(jié)條件分別進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果見圖1。

圖 1 巴天酸模根提取液各萃取層樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of extracts of root of Rumex patientia L. sample with different solvents Column: Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 7 μm). Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) methanol. Gradient elution: 0-5 min, 5%B; 5-45 min, 5%B-95%B; 45-50 min, 95%B. Detection wavelength: 210-400 nm. Injection volume: 10 μL. Flow rate: 1. 0 mL/min.

從圖1中可以看出,巴天酸模根乙醇提取液成分復(fù)雜,涵蓋藥材中中等極性及弱極性成分;通過石油醚萃取,巴天酸模根提取液中大部分弱極性成分被分離出;乙酸乙酯層保留了巴天酸模根提取液大部分的中等極性成分;水層中可能保留一些沒有紫外吸收的單糖和寡糖類成分,需要通過其他途徑進(jìn)一步分析。鑒于乙酸乙酯層中涵蓋了乙醇提取液的大部分組分,且萃取的目標(biāo)物含量高,因此選擇對乙酸乙酯層進(jìn)行第二維色譜分析。

2.2 色譜柱的選擇及其保留特性的比較

在前期研究中,制備了一種苯基與四唑基鍵合在二氧化硅上的環(huán)氧四氮唑固定相材料,與常規(guī)C18材料具有不同的選擇性與保留特性。在此基礎(chǔ)上,本研究分別選用環(huán)氧四氮唑與Unitary C18材料裝填的色譜柱,對巴天酸模根的乙酸乙酯提取液進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2。

圖 2 巴天酸模根乙酸乙酯萃取液在(a)環(huán)氧四氮唑和(b)Unitary C18色譜柱上的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of ethyl acetate extract of root of Rumex patientia L. on (a) phenyl/tetrazolium column and (b) Unitary C18 column a. Column: phenyl/tetrazolium (250 mm×4.6 mm, 7 μm). Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) methanol. Gradient elution: 0-5 min, 10%B-25%B; 5-45 min, 25%B-90%B; 45-55 min, 90%B. Detection wavelength: 266 nm. Injection volume: 10 μL. Flow rate: 1. 0 mL/min. b. Column: Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 7 μm). Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) methanol. Gradient elution: 0-5 min, 15%B; 5-50 min, 15%B-75%B; 50-55 min, 75%B. Detection wavelength: 266 nm. Injection volume: 10 μL. Flow rate: 1. 0 mL/min.

在圖2a中環(huán)氧四氮唑色譜柱上2、3號色譜峰未分離,在圖2b中Unitary C18色譜柱上基線分離。在環(huán)氧四氮唑色譜柱上分離得到的6～15號峰的出峰順序在Unitary色譜柱上均有所改變,說明環(huán)氧四氮唑和Unitary C18這兩種材料對樣品的選擇性不同,可以互補(bǔ)來構(gòu)建分離效果較好的二維色譜系統(tǒng)。本文中利用環(huán)氧四氮唑色譜填料和C18鍵合色譜填料制作的不同色譜柱來構(gòu)建離線二維色譜分離體系。為了方便后續(xù)的制備,采用了甲醇和水(含0.1%(v/v)甲酸)作為流動相優(yōu)化分離條件,流動相體系簡單,沒有鹽的引入,避免了脫鹽處理。

圖2a色譜圖峰形簡單,峰的重疊現(xiàn)象少,在上樣量較大的一維制備中峰之間重合的可能性低,因此,選用環(huán)氧四氮唑作為一維色譜分離材料。第二維色譜分析需要色譜柱具有更好的分離效果,而圖2b色譜圖峰間距小,峰多且雜,選擇Unitary C18作為二維色譜的分析柱,能夠得到更多的樣品信息。

2.3 巴天酸模根乙酸乙酯萃取液的一維色譜分離

在構(gòu)建反相/反相二維色譜系統(tǒng)中,選擇環(huán)氧四氮唑作為一維分離色譜柱。在上樣量大的情況下,一些含量低的成分峰在制備譜圖中比較明顯,因此,實(shí)際接取流分的數(shù)量與分析譜圖中峰的數(shù)量存在差異。按色譜峰接取流分,得到18個(gè)流分,分別為F1～F18(見圖3)。

圖 3 巴天酸模根乙酸乙酯萃取液一維分離的色譜圖Fig. 3 First dimensional chromatogram of ethyl acetate extract of root of Rumex patientia L. Column: phenyl/tetrazolium (250 mm×4.6 mm, 7 μm). Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) methanol. Gradient elution: 0-5 min, 25%B; 5-50 min, 25%B-90%B; 50-55 min, 90%B. Detection wavelength: 266 nm. Injection volume: 30 μL. Flow rate: 1. 0 mL/min.

圖 4 巴天酸模根一維色譜10個(gè)流分的二維分離色譜圖Fig. 4 Second dimensional chromatograms of ten fractions abstracted from the root of Rumex patientia L. with first dimensional chromatography Column: Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 7 μm). Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) methanol. Gradient elution: 0-5 min, 25%B; 5-50 min, 25%B-90%B; 50-55 min, 90%B. Detection wavelength: 210-400 nm. Injection volume: 20 μL. Flow rate: 1. 0 mL/min.

2.4 一維流分的二維色譜分析

為了對分析對象進(jìn)行更加全面的分析,選擇二維色譜分離系統(tǒng)對一維制備得到的F1～F18流分進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析,部分結(jié)果見圖4。可以看出,一維流分F2、F3、F5、F6、F8、F9、F10、F11、F12和F16在進(jìn)一步的二維色譜分析中均得到多個(gè)色譜峰,有效地增加了巴天酸模根液相色譜分離的峰容量。其中,F6、F9、F10和F12這4個(gè)流分均得到較純的化合物色譜峰(如圖4虛線標(biāo)識所示),可以進(jìn)行制備得到純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了離線二維反相/反相液相色譜分離系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對巴天酸模根乙酸乙酯提取液化學(xué)成分的有效分離,并有望得到高純度的標(biāo)準(zhǔn)品。本實(shí)驗(yàn)提供的二維分離方法高效、可行,為巴天酸模藥材的微量組分的分離和活性化合物的篩選提供了技術(shù)支撐。

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