顧 奕, 郭 明,*, 呂 達(dá), 侯 平, 殷欣欣

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江 杭州 311300; 2. 浙江農(nóng)林大學(xué)理學(xué)院, 浙江 杭州 311300)

全氟化合物(perfluorinated compounds, PFCs)是一類新型有機(jī)污染物,主要包括全氟羧酸類(perfluorocarboxylic acids, PFCAs)、全氟磺酸類(perfluorinated sulfonic acids, PFSAs)和調(diào)聚醇類(fluorotelomer alchols, FTOHs)化合物等[1]。全氟化合物具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、高表面活性及特有的疏水疏油性[2],被廣泛用于食品包裝材料中[3,4]。該類物質(zhì)的C-F共價(jià)鍵具有極高的化學(xué)鍵能,使其普遍難以光解、水解、生物降解,因此多數(shù)全氟化合物具有環(huán)境持久性[5,6]。PFCs還具有生物累積性,可隨著食物鏈的富集而聚集于人體中[7,8],且半衰期長,除了對人體肝臟、心臟、肺[9]等多種器官具有危害外,還具有神經(jīng)[10]、免疫[11]、內(nèi)分泌[12]毒性,嚴(yán)重威脅人類健康[13]。為此,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2016年禁止在食品接觸材料中使用長鏈全氟化合物(單全氟烷基或雙全氟烷基磷酸酯二乙醇胺鹽、戊酸- 4,4- 雙[(γ-ω- 全氟C8-20烷基)硫基]衍生物- 二乙醇胺化合物、磷酯酸的全氟烷基替代物)。全氟辛酸[14](pentadecafluorooctanoic acid, PFOA, C8HF15O2)是全氟化合物的典型代表,幾乎涵蓋了上述全部特點(diǎn),是生態(tài)毒理學(xué)研究關(guān)注的熱點(diǎn)之一。PFOA通過消化道的吸收、代謝作用進(jìn)入血液循環(huán)后,經(jīng)體液輸運(yùn)到達(dá)人體受體部位而發(fā)揮毒理作用,這與血漿的貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)功能密不可分,而血清白蛋白是血漿中最豐富的載體蛋白,血漿對外來物質(zhì)的載運(yùn)功能主要由其承擔(dān)[15]。因此,研究PFOA與血清白蛋白的相互作用可以在分子水平上認(rèn)識PFOA與蛋白質(zhì)作用的結(jié)合與載運(yùn)機(jī)制和規(guī)律,有助于全面了解人血清白蛋白(HSA)- PFOA的互作機(jī)制和PFOA的毒理作用。然而,從文獻(xiàn)報(bào)道來看,目前對PFOA在環(huán)境中的分布、遷移轉(zhuǎn)化、生物富集、宏觀整體水平毒理上[16,17]的研究較為集中,雖有利用熒光光譜技術(shù)研究PFOA與牛血清白蛋白相互作用的相關(guān)報(bào)道[18],但從分子水平角度探究PFOA的環(huán)境毒理作用還需進(jìn)行深入研究,完善分析方法。因此研究PFOA與蛋白質(zhì)相互作用的分析方法并構(gòu)建PFOA與蛋白質(zhì)相互作用的研究體系極有必要。

目前已有許多技術(shù)在分子水平研究污染毒物與生物大分子(如蛋白質(zhì)、DNA、酶等)的相互作用,包括平衡透析法、超濾法、光譜技術(shù)、色譜法等[19]。相較而言,色譜法在研究相互作用的同時(shí)還能對復(fù)雜體系進(jìn)行分離以減少共存化合物的干擾作用,而毛細(xì)管電泳除了具有色譜法的優(yōu)點(diǎn)外,在模擬生理環(huán)境以維持生物介質(zhì)活性方面更具優(yōu)勢,它具有應(yīng)用范圍廣、分離效率高、分離模式多、檢出限低等特點(diǎn)[20],已成功用于研究一些模型生物大分子與小分子之間的相互作用。如李玉娟等[21]利用毛細(xì)管電泳研究了丹參活性分子與牛凝血酶的相互作用;Zhou等[22]研究了苯二氮卓類藥物氯氮平與HSA之間的相互作用。但從文獻(xiàn)來看,毛細(xì)管電泳法在生物大分子與小分子相互的作用機(jī)制研究主要集中在酶、多肽等物質(zhì),與蛋白質(zhì)的相互作用研究也主要集中于藥物- 蛋白質(zhì)體系,對蛋白質(zhì)與重金屬離子[23]、有機(jī)污染物[24]等小分子污染物的研究還處于上升階段。

