代 靜 , 焦 雪 , 盧玉婷 , 張培軍 , 巴翠玉 , 茆安婷 , 李月紅

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ; 2.吉林省衛(wèi)生檢測檢驗中心 ， 吉林 長春 130118)

魚傳染性造血器官壞死病(Infectious hematopoietic necrosis of fish, IHN)是由傳染性造血器官壞死病病毒(InfectioushematopoieticnecrosisVirus, IHNV)引起的一種急性的、全身性的魚類傳染病[1]，20世紀50年代初，該病毒在北美洲西部大馬哈魚魚苗場首次被發(fā)現[2]，迅速蔓延到歐洲和亞洲，在鮭類和鱒類魚中引起了全球流行病[3]。IHNV-G蛋白是能夠誘導中和抗體反應的惟一病毒蛋白[4]。發(fā)病時以魚體出血，腎臟和脾臟造血組織壞死為典型特征，IHN的感染造成成魚死亡率為10%～25%，幼魚死亡率可達100%[5]。因此研制其免疫效果好、安全性高、成本低廉的新型疫苗成為研究的熱點。

目前，對IHNV有效的防控措施是通過隔離病毒或是注射疫苗，但3月齡內的魚苗其免疫器官未發(fā)育成熟[6]，所以注射疫苗往往達不到理想的效果。萊茵衣藻作為光合真核微生物，可準確表達外源基因，生物安全性高，近年來發(fā)現萊茵衣藻具有外泌蛋白的能力，可大大降低重組蛋白的后續(xù)分離純化。利用其作為生物反應器研制魚類口服疫苗具有良好的應用前景[7-8]。本研究主要以研制出安全、可靠的新型載體口服疫苗為目的，為我國的冷水漁業(yè)健康發(fā)展提供一定的技術支持[9]。本試驗將傳染性造血器官壞死病病毒主要抗原組分糖蛋白基因重組到萊茵衣藻核表達載體上，構建重組質粒，利用電穿孔技術將該重組質粒轉入細胞壁缺陷型萊茵衣藻中，進行抗性篩選，以獲得攜帶了目的基因的轉基因萊茵衣藻。同時，將重組的萊茵衣藻灌喂BALB/c小鼠后進行IHNV安全評價，獲得小鼠脾臟細胞后利用流式細胞術檢測免疫指標。從而為研制新型、安全有效的IHNV口服疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 IHNV-G基因總RNA的提取 取300 μL細胞毒加1 mL TRIZol室溫孵育5 min，12 000 r/min (4 ℃)離心15 min后吸取上清，加入200 μL的氯仿震蕩15 s，室溫孵育5 min；12 000 r/min(4 ℃)離心15 min；吸取上層轉置到一個新的EP管中，加入500 μL的異丙醇沉淀RNA，室溫孵育10 min；12 000 r/min(4 ℃)離心15 min；倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌2次，7 500 r/min(4 ℃)離心5 min；室溫干燥5 min，加25 μL的無RNA酶處理水溶解并保存在-80 ℃。

1.2 IHNV-G基因cDNA的克隆 以1μL細胞為模板，按照寶生生物(上海)公司提供的反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，引物根據NCBI數據庫中已公開IHNV的HLJ-09株(登錄號：JX649101)的G基因序列設計上下游引物，去掉終止密碼子后在上游引物中引入EcoRI酶切位點和下游引物中引入KpnI酶切位點：上游引物：5′-TAGATATCATGGACGCCATGATCAC-3′；下游引物:5′-ATGGTACCTATTAGGACCTGTTTGCC-3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性5 min；退火溫度61 Tm；72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。將PCR產物進行膠回收，按寶生生物(上海)公司提供的膠回收試劑盒進行純化，連接至DH5α中，挑取白色菌落擴大培養(yǎng)，按照質粒DNA小量提取試劑盒提取，用EcoRI酶、KpnI酶進行雙酶切，將陽性質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.3 重組萊茵衣藻的構建 將擴增得到的IHNV-G基因克隆到pMD18T中，然后將其涂布與LB培養(yǎng)基中，隔天挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩過夜，按北京索萊寶生物技術有限公司小提質粒試劑盒提取質粒并送至哈爾濱博仕生物技術有限公司測序，然后將測序正確的質?？寺〉絧DBle載體上構建PDBle-IHNV-G重組表達載體，經電擊法轉化到萊茵衣藻中，通過博來霉素抗性篩選得到單克隆轉基因萊茵衣藻，用PCR方法檢測轉基因萊茵衣藻。

