梁國斌，林 偉，汪 斌，朱 華，賀沁婷，周全法

（江蘇理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 常州 213001）

分批培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母合成谷胱甘肽的前體氨基酸優(yōu)化策略

梁國斌，林 偉，汪 斌，朱 華，賀沁婷，周全法

（江蘇理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 常州 213001）

通過分批培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis），優(yōu)化前體氨基酸(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)添加促進谷胱甘肽(GSH)合成。首先分析C.utilis培養(yǎng)時胞內(nèi)3種氨基酸自身合成動態(tài)；菌體生長階段，考察前體氨基酸添加對GSH合成及細(xì)胞生長的影響；GSH合成階段，通過響應(yīng)面優(yōu)化混合氨基酸添加配比；最后提出菌體生長階段添加甘氨酸及GSH合成階段添加3種混合氨基酸的兩階段優(yōu)化策略。搖瓶結(jié)果表明，菌體培養(yǎng)第2小時添加甘氨酸（6 mmol/L），第10小時添加混合氨基酸（谷氨酸 6 mmol/L、甘氨酸 5.5 mmol/L、半胱甘酸 6.5 mmol/L），菌體培養(yǎng)30 h后，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)率為10.41 g/L和278 mg/L，比對照增加10.5%和116%；應(yīng)用于5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)12.81 g/L，GSH產(chǎn)率為328 mg/L。

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）；谷胱甘肽；氨基酸；響應(yīng)面

0 引言

γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸又稱谷胱甘肽（GSH），在生命活動中具有抗氧化，免疫功能調(diào)節(jié)，促進糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、護膚美容、食品工業(yè)等行業(yè)[1]。目前工業(yè)化生產(chǎn)GSH的方法主要有酶法及發(fā)酵法[2]。研究表明，通過低pH值或氧化脅迫[3-4]、優(yōu)化培養(yǎng)基補料方式[5]、能量代謝[6]、酶活控制均可促進GSH合成[7]。

發(fā)酵法生產(chǎn)GSH時，如果胞內(nèi)3種前體氨基酸（谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸）不能滿足GSH合成和菌體生長，將會導(dǎo)致GSH最終產(chǎn)率下降。研究表明，半胱氨酸可顯著促進GSH合成，但同時抑制酵母菌體生長[8-9]。盡管前人在氨基酸添加促進GSH合成方面做了相關(guān)研究，但添加方式相對單一[10-11]。因而有必要系統(tǒng)考察C.utilis胞內(nèi)谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸合成動態(tài)，提出針對性的優(yōu)化策略。

為此，本研究通過考察C.utilis培養(yǎng)過程中菌體胞內(nèi)前體氨基酸合成動態(tài)變化情況，指出氨基酸優(yōu)化策略，為發(fā)酸法生產(chǎn)GSH提供一個全新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株：Candida utilis JSUT-08。

葡萄糖：分析純，上海實驗試劑有限公司；蛋白胨：生物試劑，上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；酵母粉：生物試劑，安琪酵母股份有限公司；硫酸銨、硫酸鎂：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：分析純，上海恒信化學(xué)試劑有限公司。

種子培養(yǎng)基（g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母粉 10；調(diào)培養(yǎng)基pH為6.0。

發(fā)酵分批培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15，硫酸銨5，酵母粉2，磷酸二氫鉀（KH2PO4)1.5，硫酸鎂 0.25；調(diào)培養(yǎng)基pH為5.5.

1.2 儀器與設(shè)備

YM-50L型不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；LG10-2.4A型高速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；HS-840-U潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CARY-50型紫外分光光度計：American Varian Pty Ltd；自動發(fā)酵罐（KFT-5 L）：Korea KoBio Tech Co.，Ltd.

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：在配制好的種子液體培養(yǎng)基中加入一定量瓊脂粉，滅菌后制作斜面，待冷卻至室溫，無菌條件下，接種斜面并放置生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，為分批培養(yǎng)C.utilis合成GSH所用。

種子培養(yǎng)：無菌操作條件下，通過接種環(huán)取一環(huán)菌體接種至裝有100 mL液體培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，放置搖床培養(yǎng)。

分批培養(yǎng)：全自動發(fā)酵罐KFT-5 L中裝發(fā)酵培養(yǎng)基3.0 L，接種量10%。

1.3.2 分析方法

細(xì)胞質(zhì)量濃度測定：取一定量發(fā)酵液，5 000 r/min離心15 min， 去上清液，65℃烘至恒質(zhì)量。

葡萄糖測定：3，5-二硝基水楊酸法[12]。

胞內(nèi)GSH提取及測定：取GSH培養(yǎng)液，5 000 r/min離心15 min,去上清液，40%乙醇抽提，離心得上清液用于GSH分析檢測；GSH測定方法參照文獻[13]。

