陳 麗, 鄭 穎, 陳裕富, 袁秋月, 謝天堯

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275)

氨基酸對映體手性分離識別方法中,文獻報道所采用的手性選擇劑主要有:1.手性氨基酸配體。這類方法通常以中心離子與L- 氨基酸形成的絡(luò)合物作為手性選擇劑,利用手性配體絡(luò)合交換原理來實現(xiàn)氨基酸對映體的分離分析[1-3]。2.環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物。環(huán)糊精分子具有中空的圓杯狀結(jié)構(gòu),與手性分子形成穩(wěn)定常數(shù)不同的包合物,從而實現(xiàn)氨基酸對映體的分離分析[4,5]。3.冠醚。冠醚是大環(huán)聚醚,分子中間形成空穴,能與大小相當(dāng)?shù)姆肿有纬芍? 客體絡(luò)合物,從而實現(xiàn)分子識別[6,7]。4.天然大環(huán)抗生素。大環(huán)抗生素具有天然的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和多個手性中心,因此可以作為手性選擇劑用于氨基酸對映體的分離[8,9]。5.手性表面活性劑。利用手性膠束中多個手性中心與氨基酸對映體分子之間的氫鍵作用和空間位阻作用實現(xiàn)對映體的手性識別[10,11]。6.手性離子液體。手性離子液體結(jié)合了離子液體和手性物質(zhì)的優(yōu)點和特性,已成功應(yīng)用于手性物質(zhì)的分離中[12,13]。上述手性選擇劑本身就是手性化合物,氨基酸對映體在其構(gòu)建的手性介質(zhì)環(huán)境中得以實現(xiàn)手性分離。目前,對于在非手性介質(zhì)的電泳運行液中實現(xiàn)氨基酸對映體的手性識別,尚未見文獻報道。

毛細管電泳(CE)因其高效低耗、可供選擇的分離模式多、分離柱易于清洗、分析成本低等優(yōu)點已成為氨基酸對映體分離分析極具吸引力的方法[14,15]。由于絕大部分的氨基酸(除芳香族氨基酸外)沒有紫外- 可見吸收,也不產(chǎn)生熒光,因此采用紫外- 可見和激光誘導(dǎo)熒光檢測器的CE分析方法,往往需要先進行樣品衍生化處理使其具有光學(xué)活性。但是,衍生化過程不僅費時麻煩而且有可能使分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,影響分析結(jié)果,不利于氨基酸對映體的手性識別分析。電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection,簡稱C4D)是近年來發(fā)展起來一種新型的電導(dǎo)檢測方法[16,17]。C4D具有分析對象適用范圍廣、抗干擾能力強、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點,是毛細管電泳中一種性能優(yōu)良的檢測器,無需衍生化處理,特別適用于檢測缺乏光學(xué)活性的分子。目前,有關(guān)CE- C4D在氨基酸對映體分離檢測方面的應(yīng)用研究報道還較少,CE- C4D在常見氨基酸的分離分析中極具應(yīng)用前景。本文采用CE- C4D,在非手性介質(zhì)的電泳運行液2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅中實現(xiàn)了D,L- 異亮氨酸對映體的手性識別,并對其手性識別機理進行了初步探討。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CES2008毛細管電泳儀(配備非接觸式電導(dǎo)檢測器,中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院研制); pHS- 3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);未涂層石英毛細管(45 cm×50 μm,河北永年銳沛色譜器件有限公司); KQ2200型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲波儀器有限公司); SGW型旋光儀(上海儀電)。

氫氧化鈉、檸檬酸和乙酸鋅(分析純,廣州化學(xué)試劑廠); D,L- 異亮氨酸、D- 異亮氨酸,L- 異亮氨酸(層析純,上海伯奧生物科技有限公司)。所用水為超純水,由Millipore超純水機制備。

分別配制0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L檸檬酸、20 mmol/L乙酸鋅的水溶液,實驗時,各取適量以制得不同濃度的電泳運行液。異亮氨酸用水配制成1 g/L的標準溶液,進樣時用電泳運行液稀釋至所需濃度。

1.2 實驗方法

將毛細管柱的兩端在超聲波清洗器中超聲清洗1 min,依次用0.1 mol/L HNO3溶液、超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和電泳運行液分別沖洗毛細管柱5 min。實驗中,每2次進樣間僅需用電泳運行液沖洗毛細管3 min。分析過程運行10次后,電泳儀兩端的儲液瓶中需更換新鮮的電泳運行液。電泳運行液為2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅(pH=7.3)。分離電壓+13 kV,電動進樣+11 kV×8 s。檢測器的輸出信號經(jīng)數(shù)據(jù)工作站采集到微機中進行實時數(shù)據(jù)處理、圖形顯示和數(shù)據(jù)文件存儲。實驗在室溫(25 ℃)、相對濕度<70%的環(huán)境下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 鋅離子的手性識別作用

