張源源，黃 肖，李維國

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/國家橡膠樹育種中心/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

溫度對橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的影響

張源源，黃 肖，李維國*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/國家橡膠樹育種中心/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

【目的】本研究旨在揭示環(huán)境溫度對橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的影響，為高效率的收集橡膠樹自然三倍體材料和人工施加溫度處理誘導橡膠樹三倍體，開展橡膠樹多倍體育種提供參考。【方法】采用子代多倍體頻率估算2n雌配子發(fā)生的方法，比較不同地點/年份橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率，采用相關性分析研究花發(fā)育期間的逐日溫度對橡膠樹GT1的2n配子發(fā)生頻率的影響。【結果】不同地點的橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率差異明顯，分別在0.71 %～7.01 %，同一地點不同年份間2n雌配子的發(fā)生頻率具有穩(wěn)定性。橡膠樹GT1的2n雌配子的發(fā)生頻率與花發(fā)育期的平均逐日最低溫的相關性極顯著，花發(fā)育期的溫度越低，2n雌配子的發(fā)生頻率越高?！窘Y論】花發(fā)育期的環(huán)境溫度對橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率有顯著影響，花發(fā)育期的溫度越低，2n雌配子的發(fā)生頻率越高。

溫度；2n配子；橡膠樹

【研究意義】天然橡膠作為重要的工業(yè)原料，對社會經(jīng)濟發(fā)展起著重要的作用。橡膠樹的品種選育和改良，是提高橡膠樹產(chǎn)量和改良膠乳品質，推動橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎。當前橡膠樹育種使用的魏克漢種質存在著遺傳背景狹窄的問題，且經(jīng)過多年的人工雜交，基因型高度雜合，導致難以利用雜種優(yōu)勢。多倍體在利用雜種優(yōu)勢效應的同時具有基因劑量效應，開展橡膠樹多倍體育種是解決橡膠樹育種面臨的困境的有效途徑之一，而篩選自然多倍體進行多倍體育種是最為直接的途徑。研究環(huán)境因素對橡膠樹自然多倍體發(fā)生頻率的影響對高效收集自然多倍體具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】未減數(shù)配子(2n配子)發(fā)生是開花植物產(chǎn)生多倍體的主要機制[1]，也是林木多倍體育種采用的主要途徑之一[2]。研究表明，環(huán)境因素尤其是溫度，對2n配子的發(fā)生有重要影響[3]。通過在大小孢子發(fā)生期間人工施加低溫、高溫處理，已經(jīng)在楊樹[4-6]、杜仲[7]、擬南芥[8]、薔薇[9]等多種植物中誘導獲得了2n配子。未減數(shù)雄配子(2n花粉)可以通過測量花粉粒直徑[10]直接觀察，而2n雌配子無法直接觀察，主要通過檢測子代多倍體進行間接觀察。橡膠樹中存在天然多倍體。胡東瓊等[11]從橡膠樹雄花敗育[12]的初生代無性系GT1[13]的實生苗中分離出了三倍體植株。劉陽平于1970年發(fā)現(xiàn)了一株橡膠樹天然三倍體[14]。張源源從橡膠樹GT1的自然授粉子代中檢測出3株天然三倍體[15]。Yao et al.從GT1與17個候選親本的自然授粉子代中檢測出8株三倍體[16]。李惠波等[17]證實通過 GT1×PR107自然雜交后代選育出的品種云研77-2和云研77-4為多倍體。眾多證據(jù)表明，橡膠樹GT1可以穩(wěn)定地產(chǎn)生2n雌配子，但其2n配子發(fā)生是否與環(huán)境溫度有關尚無研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】橡膠樹因其高大喬木且果實發(fā)育期長的特性，難以像楊樹[5]、擬南芥[8]一樣在人工氣候箱內(nèi)進行溫度處理，研究溫度對橡膠樹2n配子發(fā)生的影響。然而，橡膠樹在中國的種植范圍較廣，不同種植地區(qū)的環(huán)境條件差異為研究溫度對橡膠樹2n配子發(fā)生的影響提供了理想的自然溫差條件。本研究選取橡膠樹花期溫度差異較大的不同地區(qū)，采用子代多倍體頻率估算2n雌配子發(fā)生的方法，檢測橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率，分析花期的逐日溫度對橡膠樹2n配子發(fā)生的影響。【擬解決的關鍵問題】研究花發(fā)育期的溫度條件對橡膠樹GT1的2n雌配子的發(fā)生頻率的影響，為高效率的收集橡膠樹自然三倍體材料和人工施加溫度處理誘導橡膠樹2n配子發(fā)生，開展橡膠樹多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為不同年份從云南省西雙版納傣族自治州景洪市(N22°0′54.03″，E100°47′3.88″，海拔553 m)、西雙版納傣族自治州勐臘縣(N21°27′11.66″，E101°33′37.27″，海拔630 m)、德宏傣族景頗族自治州瑞麗市(N24°02′14.66″，E97°49′8.45″，海拔778 m)等地采集的橡膠樹GT1自然授粉種子育出的實生苗。不同采集地點的年份信息見表1。