氨基酸測定：C.utilis菌體胞內(nèi)3種氨基酸（谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸）測定方法參照文獻[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 C.utilis分批培養(yǎng)時胞內(nèi)前體氨基酸合成動態(tài)

設(shè)置初始葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L，5 L發(fā)酵罐中考察C.utilis分批培養(yǎng)時菌體胞內(nèi)谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸的動態(tài)變化。由圖1可知，發(fā)酵到第10小時時葡萄糖已基本耗完，此時菌體量為10.6 g/L，而GSH繼續(xù)合成，30 h達(dá)最大值150.6 mg/L。無論是在菌體生長階段還是GSH合成階段，胞內(nèi)3種氨基酸含量均較低，當(dāng)培養(yǎng)10 h葡萄糖被耗盡時，胞內(nèi)3種氨基酸含量則急劇降低。與半胱氨酸和甘氨酸相比，谷氨酸質(zhì)量濃度則相對較高，說明半胱氨酸和甘氨酸可能是GSH合成的關(guān)鍵限制因子。

2.2 C.utilis生長階段優(yōu)化前體氨基酸添加促進GSH合成

C.utilis分批培養(yǎng)時，在GSH合成階段可通過外部添加半胱氨酸或3種混合氨基酸提高胞內(nèi)GSH含量；而對于菌體生長階段，菌體自身是否可以提供足夠多的前體氨基酸用于GSH合成和細(xì)胞生長，卻少有報道。為此，作者進一步探究C.utilis生長階段（2～8 h）前體氨基酸添加對GSH合成的影響。

2.2.1 C.utilis生長階段優(yōu)化谷氨酸添加

圖1 C.utilis分批培養(yǎng)時細(xì)胞生長、GSH合成及胞內(nèi)前體氨基酸變化Fig.1 Cell growth，GSH production and three precursor amino acids concentrations in 5 L fermentor batch culture

如表1所示，搖瓶條件下，不添加谷氨酸（對照)，菌體停止生長時（第10小時），細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)9.46 g/L,此時GSH產(chǎn)率為93.2 mg/L；隨著谷氨酸添加時間延遲，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)率均相應(yīng)下降；添加濃度低于4 mmol/L可促進細(xì)胞生長和GSH合成。第2小時添加4 mmol/L谷氨酸，培養(yǎng)至第10小時時，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)率分別達(dá)最大值10.06 g/L和104.3 mg/L，分別比對照提高了6.3%和11.8%。上述結(jié)果表明，菌體生長階段谷氨酸對GSH合成影響不顯著，說明C.utilis菌體可通過胞內(nèi)自身代謝合成大量谷氨酸（Glu)[15]。

表1 C.utilis生長階段谷氨酸添加對GSH合成的影響Table 1 Effect of glutamic acid addition on GSH production at cell growth stage

2.2.2 C.utilis生長階段優(yōu)化甘氨酸添加

由表2可知，C.utilis細(xì)胞生長階段（2～8 h），通過外部添加甘氨酸濃度低于6 mmol/L時，隨著添加時間提前，促進細(xì)胞生長和GSH合成效果愈加顯著；添加濃度為8 mmol/L時，C.utilis生長和GSH合成均受到抑制而導(dǎo)致菌體量和GSH產(chǎn)率下降。研究結(jié)果表明，菌體生長階段甘氨酸最佳添加時間和濃度為：第2小時添加6 mmol/L甘氨酸，培養(yǎng)至第10小時，菌體量和GSH產(chǎn)率分別為10.41 g/L和125.0 mg/L，分別比對照提高10.1%和34.1%。

由于酵母胞內(nèi)甘氨酸合成不僅步驟多而且需在很多酶的催化下才能形成，導(dǎo)致其含量相對較低[16]。通過外部添加甘氨酸，一方面可直接促進GSH合成，另一方面胞內(nèi)自身代謝產(chǎn)生的絲氨酸則不需要轉(zhuǎn)化成甘氨酸而用于其他物質(zhì)合成。

表2 C.utilis生長階段甘氨酸添加對GSH合成的影響Table 2 Effect of glycine addition on GSH production at cell growth stage

