張?jiān)鰳s，杜華銳，李晴云，楊朝武，邱莫寒，蔣小松*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.四川大恒家禽育種有限公司，成都 610066；3.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

大恒雞與金陽(yáng)絲毛雞TGFB2基因在不同組織中的表達(dá)差異

張?jiān)鰳s1，2，3，杜華銳1，2，李晴云1，2，楊朝武1，2，邱莫寒1，2，蔣小松1，2，3*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.四川大恒家禽育種有限公司，成都 610066；3.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

【目的】探討TGFB2基因?qū)﹄u肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的影響?！痉椒ā坷枚縋CR方法對(duì)TGFB2基因在雞不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行了比較研究?！窘Y(jié)果】研究結(jié)果顯示：2周齡大恒雞腿肌中TGFB2 mRNA表達(dá)量顯著高于金陽(yáng)絲毛雞，并且達(dá)到最高值。10周齡金陽(yáng)絲毛雞母雞胸肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均顯著高于大恒雞，并達(dá)到最高值；大恒雞公雞10周齡腿肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均與其他周齡差異顯著，并達(dá)到最高值。金陽(yáng)絲毛雞、大恒雞母雞10周齡胸肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均顯著高于2周齡?！窘Y(jié)論】TGFB2基因可能是影響雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因。

雞；TGFB2基因；定量PCR；組織表達(dá)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一組蛋白超家族。TGF-β的命名是根據(jù)這種細(xì)胞因子能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，即在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)同時(shí)存在的條件下，改變成纖維細(xì)胞巾壁生長(zhǎng)特性而獲得在瓊脂中生長(zhǎng)的能力，并失去生長(zhǎng)中密度信賴(lài)的抑制作用。起初對(duì)TGF-β的生物學(xué)功能研究主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞的生長(zhǎng)。TGF-β1、TGF-β2促進(jìn)成纖維細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生，其機(jī)理可能是通過(guò)對(duì)IL-6基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，也抑制上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪、心肌、骨骼肌的形成。TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3在大多數(shù)生物學(xué)作用方面非常相似，但在有些作用方面可有很大差異，如TGF-β2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用僅為T(mén)GF-β1和TGF-β3 的 1％[1]。

大恒699肉雞配套系(大恒雞)來(lái)自四川大恒家禽育種有限公司，目前在全國(guó)18個(gè)省市推廣，70日齡商品代肉雞體重公雞2.32 kg、母雞1.79 kg，公母雞平均耗料增重比2.45。金陽(yáng)絲毛雞是一個(gè)古老而稀有的地方雞種，主要產(chǎn)于四川省涼山州金陽(yáng)縣，毗鄰的昭覺(jué)、雷波、布拖縣有零星分布,該雞種耐粗飼、肉質(zhì)鮮美、外觀獨(dú)特，作為肉用和藥用品種深受消費(fèi)者喜愛(ài)，但由于缺乏系統(tǒng)的保種研究和開(kāi)發(fā)利用，該品種依然存在整齊度差、生產(chǎn)性能不高以及存活率偏低等問(wèn)題，金陽(yáng)絲毛雞7月齡平均體重1.40 kg，成年公雞平均體重2.23 kg，成年母雞平均體重1.45 kg。

TGFB2基因作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的一種亞基，對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響。目前，TGFB2基因作為家禽肌肉生長(zhǎng)候選基因的相關(guān)研究報(bào)道不多，而雞TGFB2基因組織表達(dá)差異的研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。大恒雞與金陽(yáng)絲毛雞生長(zhǎng)速度差異大，本研究利用定量PCR方法研究TGFB2基因在這兩種雞不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行比較研究，為篩選能用于雞肌肉組織的生長(zhǎng)和發(fā)育標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取大恒699肉雞、金陽(yáng)絲毛雞兩個(gè)雞種，每個(gè)雞種在2周齡、6周齡、10周齡采集15公15母樣本。每組通過(guò)放血的方法屠宰，屠宰之前禁食12h，屠宰之后迅速采集右側(cè)的胸肌、腿肌和肝臟組織，同時(shí)測(cè)定屠宰數(shù)據(jù)。所有采集的樣品迅速置于液氮中保存，用于做熒光定量PCR分析。

1.2 各組織總RNA的提取

用Trizol法提取兩雞種各個(gè)時(shí)期的胸肌、腿肌、下丘腦、垂體中的總RNA。測(cè)定RNA濃度和純度，置-70℃保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

