李霄陽， 陳小玲， 何后軍， 李永清

(1.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ，江西 南昌 330045 ； 2.北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

牛出血性敗血癥，簡稱牛出敗(HSC)，是由多殺性巴氏桿菌(Pm)引起的一種急性、高發(fā)病率、高致死性的敗血性疾病。臨床癥狀分為敗血型、水腫型和肺炎型。本病一般呈散發(fā)或地方流行性，病死率可達80%以上，OIE將其定為二類傳染病。2006年以來該病對我國養(yǎng)牛業(yè)的危害極其嚴重，至2015年，該病在我國至少10個省區(qū)發(fā)生與流行。

根據(jù)通用的Carter分型系統(tǒng)，Pm可分為A、B、D、E和F 5個莢膜血清群和16個脂多糖血清型(1-16)[1-2]。引起國內(nèi)牛出敗的Pm過去為B群或B:2，5型[3]，2008年馬文戈等在國內(nèi)首次報道分離出牛源莢膜A群Pm，此后莢膜A群分離株逐漸增多[4-8]。Townsend等[9]建立了Pm多重PCR莢膜血清群分群方法，該方法在國內(nèi)外已取代了常規(guī)血清學分群方法[4-8,10]。2016年末本實驗室收到北京和山東兩個奶牛場送檢的各1頭病死牛組織，懷疑死于牛出敗。本文將實驗室細菌分離鑒定結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料及所用菌株 病料采自北京和山東某奶牛場的疑似HSC病死牛肺、心、肝組織。3株多殺性巴氏桿菌參考株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌株編號：(1)1672-C46-14，血清型A：1；(2)448-C45-11，血清型B2，5；(3)1668-C45-9，血清型B2，5；以下簡稱為A1672、B448和 B1668。表皮葡萄球菌為本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑 5%血清TSA、5%血清TSB、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基為本實驗室制備；革蘭染液、瑞氏染液，購自珠海貝索生物技術有限公司；2× PCR PremixTaqTM，購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。PCR引物合成由中美泰和生物技術(北京)有限公司完成。

1.3 實驗動物 體重18 g～22 g SPF級BALB/c小鼠，購自北京大學醫(yī)學部。

1.4 病原分離培養(yǎng) 將兩頭病牛組織研磨后用無菌PBS配成1∶10懸液，腹腔注射小鼠各2只，0.2 mL/只。小鼠死亡后，無菌采集其肺、心、肝臟接種血清TSA和麥康凱瓊脂平板，并抹片染色鏡檢。細菌37 ℃培養(yǎng)20 h后觀察菌落生長狀況及形態(tài)。挑選在血清TSA生長而麥康凱瓊脂平板上不生長的單個可疑菌落，轉接血清TSA或TSB，37 ℃培養(yǎng)過夜后，甘油保種并涂片染色鏡檢。

1.5 分離株致病性試驗 將分離到的病原菌接種于血清TSB培養(yǎng)基3 mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，其OD600值在1.0左右(約109CFU/mL)，兩株細菌Pm1、Pm2各腹腔接種2只小鼠，另設2只PBS對照。逐日觀察發(fā)病死亡情況。

1.6 PCR鑒定細菌的種、莢膜群和脂多糖血清型 合成Townsend等設計的Pm種特異性引物、莢膜A群和B群特異性引物[9]做單PCR和雙重PCR對分離株進行種和血清群鑒定。合成Harper設計的脂多糖基因1-3型引物[2]做三重PCR株鑒定LPS基因型。PCR引物序列與相關信息見表1。三組PCR均用25μL反應體系，含TaKaRa 2x PCR premix 12.5 μL，10 pmol/μL引物各1μL，煮沸法粗制DNA模板各2 μL。PCR設已知莢膜A群和B群對照和陰性對照。PCR程序參考TaKaRa 2x PCR premix試劑說明書7 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠120V電泳25 min后在UV下觀察并拍照。

1.7 透明脂酸抑制試驗鑒定莢膜A群Pm 莢膜A群Pm遇到葡萄球菌會使靠近葡萄球菌的Pm菌落變小，即A群Pm莢膜所含的透明脂酸有被葡萄球菌產(chǎn)生的透明脂酸酶降解的特性[11]。 將被檢菌株在TSA平板上間隔2-3 mm平行劃線，然后用表皮葡萄球菌與之交叉劃線，過夜培養(yǎng)后觀察。

2 結果

2.1 涂片鏡檢 感染牛病料后死亡小鼠的肺、肝及心臟組織涂片，均可檢出革蘭陰性短小桿菌，瑞氏染色兩級著色明顯。分離菌菌落涂片鏡檢呈現(xiàn)革蘭陰性兩端鈍圓的短小球桿菌并有莢膜，瑞氏染色呈兩極著色(見中插彩版圖1)。

2.2 分離菌培養(yǎng)特征和生化鑒定 小鼠肺、肝和心臟組織在血清TSA及麥康凱平板培養(yǎng)18 h～24 h后，血清TSA上生長出黏液狀、半透明、光滑圓潤的菌落，斜光源40倍解剖鏡觀察菌落呈半透明并有藍綠光，麥康凱瓊脂平板上不生長。生化試驗鑒定為多殺性巴氏桿菌。