本文將構(gòu)建PFOA- HSA相互作用體系,采用多種毛細(xì)管電泳應(yīng)用模式:淌度移動(dòng)法、區(qū)段- 區(qū)段動(dòng)力學(xué)法(plug- plug kinetic, PPK法)、簡化的Hummel- Dreyer (HD)法進(jìn)行PFOA和HSA之間的研究,得到結(jié)合反應(yīng)的相應(yīng)參數(shù),同時(shí)分析對比所得結(jié)果,從而建立分析PFOA- HSA相互作用的最適方法。相關(guān)結(jié)果可為進(jìn)一步研究PFOA及其他全氟類化合物的毒性機(jī)理提供一定的理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀、未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(60 cm×50 μm,有效長度50 cm)(美國貝克曼庫爾特公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申科科技有限公司); DF- 101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;KQ- 250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司); 1810D自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海申生科技有限公司);分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);一次性使用無菌注射器(2.5 mL,圣光醫(yī)用制品有限公司);微孔濾膜0.45 μm。

NaOH(批號20150310,含量≥96.0% )、Na2HPO4512H2O(批號20160219,含量≥99.0% )、NaH2PO452H2O(批號20151020,含量≥99.0% ),均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PFOA(純度90% , 英國Fluorochem公司);二甲苯類化合物(xylenes,批號EJ140079,純度99% ,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司);芐胺(benzylamine, C7H9N,批號ED050140,純度98% ,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司);氧化鋁(Al2O3,中性,批號F20020726,中國醫(yī)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑公司);鹽酸(含量36% ～38% ,永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司);HSA(純度96% ～99% ,美國Sigma公司);丙酮(分析純,杭州雙林化工試劑廠);N,N- 二甲基甲酰胺(DMF, HCON(CH3)2,批號20131122,含量≥99.5% ,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1PFOA衍生反應(yīng)

使用PPK法和簡化的HD法進(jìn)行測定時(shí),需要以PFOA的光譜吸收值作為檢測指標(biāo)。由于PFOA沒有特征紫外吸收譜,因此需要對其進(jìn)行衍生反應(yīng),參考文獻(xiàn)[25],對PFOA進(jìn)行如下酰胺化衍生反應(yīng):

取PFOA 0.54 g、中性氧化鋁0.08 g,加衍生化試劑(芐胺與二甲苯體積比為1∶2)12 mL,在140 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)10 h,抽濾除去氧化鋁。濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除二甲苯和水后,加入10%鹽酸20～30 mL至有固體析出,抽濾并用水沖洗,干燥得產(chǎn)物CF3(CF2)6COHNCH2ph。

1.2.2CE運(yùn)行緩沖液及樣品溶液的配制

配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液(溶液A)和0.2 mol/L NaH2PO4溶液(溶液B),取81 mL溶液A與19 mL溶液B定容于1 000 mL容量瓶中,即配成pH 7.4的0.02 mol/L磷酸緩沖液。

稱取0.103 5 g PFOA,用pH 7.4的磷酸緩沖液定容于25 mL容量瓶中,獲得1×10-2mol/L PFOA母液。準(zhǔn)確量取不同體積的PFOA母液,用pH 7.4磷酸緩沖液稀釋至所需濃度((10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)×10-5mol/L)(參考文獻(xiàn)[26]中PFOA在人血清中的富集濃度進(jìn)行配制),即配制成各濃度梯度的運(yùn)行緩沖液。將上述溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾兩次并脫氣5 min,備用。

以空白磷酸緩沖液配制1.0×10-5mol/L HSA溶液,加入5%(體積分?jǐn)?shù))丙酮[27](檢測電滲流和遷移時(shí)間的重復(fù)性)混勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾兩次并脫氣5 min,備用。

稱取0.062 8 g PFOA衍生物,以pH 7.4磷酸緩沖液配制成5×10-3mol/L母液,精密移取不同體積母液,用pH 7.4磷酸緩沖液稀釋至所需濃度((10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)×10-5mol/L),即配制成各濃度梯度的PFOA衍生物樣品溶液。將上述溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾兩次并脫氣5 min,備用。