1.4 IHNV-G蛋白血清的制備 抗IHNV全血清病毒的制備，取本實驗室保存的IHNV細胞毒15 mL，按照2.5 μL/mL加入40%甲醛至終濃度0.1%，37 ℃溫育48 h。加入等體積的弗氏佐劑混勻，采用腹腔注射，每只小鼠注射0.25 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，每只小鼠眼球取血約0.7 mL，37 ℃水浴1 h，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min，最后血清量約350 μL左右置于-20 ℃保存。

1.5 Westen Blot 將重組的萊茵衣藻表達蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后用蒸餾水沖洗3次，置于轉膜緩沖液中平衡5 min準備轉膜；轉膜結束后，取出PVDF膜，做好標記，用PBS沖洗3次，置于5 %脫脂奶中，4 ℃封閉過夜；次日，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min，在加入1∶3 000稀釋濃度的鼠源HIS標簽抗體作為首抗，室溫孵育5 h；TBST漂洗3次，每次5 min；加入1∶2 000稀釋濃度的辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育1.5 h；TBST漂洗3次，每次5 min。按照DAB顯示試劑盒進行顯色，顯色前將10 mL反應液，200 μL溶液A，100 μL溶液B，20 μL溶液C在棕色瓶中充分混勻，再將PVDF膜浸泡在其中，37 ℃條件下震蕩反應5 min，棄去顯色液后用蒸餾水沖洗3次，自然干燥后觀察記錄。

1.6 病毒滴度的測定 按照每cm2最多加入10 μL IHNV病毒的標準將本實驗室保存的IHNV病毒加入FHM單層細胞中，16 ℃吸附1 h后換新鮮的M199培養(yǎng)基，置于16 ℃培養(yǎng)，同時設立對照組，每天記錄觀察。待80%細胞出現病變后，將細胞反復凍融3次，制備病毒懸液備用，進行病毒滴度的測定，TCID50計算采用Karber 法計算，即LgTCID50=L-d(s-0.5)，L是最高稀釋度的對數，d是稀釋度對數之差，s是陽性孔比率總和。

1.7 BALB/c小鼠的飼養(yǎng) 取6周齡雌性BALB/c小鼠，將小鼠分為4組，每組10只，飼喂同樣的鼠糧和水。每日灌胃1次，一次200 μL,第1組灌喂轉基因萊茵衣藻，第2組灌喂萊茵衣藻，第3組、第4組灌喂PBS，連續(xù)灌喂7 d，每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。

灌胃結束后對小鼠進行攻毒試驗，第1、2、3組每只小鼠腹腔注射IHNV病毒200 μL，第4組小鼠腹腔注射PBS 200 μL，每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。第0、7、14、21、28天，隨機選取4只小鼠稱重，取平均值。每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。

1.8 小鼠脾臟細胞的制備與淋巴細胞亞群的測定 第14天每組隨機取4只小鼠，在無菌條件下取小鼠脾臟。在脾臟組織中加1 mL M199細胞培養(yǎng)基，經200目尼龍網過濾于離心管中，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加入500 μL紅細胞裂解液重懸脾細胞，避光裂解10 min，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，觀察細胞沉淀，如果仍然為紅的，重復裂解1次；如果細胞沉淀為白色，加入1 mL M199培養(yǎng)基洗滌細胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加 1 mL FACS溶液洗滌細胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加入1mL FACS重懸細胞，進行細胞計數；分裝細胞，每管1×106細胞；在加入1 mL FACS洗滌1次，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min，加入100 μL FACS即為脾細胞懸液。

取上述制備的脾臟細胞，每管加入抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a單克隆抗體各10 μL，同時設置單染對照組和空白對照組，室溫避光孵育50 min，然后用FACS沖洗多余抗體，避免影響檢測結果，最后用流式細胞儀檢測細胞熒光，并用軟件分析。