雞TGFB2基因的引物設(shè)計(jì)參照cDNA序列(GenBank注冊(cè)號(hào)NM_001031045.3序列)，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物序列為5’-CGAAAATGCCATCC CACC-3’，下游引物序列為5’-GCTCTATCCGCTGC TCCGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為161 bp。

GAPDH作為內(nèi)參基因，GAPDH基因引物設(shè)計(jì)參照cDNA序列(GenBank注冊(cè)號(hào)NM_204305.1序列)，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物序列為5’-CTGCCCAGAACATCATCCCA’，下游引物序列為5’-CGGCAGGTCAGGTCAACAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為139 bp。引物由大連寶生物公司合成。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR Green I染料法，優(yōu)化熒光實(shí)時(shí)定量PCR 的反應(yīng)條件，確定反應(yīng)體系(25μL)：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL；下游引物(10μmol/L)0.5μL；cDNA 溶液2μL；dH2O 9.5μL。每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。設(shè)定陰性對(duì)照。擴(kuò)增參數(shù)同常規(guī)PCR。為了分析real-time PCR擴(kuò)增特異性，在定量擴(kuò)增參數(shù)后增設(shè)下列步驟：95℃1min；60℃1min；60℃30s，循環(huán)81次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是最準(zhǔn)確最靈敏的核酸檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)Bio-Rad CFX Manager軟件計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果，主要根據(jù)如下公式計(jì)算：

采用SPSS 19.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以“最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。本次統(tǒng)計(jì)采用2周齡的表達(dá)水平作為對(duì)照。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 常規(guī)PCR及測(cè)序結(jié)果

常規(guī)PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示TGFB2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，明亮，無(wú)雜帶，說(shuō)明產(chǎn)物具有很高的特異性。測(cè)序結(jié)果與目的序列一致性為100％，為目的基因片斷。

2.2 TGFB2基因的組織表達(dá)差異

2.2.1 TGFB2基因在大恒雞各周齡表達(dá)量的差異

TGFB2基因在大恒雞2周齡(14d)、6周齡(42d)、10周齡(70d)的不同組織(胸肌、腿肌、下丘腦、垂體)均存在表達(dá)，并且公雞與母雞表達(dá)的趨勢(shì)不同。由圖1可知，公雞6周齡胸肌中TGFB2基因表達(dá)量極顯著高于其余周齡的表達(dá)水平(P<0.01)；在腿肌組織中，10周齡的表達(dá)量極顯著高于2周齡、6周齡的表達(dá)水平(P<0.01)；在垂體組織中同樣也是10周齡表達(dá)高，并達(dá)到顯著水平(P<0.05)；在下丘腦組織中各周齡表達(dá)差異不顯著。

由圖2可知，母雞10周齡胸肌組織中TGFB2基因的表達(dá)量與2周齡相比達(dá)到顯著水平(P<0.05)，與6周齡差異不顯著；腿肌組織中6周齡的表達(dá)量高于2周齡腿肌組織中的表達(dá)量，并達(dá)到顯著水平，與10周齡腿肌組織中的表達(dá)量差異不顯著；下丘腦組織中6周齡的表達(dá)量顯著高于10周齡的表達(dá)量(P<0.05)；垂體組織中10周齡的表達(dá)水平極顯著高于6周齡的表達(dá)水平(P<0.01)。

圖1 TGFB2基因在大恒雞公雞不同時(shí)期、組織的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of male Daheng chicken

圖2 TGFB2基因在大恒雞母雞不同時(shí)期、組織的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of female Daheng chicken

2.2.2 TGFB2基因在金陽(yáng)絲毛雞各周齡表達(dá)量的差異

TGFB2基因在金陽(yáng)絲毛雞各周齡胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織中均存在表達(dá)，并且公雞與母雞表達(dá)的趨勢(shì)基本相同。

由圖3可知，公雞胸肌和腿肌中各個(gè)周齡TGFB2基因的表達(dá)量的差異均不顯著；下丘腦組織中，各個(gè)周齡的表達(dá)量彼此之間差異極顯著(P<0.01)，其中6周齡的表達(dá)量最高，10周齡次之；垂體組織中，10周齡的表達(dá)量顯著低于2周齡(P<0.05)，其余周齡間差異不顯著。