以空白磷酸緩沖液配制1.0×10-3mol/L、1.0×10-5mol/L的HSA樣品溶液,以0.45 μm微孔濾膜過濾兩次并脫氣5 min,備用。

1.2.3PFOA- HSA體系相互作用方法的建立

實(shí)驗(yàn)前用0.1 mol/L NaOH、二次蒸餾水、空白緩沖液分別沖洗毛細(xì)管5 min,隨后用相應(yīng)的運(yùn)行緩沖液分別沖洗5 min;實(shí)驗(yàn)中每兩次運(yùn)行測定程序間用0.1 mol/L NaOH、二次蒸餾水及運(yùn)行緩沖液沖洗毛細(xì)管5 min,各梯度分別測定3次,求平均值。

淌度移動(dòng)法 以含不同濃度的PFOA溶液作為運(yùn)行緩沖液,以含有丙酮的HSA為測試樣,進(jìn)行淌度移動(dòng)法測定。電泳條件:柱溫25 ℃;壓力進(jìn)樣3 447.4 Pa×3 s;分離電壓15 kV;分離時(shí)間15 min;檢測波長214 nm。

PPK法 方法分3組進(jìn)樣,前兩組電壓相同,第三組改變電壓。電泳條件:運(yùn)行緩沖液0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4);柱溫25 ℃;壓力進(jìn)樣3 447.4 Pa×3 s;分離時(shí)間15 min;檢測波長214 nm。分離電壓:第一組、第二組進(jìn)樣時(shí)電壓保持20 kV;第三組進(jìn)樣時(shí),為保持蛋白質(zhì)與污染物小分子結(jié)合過程的一致,先施加20 kV電壓0.5 min,后調(diào)整電壓為15 kV;為了消除電壓變化對峰高的影響,實(shí)驗(yàn)中使用含適量體積分?jǐn)?shù)的DMF溶液(以磷酸緩沖液配制)作為參比。進(jìn)樣次序依次為:DMF、HSA(1.0×10-5mol/L)、PFOA衍生物(20×10-5mol/L)(第一組進(jìn)樣時(shí),HSA區(qū)段由磷酸緩沖液代替)。

簡化的HD法 該方法在給定PFOA衍生物濃度條件下分兩次進(jìn)樣,一次樣品,一次空白,根據(jù)兩次進(jìn)樣所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來分析PFOA衍生物與HSA的相互作用。以含有不同濃度的PFOA衍生物為背景電解質(zhì),以空白磷酸緩沖液為空白測試樣,以僅含HSA(1.0×10-3mol/L)的磷酸緩沖液為樣品進(jìn)樣,進(jìn)行簡化的HD方法測試。電泳條件:柱溫25 ℃;壓力進(jìn)樣3 447.4Pa×15 s;分離電壓15 kV;分離時(shí)間15 min;檢測波長214 nm。

圖 1 PFOA衍生物的紫外吸收圖Fig. 1 UV spectrum of pentadecafluorooctanoic acid (PFOA) derivative

2 結(jié)果與討論

2.1 PFOA衍生物的紫外圖譜

由圖1可以看出,PFOA的酰胺化產(chǎn)物CF3(CF2)6COHNCH2ph在214 nm處有適當(dāng)吸收,且吸光度值適當(dāng),因此在使用PPK法和簡化的HD法進(jìn)行相互作用分析測定時(shí),可選擇214 nm作為檢測波長。

2.2 PFOA- HSA相互作用體系的CE應(yīng)用模式

CE研究HSA與PFOA分子相互作用時(shí),PFOA與HSA的結(jié)合為非共價(jià)結(jié)合,且是可逆平衡過程,即:P+nMMnP,其中P代表HSA, M代表PFOA, MnP代表PFOA- HSA復(fù)合物。CE分離過程中涉及HSA和PFOA的結(jié)合、解離平衡以及組分的分離,由于游離的PFOA與HSA、HSA- PFOA復(fù)合物的質(zhì)荷比不同,因而電泳遷移速率不同,由此可應(yīng)用淌度移動(dòng)法、PPK法、HD法分離可逆平衡體系中的游離PFOA、游離HSA和PFOA- HSA復(fù)合物,進(jìn)而通過檢測信號分析。