手性配體交換絡(luò)合法是研究較早的分離氨基酸對映體的方法[1-3]。這種方法通常采用金屬離子與L型氨基酸形成的絡(luò)合物作為手性選擇劑,利用氨基酸對映體與手性選擇劑之間進行配體交換絡(luò)合的差異而達到分離。在CE- C4D分離檢測異亮氨酸對映體的研究中,我們發(fā)現(xiàn)以檸檬酸- Zn2+組成的電泳運行液體系替代傳統(tǒng)由金屬離子- L- 氨基酸絡(luò)合物構(gòu)建的運行液體系,同樣可以實現(xiàn)異亮氨酸對映體的手性分離,且檸檬酸- Zn2+體系更為簡單高效。試驗了其他不同的金屬離子,如:Cu2+、CO2+、Ni2+和Mn2+等,結(jié)果表明,只有Zn2+對異亮氨酸對映體呈現(xiàn)出手性識別能力,Zn2+濃度是影響異亮氨酸對映體分離度的關(guān)鍵因素。固定D,L- 異亮氨酸質(zhì)量濃度為6 mg/L,考察了鋅離子濃度在0～4.0 mmol/L范圍內(nèi)對分離度的影響,結(jié)果見圖1。開始隨著Zn2+濃度的增加,對映體逐漸得到分離,當(dāng)Zn2+濃度為2.0 mmol/L時,分離度達最大;繼續(xù)增大Zn2+濃度,則會引起電泳電流的增大和焦耳熱的增加,分離度變差,不利于分離。故本實驗選取的Zn2+最佳濃度為2.0 mmol/L。

圖 1 鋅離子濃度對異亮氨酸對映體分離的影響Fig. 1 Effect of Zn2+concentration on the enantio- separation of D,L- isoleucine Running buffer: 2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L citric acid+c(Zn2+) zinc acetate; separation voltage: 13 kV; electrokinetic injection: 11 kV×8 s.

2.2 CE條件的優(yōu)化

在CE實驗中,需要優(yōu)化的條件主要有電泳運行液的組成和濃度、分離電壓、進樣電壓和進樣時間。

電導(dǎo)檢測器輸出的分析信號強度取決于待測組分的電導(dǎo)值與電泳運行液背景電導(dǎo)之間的差值。因此,通過選擇合適的電泳運行液組成及濃度可以獲得最佳的靈敏度和信噪比。異亮氨酸的pI=6.02,且在偏中性的介質(zhì)中易與Zn2+絡(luò)合穩(wěn)定而呈正電荷,因此選擇偏中性的電泳運行溶液有利于電泳分離。實驗考察了多種常用的電泳運行液體系(乙酸- 乙酸鈉、磷酸- 磷酸鈉、硼酸- 硼酸鈉、三羥甲基氨基甲烷- 鹽酸和檸檬酸- 檸檬酸鈉等),結(jié)果表明:只有在檸檬酸- 檸檬酸鈉溶液體系中異亮氨酸對映體才可以獲得分離,且具有良好的檢測靈敏度。因此本實驗最終確定的電泳運行液體系為2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅(pH=7.3)。

考察了分離電壓(8～20 kV)對于分離效果的影響,結(jié)果表明:從8 kV開始,隨著分離電壓的增大,樣品峰的遷移時間逐漸縮短,半峰寬變小,對映體的分離度也隨之增加;當(dāng)達到13 kV時,分離度(Rs)最佳;繼續(xù)增大分離電壓,則分離度開始變差。進樣電壓較低和進樣時間較短時,進樣量少,靈敏度低;當(dāng)進樣電壓較大和進樣時間較長時,進樣量大,靈敏度明顯提高,但會使進樣量過多,導(dǎo)致電泳峰形展寬嚴重,從而降低了對映體的分離度。綜合考慮靈敏度、分離度、精密度和分析時間,選擇分離電壓為13 kV,進樣電壓為11 kV,進樣時間為8 s。

2.3 線性范圍、檢出限和精密度

在選定的最佳實驗條件下,外消旋體的D,L- 異亮氨酸在8 min內(nèi)其對映體達到了良好的基線分離和靈敏檢測(見圖1,c(Zn2+)=2.0 mmol/L)。通過標準加入法確定D- 異亮氨酸出峰在前,L- 異亮氨酸出峰在后。單一構(gòu)型對映體的電泳峰面積與其質(zhì)量濃度在1.0～20 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,D型和L型異亮氨酸的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998 7和0.998 5,檢出限(S/N=3)為0.4 mg/L。進行了日內(nèi)(intra- day)和日間(inter- day)精密度測定,以4 mg/L的L- 異亮氨酸為例平行測定6次,結(jié)果表明,遷移時間的日內(nèi)、日間相對標準偏差分別為2.0%和2.2% ,峰面積的日內(nèi)、日間相對標準偏差分別為4.2%和4.5% 。相同條件下,D- 異亮氨酸具有一致的結(jié)果。實驗表明本方法具有較高的檢測靈敏度和良好的重復(fù)性。