由圖4可知，母雞胸肌中10周齡TGFB2基因的表達(dá)量極顯著高于2周齡和6周齡的表達(dá)量(P<0.01)；腿肌組織中，各周齡差異不顯著；下丘腦組織中，6周齡的表達(dá)量顯著高于2周齡的表達(dá)量(P<0.05)，其余周齡差異不顯著；垂體組織中，10周齡的表達(dá)水平極顯著低于2周齡(P<0.01)，其余周齡間差異不顯著。

2.2.3 TGFB2基因在不同雞種各周齡表達(dá)量的差異

TGFB2基因在2周齡不同雞種公雞和母雞胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織表達(dá)的差異見(jiàn)圖5與圖6，均以大恒肉雞為對(duì)照。

由圖5可知，金陽(yáng)絲毛雞公雞胸肌組織中TGFB2基因的表達(dá)量與大恒雞之間差異不顯著；大恒雞腿肌組織中的表達(dá)量顯著高于金陽(yáng)絲毛雞(P<0.05)；在下丘腦、垂體組織中，各雞種的表達(dá)量均不顯著。由圖6可知，大恒雞母雞胸肌組織中TGFB2基因的表達(dá)量極顯著高于金陽(yáng)絲毛雞(P<0.01)；金陽(yáng)絲毛雞腿肌組織中的表達(dá)量顯著低于大恒雞(P<0.05)。綜上分析，在2周齡不同雞種的公雞和母雞在不同組織中的表達(dá)趨勢(shì)不同，說(shuō)明TGFB2基因在不同雞種的公雞和母雞中各有優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織。

圖3 TGFB2基因在金陽(yáng)絲毛雞公雞不同時(shí)期、組織的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of male Jinyang Silky Chicken

圖4 TGFB2基因在金陽(yáng)絲毛雞母雞不同時(shí)期、組織的相對(duì)表達(dá)量Figure 4 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of female Jinyang Silky Chicken

圖5 TGFB2基因2周齡公雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 5 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 14d

圖6 TGFB2基因2周齡母雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 6 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 14d

TGFB2基因在6周齡不同雞種公雞和母雞胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織表達(dá)的差異如圖7與圖8所示。

由圖7可知，在6周齡各雞種公雞胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織中TGFB2基因的表達(dá)量均差異不顯著。由圖8可知，6周齡各雞種母雞胸肌、腿肌、下丘腦組織中TGFB2基因的表達(dá)量差異均不顯著，大恒雞垂體組織中的表達(dá)量顯著低于金陽(yáng)絲毛雞(P<0.05)。綜上分析，在6周齡各雞種不同組織間雖均有表達(dá)但差異不大，表達(dá)趨勢(shì)一致。

TGFB2基因在10周齡不同雞種公雞和母雞胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織表達(dá)的差異如圖9與圖10所示。

由圖9可知，10周齡不同雞種公雞胸肌、腿肌、下丘腦、垂體組織中TGFB2基因的表達(dá)量差異不顯著。由圖10可知，10周齡金陽(yáng)絲毛雞母雞胸肌、垂體組織中TGFB2基因的表達(dá)量極顯著高于大恒雞(P<0.01)；腿肌、下丘腦組織中的表達(dá)各個(gè)雞種間差異均不顯著。綜上分析，在母雞中，金陽(yáng)絲毛雞的胸肌為優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織。

圖7 TGFB2基因6周齡公雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 7 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 42d

圖8 TGFB2基因6周齡母雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 8 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 42d

圖9 TGFB2基因10周齡公雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 9 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 70d

圖10 TGFB2基因10周齡母雞不同雞種、組織的表達(dá)量Figure 10 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 70d

3 討論

TGF-β 超家族包含 3種亞型，TGF-β2(transforming growth factor，beta 2)是其中的成員。TGF-β 是具有多種功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生[2]、發(fā)育、分化[3]等生命活動(dòng)，并對(duì)于骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖具有深遠(yuǎn)的影響。目前主要集中于TGFB/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所引起的疾病[4-6]和治療[7]方面的研究。有關(guān)TGFB2與雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的研究較少。因此，本研究為此提供了理論基礎(chǔ)。