淌度移動(dòng)法 毛細(xì)管中載體電解質(zhì)為含有一定濃度PFOA的磷酸緩沖液,而進(jìn)樣樣品為含有丙酮的HSA緩沖液,載體緩沖液中PFOA與樣品中的HSA不斷發(fā)生可逆平衡反應(yīng),PFOA與HSA結(jié)合形成PFOA- HSA復(fù)合物,而與丙酮基本沒有相互作用。在電場驅(qū)動(dòng)下,如果HSA、PFOA- HSA復(fù)合物遷移速率相近則將形成丙酮、HSA和復(fù)合物兩個(gè)正峰(見圖2)。

圖 2 淌度移動(dòng)法的毛細(xì)管電泳圖Fig. 2 Capillary electropherogram of mobility method

圖 3 區(qū)段- 區(qū)段動(dòng)力學(xué)方法的毛細(xì)管電泳圖Fig. 3 Capillary electropherograms of plug- plug kinetic method a. DMF- PBS- PFOA derivative (the first injection, 20 kV); b. DMF- HSA- PFOA derivative ( the second injection, 20 kV); c. DMF- HSA- PFOA derivative (the third injection, 15 kV). DMF: dimethylformamide; PBS: phosphate buffer; HSA: human serum albumin.

PPK法 PFOA衍生物與HSA在毛細(xì)管中發(fā)生相互作用。第一組進(jìn)樣會形成PFOA衍生物、DMF兩個(gè)正峰,第二、三組進(jìn)樣均會形成PFOA衍生物、DMF、HSA和復(fù)合物3個(gè)正峰,但由于二者的分離電壓不同,所以遷移時(shí)間會發(fā)生改變(見圖3),具體理論可參考文獻(xiàn)[28]。

簡化的HD法 PFOA衍生物與HSA在毛細(xì)管內(nèi)發(fā)生相互作用達(dá)可逆動(dòng)態(tài)平衡,在分離系統(tǒng)中存在HSA、PFOA衍生物、復(fù)合物3條區(qū)帶,在電泳圖上出現(xiàn)一正一負(fù)兩個(gè)峰(見圖4)。其中負(fù)峰相應(yīng)于溶液區(qū)段中PFOA衍生物濃度低于背景緩沖液中的部分,差值部分是與HSA結(jié)合了的PFOA衍生物的量。正峰相應(yīng)于因具有相似遷移速率而未能分開的HSA與復(fù)合物,具體理論可參考文獻(xiàn)[29]。

圖 4 簡化的HD法的毛細(xì)管電泳圖Fig. 4 Capillary electropherogram of simplified Hummel- Dreyer method

2.3 PFOA- HSA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用淌度移動(dòng)法、PPK法、簡化的HD法研究PFOA- HSA體系的相互作用,并分析所得結(jié)果。

2.3.1淌度移動(dòng)法

針對污染物PFOA小分子(配體M)- 蛋白質(zhì)大分子(受體P)間的結(jié)合反應(yīng)體系,可得到描述各物質(zhì)間電泳淌度關(guān)系的相互作用反應(yīng)模型,可表示如下:

nM+P→MnP

(1)

對于結(jié)合物MnP,其表觀結(jié)合常數(shù)表達(dá)式為

(2)

受體P的平均電泳淌度(μ)變化值介于游離受體P(沒有配體M存在)的電泳淌度(μP)與結(jié)合物MnP的電泳淌度(μMnP)之間,可表示為

(3)

經(jīng)一系列推導(dǎo)轉(zhuǎn)化,當(dāng)n=1時(shí)，可得出公式(4),具體推導(dǎo)過程可參考文獻(xiàn)[30]。

(4)

方程式(4)是以電泳淌度來表示的Scatchard線性方程式,以1/(μ-μp)對1/[M]進(jìn)行線性擬合,所得直線的截距和斜率的比值即為表觀結(jié)合常數(shù)KB。但是在實(shí)際擬合過程中,μ與M不存在線性關(guān)系,Bowser和Chen[31]強(qiáng)調(diào)將測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,尤其是在合理的[M]范圍內(nèi)(通常配體M的濃度高于受體P濃度的10～100倍[32]),能夠有效降低計(jì)算所得的結(jié)合常數(shù)誤差。