2.2.3 C.utilis生長階段優(yōu)化半胱氨酸添加

發(fā)酵法合成GSH時，其分子中巰基由半胱氨酸提供，胞內(nèi)半胱氨酸含量較低，可通過外部添加促進GSH合成[17]。由于半胱氨酸極易氧化，因而通過控制溶解氧水平提高其利用效率[18]。由表3可知，半胱氨酸顯著抑制菌體生長，抑制程度與添加濃度成正比，與添加時間成反比。上述結(jié)果表明，菌體生長階段通過外部添加半胱氨酸（Cys）能顯著提高C.utilis細(xì)胞GSH合成能力，但同時細(xì)胞菌體生長受到抑制，最終導(dǎo)致GSH總產(chǎn)率下降。

2.3 響應(yīng)面（Central-Composite）優(yōu)化混合氨基酸添加濃度和比例

響應(yīng)面分析常用于目標(biāo)產(chǎn)品合成過程中多因素水平優(yōu)化及影響顯著性預(yù)測[19-20]。為此，在C.utilis分批培養(yǎng)的GSH合成階段，通過Central-Composite優(yōu)化3種混合氨基酸添加量及配比。

表3 C.utilis生長階段半胱氨酸添加對GSH合成的影響Table 3 Effect of cysteine addition on GSH production at cell growth stage

選擇谷氨酸、半胱氨酸與甘氨酸為3個因素，以GSH產(chǎn)量為響應(yīng)值，Central-Composite優(yōu)化GSH合成的氨基酸添加。

Central-Composite設(shè)計基于二階數(shù)學(xué)模型：

式中：Y 為響應(yīng)值(GSH 產(chǎn)率）；茁0為常數(shù)項；茁i、茁ij、茁ii為回歸系數(shù)；Xi、Xj為編碼后的變量（谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸）。

為了將合成GSH前體氨基酸有效轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物GSH，3種氨基酸添加濃度范圍設(shè)定在2～10 mmol/L（表 4）。

2.3.1 GSH合成模型方程建立

由表5可知，搖瓶試驗條件下，GSH產(chǎn)率最大值和最小值分別為273.5 mg/L和231.1 mg/L。

表6結(jié)果顯示，甘氨酸和半胱氨酸顯著影響GSH合成 (P＜0.05），而谷氨酸則不明顯。

表4 試驗變量編碼和水平Table 4 Codes and levels of variables

表5 Central-Composite試驗設(shè)計合成GSHTable 5 GSH production with central-composite experiments design

表6 Central-Composite優(yōu)化GSH合成回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table 6 Regression coefficients and significances test for GSH production optimized by centralcomposite design

Y=189.844+7.112X1+10.166X2+11.249X3－式中：Y 代表 GSH 產(chǎn)率（mg/L）；X1、X2和 X3代表谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸添加濃度，mmol/L。

2.3.2 C.utilis分批培養(yǎng)時前體氨基酸對GSH合成影響的交互作用

圖2（a-c）為3種前體氨基酸交互影響GSH合成響應(yīng)圖。與谷氨酸相比，甘氨酸和半胱氨酸對GSH合成影響顯著，此外，甘氨酸還顯著促進菌體生長。

圖2 前體氨基酸添加交互作用對GSH合成的響應(yīng)曲面Fig.2 Response surface plot of effect of interaction of three precursor amino acids addition on GSH production

2.3.3 C.utilis分批培養(yǎng)時前體氨基酸對GSH合成交互作用分析

回歸方程取一階偏導(dǎo)等于0，得到混合氨基酸添加最佳濃度與比例：谷氨酸 6 mmol/L、甘氨酸5.5 mmol/L、半胱氨酸 6.5 mmol/L，在此條件下，理論GSH產(chǎn)率可達(dá)278.3 mg/L。搖瓶實驗表明，在此條件下，實際GSH產(chǎn)率為277.9 mg/L，實驗值與模型預(yù)測值高度統(tǒng)一。

2.4 C.utilis分批培養(yǎng)時兩階段氨基酸添加策略優(yōu)化GSH合成和菌體生長

如圖3所示，搖瓶實驗條件下，不添加氨基酸，經(jīng)過10 h培養(yǎng)，葡萄糖耗盡（第10小時）時細(xì)胞停止生長，此時細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)最大值9.46 g/L，GSH產(chǎn)量為 93.2 mg/L，且30 h后GSH終產(chǎn)量達(dá)最大值128.4 mg/L；當(dāng)2 h添加6 mmol/L甘氨酸，到第10小時時，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)率分別為10.41 g/L和125.2 mg/L；通過兩階段氨基酸添加策略，菌體培養(yǎng)30 h后，GSH產(chǎn)率達(dá)278 mg/L，胞內(nèi)GSH含量為2.61%。