2 結果

2.1 IHNV-G基因總RNA提取結果 待80%細胞出現明顯病變，按照TRIZol試劑說明書操作提取細胞毒中FHM細胞和IHNV病毒的總RNA如圖1。

圖1 FHM細胞和IHNV病毒的總RNA

2.2 IHNV-G基因RT-PCR擴增 以FHM細胞和IHNV病毒的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一條鏈。再以cDNA作為PCR反應的模板，經特異性引物PCR反應后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖2，得到一條1 500 bp左右大小的特異性條帶。

圖2 PCR擴增結果

M：DL-2 000 Marker； 1和2均為IHNV PCR產物

2.3 萊茵衣藻表達載體的構建結果 將表達載體化學轉化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中進行擴增后提取質粒，進行雙酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證結果如圖3，得到1條1 500 bp 左右大小的特異性條帶，說明線性化載體與目的片段連接成功，將質粒送至測序公司進行測序，測序結果同樣證明載體與目的片段連接成功，插入片段進行同源性比對結果同源性為99%。

圖3 表達載體pCh-IHNV-G 酶切結果

M:250 bp DNA Marker ; 1、3、5：pCh-IHNV-G表達載體藻;2、4、6：質粒酶切

2.4 SDS-PAGE電泳分析結果 轉基因萊茵衣藻經兩次抗性篩選后，離心收集轉基因萊茵衣藻，超聲波破碎萊茵衣藻提取粗蛋白，進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，有1條大約為58 kDa的蛋白條帶如中插彩版圖4，與理論結果相符合。

2.5 Western Blot檢測結果 以重組表達的G蛋白為抗原，鼠抗IHNV血清為首抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，經誘導后的G蛋白能與鼠抗IHNV血清反應，在58 kDa處出現了一條明顯的特異性條帶，如中插彩版圖5。以重組表達的目的蛋白為抗原，鼠源HIS標簽抗體為首抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，Western Blot結果顯示，目的蛋白能與鼠源HIS標簽抗體反應，在58 kDa處出現了一條明顯的特異性條帶，與SDS-PAGE出現的目的蛋白一致如圖6。

圖6 Western Blot分析

2.6 病毒滴定測定結果 將病毒懸液做10倍倍比稀釋后接種到長滿單層的FHM細胞的96孔板中，采用Karber 法計算出病毒懸液的TCID50為10-6.2/0.1 mL。

2.7 BALB/c小鼠增重效果 小鼠飼喂同樣的鼠糧和水，第1～7天每組每只小鼠每天灌胃，每日灌胃1次，一次200 μL,第1組灌喂轉基因萊茵衣藻，第2組灌喂萊茵衣藻，第3組、第4組灌喂PBS，第8天對小鼠進行攻毒，第1、2、3組每只小鼠腹腔注射TCID50效價為10-6.2的IHNV 200 μL，第4組小鼠腹腔注射PBS 200 μL，第0、7、14、21、28天，每組隨機選取4只小鼠稱重，取平均值。第4組為對照組小鼠體重平穩(wěn)增長，第3組小鼠灌喂PBS并腹腔注射IHNV，與第4組相比體重增長緩慢，第1組和第2組第1～7天灌喂萊茵衣藻時體重較對照組增長緩慢，將數據進行SPSS統計可得，第1組29.6±0.063ab；第2組26.7±0.31b；第3組22.7±0.03a；第4組23.9±0.64a。由數據可知，腹腔注射IHNV后體重增長明顯高于對照組，說明口服萊茵衣藻可增強免疫，促進生長，第1組和對照比，差異極顯著；第2組和對照組相比，差異顯著；而由圖7可知，第1組灌喂轉基因萊茵衣藻小鼠體重增長高于第2組，說明轉基因萊茵衣藻對小鼠體重變化的影響更為顯著。