由式(4)可知,不同的[M]對應(yīng)不同的μ值,根據(jù)電泳圖譜獲得遷移時(shí)間,計(jì)算有效淌度的公式如下:

(5)

其中,μeff表示受體P的有效淌度,μapp表示其表觀淌度,μeof表示電滲流淌度,Lt表示毛細(xì)管總長,Ld表示從進(jìn)樣端到檢測窗口的有效長度,V表示毛細(xì)管兩端的外加電壓,t表示直接從電泳圖譜中得到的受體P的遷移時(shí)間,teof表示丙酮的遷移時(shí)間。計(jì)算得到的μeof可作為式(4)中的μ(游離受體P的有效淌度或受體P的平均有效淌度)。將其對[M]進(jìn)行非線性擬合,更符合實(shí)際情況,所得結(jié)果更精確。因而本研究工作中的KB通過非線性擬合獲得。

按實(shí)驗(yàn)方法,測得不同濃度PFOA的電泳圖譜,結(jié)果見圖5。

圖 5 PFOA和HSA相互作用的電泳圖Fig. 5 Electropherograms of HSA in interaction with PFOA PFOA concentrations (mol/L): a. 10×10-5; b. 50×10-5; c. 80×10-5.

由圖5可見,PFOA濃度的增加不能顯著影響丙酮的遷移行為,即丙酮與PFOA之間沒有明顯的相互作用。隨著運(yùn)行緩沖液中PFOA濃度的增加,HSA峰的遷移時(shí)間變化也不明顯,需進(jìn)一步計(jì)算確定HSA與PFOA之間是否發(fā)生了相互作用。

實(shí)驗(yàn)中通過改變運(yùn)行緩沖液中PFOA的濃度,可獲得不同濃度下HSA及丙酮的遷移時(shí)間,根據(jù)式(5)可計(jì)算在不同濃度條件下的HSA平均有效淌度,測定結(jié)果見表1。

表 1 HSA在含不同PFOA濃度運(yùn)行緩沖液中的有效淌度

μeff: effective mobility of HSA.

由表1可知,HSA的有效淌度與電滲流方向相反,且隨著運(yùn)行緩沖液中PFOA濃度的增加而增大,其值從-1.842 2×10-4cm2/(V·s)變化至-2.173 8×10-4cm2/(V·s),表明隨著PFOA濃度的增加,PFOA- HSA之間有相互作用且相互作用逐漸增強(qiáng)。

根據(jù)表1數(shù)據(jù),以PFOA的濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的μeff為縱坐標(biāo),按式(4)進(jìn)行非線性擬合,得到PFOA- HSA之間的非線性擬合曲線圖(見圖6)。

表 2 區(qū)段-區(qū)段毛細(xì)管電泳動(dòng)力學(xué)參數(shù)Koff的考察(n=3)

表 3 區(qū)段-區(qū)段毛細(xì)管電泳動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kon的考察(n=3)

圖 6 PFOA- HSA的非線性擬合曲線Fig. 6 Non- linear fitting curve of the PFOA- HSA

由圖6可看出,除部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)偏離較大外,大多數(shù)能較好地靠近擬合曲線。經(jīng)擬合,得到PFOA- HSA的表觀結(jié)合常數(shù)KB為7.331 0×103L/mol。

2.3.2PPK法

污染物PFOA小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)KB主要由結(jié)合速率常數(shù)Kon和解離速率常數(shù)Koff的比值決定。設(shè)物質(zhì)A為PFOA衍生物,物質(zhì)B為HSA,物質(zhì)C為PFOA衍生物與HSA相互作用后的復(fù)合物PFOA衍生物- HSA。PFOA衍生物與HSA的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kon、Koff和KB可由方程(6～8)得到:

(6)

(7)

(8)

本實(shí)驗(yàn)中，a0、b0、c1為發(fā)生相互作用后物質(zhì)A、B、C的濃度;ha0對應(yīng)于PFOA衍生物濃度為a0時(shí)峰高與DMF峰高的比值,ha2、ha3、hb0、hb2和hb3代表的含義以此類推,t2和t3分別為不同運(yùn)行電壓下PFOA衍生物或HSA的出峰時(shí)間,可在保證A與B結(jié)合過程一致的前提下通過改變電壓獲得,t1為A與B發(fā)生結(jié)合的時(shí)間。具體參數(shù)的計(jì)算公式可參考文獻(xiàn)[33,34]。