2.3 分離株回歸小鼠的致病力 Pm1和Pm2分離株培養(yǎng)菌液腹腔接種小鼠后，2組小鼠于6～24 h內(nèi)死亡，PBS對照組無不良反應。

2.4 PCR鑒定Pm種、莢膜分群和脂多糖基因型 結果見圖2。三組PCR中陰性對照都無擴增。分離株Pm1、Pm2和3個參考株都擴增出約0.5 kb(460 bp)的Pm種特異性條帶；莢膜分群PCR中A1672參考株與A、B群引物都不反應，Pm1和Pm2 擴增出約1 kb(1 044 bp)的莢膜A群條帶，B448和B1668擴增出約0.8 kb(760 bp)的莢膜B群條帶。脂多糖基因型鑒定PCR顯示A1672不產(chǎn)生任何條帶，Pm1和Pm2擴增出約0.5 kb(474 bp)的脂多糖3型條帶，B448和B1668擴增出約0.8 kb(810 bp)的脂多糖2型條帶。

圖2 Pm種、莢膜分群和脂多糖基因型PCP鑒定

A:Pm種特異性PCR; B:莢膜分群PCR; C：脂多糖分型PCR。M：DNA Marker; 1:陰性對照； 2：A1672； 3：Pm1； 4：Pm2; 5：B448； 6：B1668

2.5 莢膜A群透明脂酸抑制試驗 分離株Pm1和Pm2在血清TSA培養(yǎng)基上靠近表皮葡萄球菌的地方菌落變小(見中插彩版圖3)，A1672也顯示了陽性反應，但不如Pm1和Pm2明顯；B448則未被抑制，與預期相符。

3 討論

這是本課題組初次從牛病料分離出Pm，過程并不順利。拿到病料后先接種培養(yǎng)基、做組織涂片染色鏡檢，沒有發(fā)現(xiàn)典型兩極染色的小桿菌。次日平板上長出很多菌落，挑取各種代表菌落做Pm種特異性PCR和溶血性曼氏桿菌PCR，無陽性；做16S rRNA 測序，測出有與波氏桿菌屬、創(chuàng)傷球菌屬等同源性99%～100%的序列，查文獻似與本病無關。

然后取出冷凍的原始病料研磨提取DNA，再做Pm種特異性PCR，溶血性曼氏桿菌PCR和牛支原體、絲狀支原體PCR，仍無陽性條帶。再次找出保存的原始病料，接種小鼠。小鼠48 h內(nèi)死亡，從小鼠組織分離到比較純的菌落。經(jīng)過染色鏡檢，Pm種PCR，16S rRNA測序，鑒定出Pm。用分離菌回歸小鼠顯示出強致病力。這次的經(jīng)歷驗證了教科書和OIE文獻所述，即慢性病例或腐敗材料不易發(fā)現(xiàn)典型菌體和分離出巴氏桿菌，而小鼠對外來的污染微生物能起到屏蔽作用，Pm使小鼠很快死亡，有利于獲得病菌的純培養(yǎng)。

在用PCR對分離株和參考株做莢膜分群時發(fā)現(xiàn)A群參考株不反應，換用改進的引物[7]和另1對擴增564 bp的A群特異性引物[1]也不反應。又對該菌株進行了D、E、F群的單PCR檢驗，同時以Pm種特異性PCR為對照。結果該菌株只擴增出460 bp 的Pm種特異性片段。Arumugam等研究發(fā)現(xiàn)，22/114株Pm (19%)不能用Townsend的mPCR鑒定出血清群, 在此之前還有至少4篇文獻給出了同樣評價，即該mPCR產(chǎn)生的不可分群的菌株比例為2%～9%[10-11]。

為探究A1672 參考株PCR分群不成功的原因，又做了鑒定莢膜A群的透明脂酸抑制試驗[11]，分離菌Pm1和Pm2試驗結果為陽性，而A1672檢驗2次顯示弱陽性，另2次與陰性對照B448難以區(qū)別。我們還制備了3個參考株的兔高免血清，用瓊擴試驗進行檢驗[1]，結果A1672抗原與對應血清不反應，其對應血清與2個分離株抗原也不反應；2個B群抗原與對應B群血清反應良好，與2個分離株抗原不反應。是否A群參考株在人工傳代過程中丟失了莢膜[10]，或者其莢膜基因出現(xiàn)了缺失或變異，影響了它的免疫原性和分子技術對它的血清群鑒定？我們又做了Pm脂多糖分型PCR[2]，檢驗用LPS基因可否將其分型。PCR結果(中插彩版圖3)顯示，2個B群參考株與L2引物呈陽性反應，與已知其為2，5血清型一致；分離株Pm1和Pm2與L3引物呈陽性反應，可認定為脂多糖基因3型，它代表血清型3，4型。已知A1672是血清1型，而其LPS-PCR結果與3對引物都未擴增。脂多糖是Pm的優(yōu)勢免疫原，對滅活菌苗的同源保護至關重要[2]，這也是國內(nèi)首次用Pm脂多糖PCR鑒定了與國內(nèi)和亞洲牛出敗流行脂多糖血清型相關的幾個基因型。

總之，本試驗研究為2008年以來國內(nèi)日漸增多的牛源Pm分離株添加了一點新數(shù)據(jù)。將不新鮮的死牛病料先接種小鼠可極大地提高分離Pm的成功率并節(jié)省時間。Pm莢膜分群PCR和脂多糖PCR能快速鑒定出分離株的莢膜血清群和脂多糖基因型。A1672參考株不能分群分型的問題有待進一步研究。

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