由于搖瓶實驗不能有效控制培養(yǎng)液pH變化，因而進一步在5 L罐上考察C.utilis分批培養(yǎng)時兩階段氨基酸添加優(yōu)化策略。如圖4所示，未加氨基酸，菌體培養(yǎng)10 h后，細(xì)胞質(zhì)量濃度為10.6 g/L，GSH產(chǎn)率為 104.3 mg/L，且30 h后GSH產(chǎn)率達(dá)最大值150.6 mg/L；當(dāng)2 h添加6 mmol/L甘氨酸，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)量在第10小時分別為12.81 g/L和150.3 mg/L；通過兩階段氨基酸添加策略，菌體培養(yǎng) 30 h后，GSH產(chǎn)率達(dá)328 mg/L，GSH胞內(nèi)含量為2.56%。

圖3 C.utilis分批培養(yǎng)時兩階段氨基酸添加策略促進GSH合成和菌體生長Fig.3 Enhanced GSH production and cell growth with two-stage amino acids addition strategy in batch culture

3 結(jié)論

圖4 發(fā)酵罐條件下兩階段氨基酸添加策略促GSH合成和菌體生長Fig.4 Enhance GSH production and cell growth with two-stage amino acids addition strategy in 5 L fermentor

與谷氨酸相比而言，C.utilis分批培養(yǎng)時胞內(nèi)甘氨酸和半胱氨酸含量相對較低；培養(yǎng)第2小時添加6 mmol/L甘氨酸可顯著促進GSH合成和菌體生長；GSH合成階段（10 h）添加3種混合氨基酸最佳配比為：谷氨酸 6 mmol/L、甘氨酸 5.5 mmol/L和半胱氨酸 6.5 mmol/L；為此，作者得出菌體生長階段（2 h）添加甘氨酸及GSH合成階段（10 h）添加混合氨基酸的兩階段氨基酸優(yōu)化策略。搖瓶條件下，培養(yǎng)30 h后，細(xì)胞質(zhì)量濃度和GSH產(chǎn)率達(dá)到 10.41 g/L和278 mg/L，5 L發(fā)酵罐中分別為12.81 g/L和328 mg/L。本研究提出的兩階段氨基酸優(yōu)化策略為發(fā)酵法生產(chǎn)GSH提供了一種全新思路。

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ENHANCED GLUTATHIONE PRODUCTION BY OPTIMIZING PRESURSOR AMINO ACIDS ADDITION IN BATCH CULTURE CANDIDA UTILIS

LIANG Guobin，LIN Wei，WANG Bin，ZHU Hua，HE Qinting，ZHOU Quanfa
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Jiangsu University of Technology，Changzhou 213001，China）

Glutathione(GSH) has the ability of antioxidant，immune function regulation，promoting carbohydrates，fat and protein metabolism in life activities，and is widely used in medicine，health care，skin care，beauty，food additives and other industries. Glutathione (GSH) production was optimized by precursor amino acids addition in batch cultivation of Candida utilis in the study. Initially，the dynamic changes of glutamic acid，glycine and cysteine in batch culture process were analyzed. Then，the effect of addition times and amounts of the three precursor amino acids on cell concentration and GSH production at bacterial growth stage was investigated.Finally, the two-stage addition optimization strategy of adding glycine at cell growth stage and mixed three kinds of amino acids at GSH production stage was developed. The results showed that glycine (6 mmol/L) was added at 2 h of C.utilis culture,stage and the mixed amino acids (glutamic acid of 6 mmol/L; glycine of 5.5 mmol/L;cysteine glycine of 6.5 mmol/L) were added at 10 h. After C.utilis culturing for 30 h, the cell dry weight and the yield of GSH was 10.41 g/L and 278 mg/L, respectively, which increased by 10.5% and 116% compared with control without amino acids addition. When the obtained two-stage amino acid addition strategy was applied in 5 L fermentor cultivation, the cell concentration was reached to 12.81 g/L and the yield of GSH was 328 mg/L after fermentation, which indicating the feasibility of adopted strategy.

Candida utilis；glutathione(GSH)； amino acids；response surface methodology

TS201.2

B

1673-2383(2017)06-0062-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171226.1723.022.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-12-26 17:24:10

2017-06-16

國家自然科學(xué)基金項目(21502074)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻聯(lián)合性研究項目(BY2015028-04)

梁國斌(1975—)，男，陜西安康人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為微生物工程、酶工程。