對PFOA衍生物與HSA相互作用的電泳圖譜(圖3)的峰高進(jìn)行計(jì)算,第一次進(jìn)樣由hPFOA衍生物/hDMF可獲得參數(shù)ha0,第二次進(jìn)樣由hPFOA衍生物/hDMF可獲得參數(shù)ha2,第三次進(jìn)樣由hPFOA衍生物/hDMF可獲得參數(shù)ha3,進(jìn)而根據(jù)式(6)、(7)即可求得Koff和Kon,詳細(xì)參數(shù)見表2和表3。由式(8)求出PFOA衍生物和HSA相互作用結(jié)合常數(shù)KB:

KB=Kon/Koff=5.8835×103L/mol。

2.3.3簡化的HD法

分別用背景緩沖液配制一系列不同濃度(10×10-5～100×10-5mol/L)的PFOA衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液,在相同條件下,得到不同濃度的PFOA衍生物的電泳圖譜。以峰面積(A)對濃度(c, 10-5mol/L)進(jìn)行線性回歸,得到良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為A=1 137.8+360.15c,N=6, 相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 1。

假設(shè)蛋白質(zhì)與污染物分子的結(jié)合是理想狀態(tài),相互之間反應(yīng)互不干擾、相互獨(dú)立,那么其平衡關(guān)系可以用如下多級平衡方程式表示:

(9)

其中R為結(jié)合比，m為結(jié)合位點(diǎn)總類數(shù)，ni為第i類位點(diǎn)數(shù)，Ki為第i類位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)，Cb是結(jié)合小分子的濃度，Cf是游離小分子濃度，Cp是總蛋白濃度。Cf與R呈非線性關(guān)系，若小分子與所有結(jié)合位點(diǎn)的親和力相同(m=1)，方程(9)可變形為Cf與R的非線性方程

(10)

可將方程(10)簡化為R與R/Cf的線性方程:

=-KBR+nKB (11)

For non-linear regression,y:R,x:Cf; For Scatchard,y:R/Cf,x:R; For Klotz,y: 1/R,x: 1/Cf.

方程(11)就是著名的Scatchard方程。在這個(gè)方程式中,根據(jù)斜率和截距即可直接求出結(jié)合常數(shù)KB和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。Klotz提出了相互作用的Klotz線性方程式:

(12)

圖7中PFOA衍生物的紫外吸收峰隨著PFOA衍生物濃度的增加而逐漸增大,HSA和復(fù)合物的紫外吸收峰隨著PFOA衍生物濃度的增加而呈下降趨勢,說明PFOA衍生物和HSA發(fā)生了結(jié)合,形成了復(fù)合物。圖7中PFOA衍生物的峰在HSA峰的前面,這是由于在PFOA衍生物和HSA的混合樣中,試樣中PFOA衍生物與HSA發(fā)生了可逆結(jié)合反應(yīng),形成了復(fù)合物。在本實(shí)驗(yàn)條件下,PFOA衍生物與HSA質(zhì)荷比不同、HSA和復(fù)合物分子帶負(fù)電荷,它們的電泳方向與電滲方向相反,由于電滲速率大于電泳速率,且PFOA衍生物的質(zhì)荷比小于HSA與PFOA復(fù)合物的質(zhì)荷比,故PFOA衍生物的遷移速率大于HSA與PFOA復(fù)合物,出峰于HSA之前,由于HSA與PFOA衍生物- HSA復(fù)合物的質(zhì)荷比相近,HSA與復(fù)合物沒有完全分開,所以會出現(xiàn)一個(gè)正峰。

圖 7 簡化的HD法測得的PFOA衍生物與HSA 相互作用電泳圖Fig. 7 Electropherograms of HSA in interaction with PFOA derivative using simplified Hummel- Dreyer method