Li H等[8]研究該基因的多態(tài)性對(duì)雞生長(zhǎng)與體組成性狀的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因在雞生長(zhǎng)和發(fā)育中具有廣泛的影響。de Mello F等[9]在魚(yú)肌肉上表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，tgf-β2基因能動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)修復(fù)以及衛(wèi)星細(xì)胞的分化，證實(shí)該基能調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育。Lu Y 等[10]采用 q-PCR 技術(shù)研究 TGF-β2、TGF-β3以及FGF2基因在胚胎期10d、孵化當(dāng)天、出生后45d肉雞和蛋雞腿肌組織的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因均在胚胎期的表達(dá)極顯著高于其余的階段(P<0.01)。由此說(shuō)明，在雞胚胎期以及出生后的一定階段該基因?qū)ν燃〗M織的表達(dá)調(diào)控處于高峰期，并可能對(duì)雞腿肌的成肌細(xì)胞的增殖起重要作用。

該基因在不同品種組織中差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，2周齡大恒雞腿肌中TGFB2 mRNA表達(dá)量顯著高于金陽(yáng)絲毛雞，并且達(dá)到最高值。10周齡金陽(yáng)絲毛雞母雞胸肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均顯著高于大恒雞，并達(dá)到最高值；大恒雞公雞10周齡腿肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均與其他周齡差異顯著，并達(dá)到最高值。金陽(yáng)絲毛雞、大恒雞母雞10周齡胸肌組織中TGFB2 mRNA表達(dá)量均顯著高于2周齡。金陽(yáng)絲毛雞各周齡的表達(dá)模式與大恒雞種不同，僅在6周齡下丘腦組織有顯著高表達(dá)(P<0.05)，并且在垂體組織的表達(dá)值最低。下丘腦為內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的中心，與垂體組成完整的神經(jīng)內(nèi)分泌功能系統(tǒng)，其中的腺垂體可分泌生長(zhǎng)激素(GH)，進(jìn)而促進(jìn)肌肉增生和動(dòng)物的生長(zhǎng)。該生長(zhǎng)因子在金陽(yáng)絲毛雞下丘腦高表達(dá)，釋放抑制激素，抑制腺垂體合成生長(zhǎng)激素，從而抑制金陽(yáng)絲毛雞在該階段的生長(zhǎng)發(fā)育。因此推測(cè)TGFB2基因可作為影響雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因。

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Tissue-specific Expression of the Daheng Chicken and Jinyang Silky Chicken TGFB2 Gene

ZHANG Zeng-rong1，2，3，DU Hua-rui1，2，LI Qing-yun1，2，YANG Chao-wu1，2，QIU Mo-han1，2，JIANG Xiao-song1，2，3*
(1.Sichuan Animal Science Academy，Chengdu 610066，China；2.Sichuan Daheng Poultry Breeding Company，Chengdu 610066，China；3.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China)

【Objective】 The aim of this study is to detect the impact of the TGFB2 on chicken meat flavor traits.【Method】In this study，we quantified chicken TGFB2 gene expression in Daheng chicken and Jinyang Silky Chicken，to discern the tissue and ontogenic expression pattern and its effect on muscle development.Real-time quantitative PCR assay was developed for accurate measurement of the TGFB2 mRNA expression in various tissues from chickens of different ages(2，6 and 10 week).【Results】The result showed that expression of the TGFB2 mRNA was detected in all tissues，regardless of age.The leg muscle tissues of Daheng chicken had the higher expression of the TGFB2 gene than that of Jingyang Silky chicken at 2 week(P<0.05).The breast muscle tissues of had the higher expression of the TGFB2 gene than that of Daheng chicken at 10 week(P<0.05).The leg muscle tissues of Daheng chicken had the highest expression of the TGFB2 gene at 10 week.The breast muscle tissues of Daheng chicken and Jingyang Silky chicken had the higher expression of the TGFB2 gene at 10 week than that at 2 week(P<0.05).【Conclusion】We speculated that the chicken TGFB2 gene may be related to chicken development.

chicken；TGFB2gene；real-timePCR；tissueexpression

Q954.6

A

1000-2650(2017)01-0081-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.012

2016-08-25

四川省科技支撐計(jì)劃(2015NZ0101)；四川省基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(SASA2014A10)；四川省科研院所成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(15010126)。

張?jiān)鰳s，男，博士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種，E-mail：zhangzengrong2004@163.com；*責(zé)任作者：蔣小松，博士，研究員，主要從事家禽遺傳育種，E-mail：xsjiang@sasa.cn。

(本文審稿：劉益平；責(zé)任編輯：秦碧雯；英文審稿：劉益平)