圖7 小鼠平均體重變化

第3組：PBS攻毒組，第4組：PBS組

2.8 小鼠脾臟細胞淋巴細胞亞群的測定結果 將轉基因萊茵衣藻，萊茵衣藻，PBS分別給小鼠灌喂，連續(xù)灌喂7天，第8天對小鼠進行攻毒，第14天每組隨機取4只小鼠，在無菌條件下取小鼠脾臟，并分離制備脾細胞懸液，用抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a單克隆抗體孵育后用流式細胞儀進行檢測，測定各組小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群變化情況見表1，淋巴細胞和CD3+T淋巴細胞設門方法如中插彩版圖8，結果如中插彩版圖9。試驗結果顯示，灌喂轉基因萊茵衣藻組CD4+T淋巴細胞含量極顯著高于其他3組，CD8+T淋巴細胞含量與對照組相比也有所增加。轉基因萊茵衣藻組和萊茵衣藻組CD4+、CD8+T淋巴細胞含量都有所增加，都能夠刺激小鼠體內T淋巴細胞的增值，并且小鼠無死亡現象，證明重組之后的蛋白不能對小鼠產生毒理效應并且能夠刺激小鼠的免疫指標升高。

表1 流式細胞儀測定各組小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群變化情況 (x±s,%)

3 討論

萊茵衣藻是單細胞真核生物，隸屬于綠藻門，團藻目，衣藻屬，其結構簡單，生產成本低廉，可作為魚類的天然餌料[10-12]。本實驗室構建的重組萊茵衣藻通過IHNV病毒的糖蛋白基因插入到pChlamy-4載體上構成pCh-IHNV-G重組質粒，經大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞的擴增后，提取質粒，將pCh-IHNV-G重組質粒線性化，用電穿孔技術將其導入細胞壁缺陷型萊茵衣藻中，線性化pCh-IHNV-G與萊茵衣藻基因組隨機重組，利用抗性篩選出轉基因萊茵衣藻。Western Blot的分析結果表明，糖蛋白在萊茵衣藻中得到了表達，具有反應原性，本研究將轉基因萊茵衣藻喂給小鼠，連續(xù)灌喂7 d后進行攻毒試驗，應用流式細胞術檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群的變化情況，結果顯示，轉基因萊茵衣藻可刺激小鼠體內T淋巴細胞的增值，從而有助于提高機體的免疫應答，證明了轉基因萊茵衣藻具有一定的抗原性。

萊茵衣藻與螺旋藻相似可提高機體的免疫力，所以相應的灌喂萊茵衣藻的小鼠體內T淋巴細胞的數量也有所增加。但是轉基因萊茵衣藻對提高機體的免疫應答方面更具有優(yōu)勢，其優(yōu)勢主要體現在外源蛋白的表達上面。樊振川等[13]闡述了萊茵衣藻作為綠色細胞工廠生產重組蛋白的研究，表明利用萊茵衣藻葉綠體基因組和核基因組已成功表達了多種重組蛋白,如蛋白亞基疫苗、單鏈抗體、蛋白細胞因子、蛋白類激素和工業(yè)養(yǎng)殖業(yè)用酶等,初步證實了萊茵衣藻作為綠色細胞工廠方面的實用性。Beltran-Lopez 等[14]在萊茵衣藻葉綠體基因組中成功表達了口服嵌合蛋白 CTB p210。Dauvillée 等[15]成功地融合了AMA1 和 MSP1兩種臨床相關的瘧疾抗原，并將其結合到宿主細胞中的淀粉基質蛋白-淀粉合酶顆粒上。轉化進入萊茵衣藻核基因組中，隨后在葉綠體中進行淀粉顆粒轉化。小鼠通過口服和腹腔注射兩種方法用轉基因淀粉顆粒進行免疫，兩組均顯示瘧原蟲顯著減少，小鼠壽命有所增加。Sun等[16]將口蹄疫病毒抗原VPl與霍亂毒素B亞基(CTB)融合，重組到衣藻葉綠體表達載體中并且成功表達，融合蛋白CTBVP1顯示出一定的生物活性，證明了萊茵衣藻可以用來生產口服疫苗，并產生黏膜免疫。針對IHNV造成幼魚死亡率極高，而且魚類的主要免疫途徑為黏膜免疫，我們將IHNV的主要抗原糖蛋白在萊茵衣藻中得到了表達，為進一步研制口服IHNV疫苗奠定基礎。

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