如表4所示,使用3種不同的方程(非線性回歸方程、Scatchard方程、Klotz方程)構(gòu)建PFOA衍生物- HSA相互作用模型,均能有效反映體系的作用效果: Klotz方程得到的結(jié)合常數(shù)KB值最大,Scatchard方程次之,非線性回歸方程最小,但都相差不大,說明PFOA衍生物與HSA的結(jié)合強(qiáng)度適中;非線性回歸方程得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n最大,Scatchard方程次之,Klotz方程最小,皆為1.0左右,說明PFOA衍生物與HSA作用只有單一類型的結(jié)合位點(diǎn)。綜合比較,通過模型適用度分析得出非線性回歸方程是PFOA衍生物- HSA體系的最適方程。

比較了不同方法測得的KB值(淌度移動(dòng)法7.331 0×103L/mol, PPK法5.883 5×103L/mol,簡化的HD法7.852 1×103L/mol),發(fā)現(xiàn)PFOA和PFOA衍生物與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)都是103數(shù)量級,且3個(gè)結(jié)果差距不大。因此我們推測衍生反應(yīng)對相互作用影響較小,PFOA衍生物與HSA的相互作用可以近似認(rèn)為是PFOA與HSA的相互作用。

2.3.4方法比較

用淌度移動(dòng)法、PPK法和簡化的HD法研究了全氟化合物PFOA與HSA的相互作用。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)3種方法均可獲得結(jié)合常數(shù)KB,簡化的HD法還可得到結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。PPK法實(shí)驗(yàn)操作簡單,耗時(shí)短,適用于本體系的快速檢測,作為輔助手段驗(yàn)證其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。簡化的HD法出峰清晰,且隨實(shí)驗(yàn)組PFOA衍生物濃度的遞增,峰高出現(xiàn)明顯的變化趨勢:負(fù)峰(代表與HSA結(jié)合的PFOA衍生物)逐漸增高,正峰(代表游離蛋白質(zhì)及復(fù)合物)逐漸降低。綜合比較,淌度移動(dòng)法耗時(shí)長,PPK法簡單快捷,簡化的HD法精準(zhǔn)可靠。

2.3.5KB參數(shù)的生物學(xué)意義

利用簡化的HD法獲得的結(jié)合常數(shù)KB,根據(jù)Van’t Hoff方程,還可計(jì)算結(jié)合自由能變。

ΔG=-RTlnKB

(13)

其中R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol5K)),KB為溫度T(298 K)下的結(jié)合常數(shù),由此算出結(jié)合自由能變ΔG為-22.22 kJ/mol,說明相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

根據(jù)小分子與HSA結(jié)合生成的復(fù)合物的穩(wěn)定性,結(jié)合反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)特征,可將相互作用平衡體系粗略分為兩種模型,一種具有慢動(dòng)力學(xué)特征(KB數(shù)量級為103L/mol[35]),即蛋白質(zhì)- 小分子復(fù)合物比較穩(wěn)定。另一種能快速達(dá)到平衡(KB數(shù)量級為104～106L/mol[35]),其蛋白質(zhì)- 小分子復(fù)合物的半衰期小于1 s。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,KB數(shù)量級為103L/mol,說明PFOA與HSA間的相互作用是慢平衡反應(yīng),表明PFOA與HSA的結(jié)合比較穩(wěn)定,在體內(nèi)消除慢,驗(yàn)證了PFOA的生物累積性。

3 結(jié)論

本工作應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù),將淌度移動(dòng)法、PPK法、簡化的HD法的理論用于實(shí)踐研究,于分子水平上探究了環(huán)境污染物PFOA與HSA的相互作用,構(gòu)建合理的理論模型并計(jì)算相關(guān)結(jié)合參數(shù)。簡化的HD法運(yùn)用了多個(gè)方程進(jìn)行模型適用度分析,具有耗樣量小、獲得的結(jié)合信息較全面、分析快捷準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),可反映PFOA衍生物與HSA的結(jié)合狀況。本文的有關(guān)結(jié)果不僅對PFOA與HSA相互作用機(jī)制的進(jìn)一步探究有重要意義,而且可為研究環(huán)境中其他類似的污染物- HSA體系的分子作用機(jī)理研究提供一定參考。需要說明的是,在配制樣品濃度時(shí)是參考文獻(xiàn)報(bào)道的PFOA在人血清中的富集濃度[26]進(jìn)行的,達(dá)μg/L,與水中僅有的ng/L級別的濃度有較大差異。在極低濃度下PFOA與HSA的相互作用是否會有變化,還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

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