2.4 其他氨基酸的干擾試驗

在上述優(yōu)化的實驗條件下,考察了其他19種常見氨基酸的干擾情況,結(jié)果表明這些氨基酸或是不出峰,或是其出峰時間與目標電泳峰有差異,從而不干擾異亮氨酸對映體的測定。表明檸檬酸- Zn2+體系對異亮氨酸對映體的手性識別具有一定的專一性以及良好的抗干擾能力。

2.5 手性識別機理的初步探討

在文獻[1-3]報道有金屬離子參與氨基酸對映體手性分離的CE方法中,金屬離子與L- 氨基酸的絡(luò)合物本身作為手性化合物添加到電泳運行液中(溶液具有旋光性),氨基酸對映體在其構(gòu)建的手性環(huán)境中得以實現(xiàn)手性識別。本文所采用的電泳運行液(2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅)屬于非手性介質(zhì)(溶液本身不具有旋光性),異亮氨酸對映體在上述電泳運行液中得到拆分。因此,本文方法的手性識別機理完全有別于文獻報道的方法。為了闡明其手性識別機理,我們設(shè)計了多種不同的實驗方案。實驗結(jié)果表明:在保持電泳運行液的pH和離子強度一致的前提下,用無機酸或是一元羧酸(如乙酸)替代檸檬酸,則無法實現(xiàn)對映體的分離,說明檸檬酸除了提供電泳運行液所需的H+外,還參與了手性識別過程。基于上述實驗事實,我們認為Zn2+首先與具有三元羧酸結(jié)構(gòu)的檸檬酸可能形成具有“隱形”手性結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物,或可能形成一種類似于金屬有機物骨架結(jié)構(gòu)的化合物,然后再與D,L- 異亮氨酸對映體形成具有電泳淌度差別的結(jié)合物,從而實現(xiàn)手性分離。鑒于條件所限,更深層次的機理還在進一步研究之中。

3 結(jié)論

本文的研究結(jié)果表明,采用CE- C4D在檸檬酸- Zn2+體系的電泳運行液中可以實現(xiàn)異亮氨酸對映體的手性分離。因其手性識別機理具有特殊性,尚需采用多種手段,包括理論計算和表征技術(shù)對其手性識別機理進行深入研究。本文的研究工作將為氨基酸對映體的手性識別提供一個新方法和新思路。

[1] Gassman E, Kuo J E, Zare R N. Science, 1985, 230(4727): 813

[2] Chen Z L, Uchiyama K, HoBo T. Anal Chim Acta, 2004, 523: 1

[3] Kartsova L A, Alekseeva A V. J Anal Chem, 2011, 66(7): 563

[4] Lu X N, Chen Y. Chemical Journal of Chinese University, 2002, 23(5): 822

盧小寧, 陳義. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2002, 23(5): 822

[5] Kucerová G, Procházková H, Kalíková K, et al. J Chromatogr A, 2016, 1467: 356

[6] Kuhn R, Steinmetz C, Bereuter T, et al. J Chromatogr A, 1994, 666: 367

[7] Adhikari S, Lee W. J Pharm Invest, 2017(8): 1

[8] Hui F M, Chen Y L, Chen X G. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2004, 32(7): 964

惠方民, 陳永雷, 陳興國. 分析化學(xué), 2004, 32(7): 964

[9] Fedorova I A, Shapovalova E N, Shpigun O A. J Anal Chem, 2017, 72(1): 76

[10] Terabe S, Shibata M, Miyashita Y. J Chromatogr A, 1989, 480: 403

[11] Prior A, Moldovan R C, Crommen J, et al. Anal Chim Acta, 2016, 940: 150

[12] Liu R, Du Y, Chen J, et al. Chirality, 2015, 27(1): 58

[13] Huang L, Yu L S, Chen Y T. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(11): 1225

黃露, 余麗雙, 陳毅挺. 色譜, 2014, 32(11): 1225

[14] Giuffrida A, Maccarrone G, Cucinotta V, et al. J Chromatogr A, 2014, 1363: 41

[15] Pan C J, Wang W F, Chen X G. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(1): 16

潘聰潔, 王偉峰, 陳興國. 色譜, 2016, 34(1): 16

[16] Zemann A J, Schnell E, Volgger A D, et al. Anal Chem, 1998, 70: 563

[17] Kuban P, Hauser P C. Electrophoresis, 2015, 36(1): 195