1.2 倍性檢測

流式細胞倍性檢測參考康向陽等[18]的方法，用流式細胞儀(CyFlow?Ploidy Analyser)進行倍性分析。

1.3 不同地區(qū)/年份的溫度比較以及與2n雌配子發(fā)生頻率的相關性分析

橡膠樹花期的逐日溫度數(shù)據(jù)來源于云南省氣象信息服務中心。不同地區(qū)/年份的溫度差異采用方差分析、多重比較進行分析，溫度對2n雌配子發(fā)生頻率的影響采用相關性分析進行研究，數(shù)據(jù)分析在IBM SPSS22中文版中進行。

2 結果與分析

2.1 倍性檢測結果

橡膠樹GT1子代的倍性檢測結果(圖1和表1)表明，不同地點的橡膠樹GT1子代三倍體的得率差異明顯，分別在0.71 %～7.01 %，瑞麗地區(qū)的橡膠樹GT1子代的三倍體得率明顯高于景洪和勐臘地區(qū)，而同一地點不同年份的三倍體得率有穩(wěn)定性。

a：二倍體；b：三倍體 a: Diploid; b: Triploid圖1 流式細胞倍性分析Fig.1 Ploidy analysis by flow cytometry

地點/年份Locations/years檢測數(shù)Numberoftests二倍體株數(shù)Numberofdiploids三倍體數(shù)Numberoftriploids三倍體得率(%)Frequencyoftriploids景洪20104194163072景洪20122802782071勐臘20151593157716100瑞麗201515261419107701瑞麗201374969752694

2.2 不同地點/年份的橡膠樹花期的氣溫比較

云南不同地點和年份的橡膠樹GT1的花期(花芽分化-開花)均在2-3月，選取3月份(橡膠樹處于雌花減數(shù)分裂到胚囊發(fā)育時期)的最高溫、最低溫為分析對象。方差分析表明不同地點/年份的橡膠樹GT1雌花減數(shù)分裂到胚囊發(fā)育時期的逐日最高溫和最低溫存在極顯著差異，進一步多重比較結果(表2～3)表明，勐臘2015年的逐日最高溫與景洪2012年差異不顯著，與其它地區(qū)/年份差異均極顯著，景洪2012年逐日最高溫與瑞麗2013年和瑞麗2015年差異極顯著，與其它地區(qū)/年份間差異不顯著，瑞麗2013年和瑞麗2014年無顯著差異。景洪2010年、景洪2012年、勐臘2015年的逐日最低溫均極顯著的高于瑞麗2013年和瑞麗2015年，其余間均不顯著。

2.3 氣溫與橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的相關性

不同地點/年份的花期的平均最高溫和平均最低溫與橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的相關性分析結果(圖2)表明，2n雌配子的發(fā)生頻率與減數(shù)分裂到胚囊發(fā)育時期的平均逐日最高溫的相關性不顯著，相關系數(shù)為-0.817，與花發(fā)育期的平均逐日最低溫的相關性極顯著，相關系數(shù)為-0.991。表明減數(shù)分裂到胚囊發(fā)育期的逐日最低溫度對橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率有顯著影響，且溫度越低，2n雌配子的發(fā)生頻率越高。

表2 不同地點/年份的3月份逐日最高溫比較

注：同列數(shù)據(jù)后標的不同大寫字母表示不同品種之間差異極顯著(P<0.01)；同列數(shù)據(jù)后標的不同小寫字母表示不同品種之間差異極顯著(P<0.05)。下同。

Note: Date with different capital letters in the same column indicate statistically significant differences atP<0.01 between clones；Date with different lowercase letters in the same column indicate statistically significant differences atP<0.05 between clones.The same as below.

表3 不同地點/年份的3月份逐日最低溫比較

圖2 減數(shù)分裂到胚囊發(fā)育時期的溫度與橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的相關性Fig.2 Relationship between temperature of gametophyte development period and frequency of 2n female gametes of GT1

3 討 論

減數(shù)分裂是保持親代和子代染色體數(shù)目穩(wěn)定，保證物種相對穩(wěn)定的重要機制[19]。減數(shù)分裂過程的任何異常，如減數(shù)前加倍、染色體配對異常、胞質分離異常、第一次減數(shù)分裂缺失、第二次減數(shù)分裂缺失、不規(guī)則的后期分離、聯(lián)會突變、減數(shù)分裂后融合、二價體分離異常等均會產(chǎn)生2n配子[20-22]。在植物中，可以確認的2n配子發(fā)生途徑有兩類：第一次減數(shù)分裂核復原(first-division restitution，F(xiàn)DR)和第二次減數(shù)分裂核復原(second-division restitution，SDR)兩種。第一次減數(shù)分裂時同源染色體聯(lián)會和分離的缺失(形成單價體)，在第二次減數(shù)分裂時同源染色體的兩條姐妹染色單體移向兩極，最終形成FDR型2n配子。SDR型2n配子是指第一次減數(shù)分裂時同源染色體配對和分離正常(形成二價體)，而第二次減數(shù)分裂后期的姐妹染色單體未分離或姐妹染色單體分離而細胞質未分離形成的二倍性配子。

2n配子的發(fā)生主要由基因控制，但物理環(huán)境尤其是逆境刺激對基因的表達起著關鍵的作用[23-24]。在蕓苔屬雜種中，低溫可以誘導產(chǎn)生23 %的未減數(shù)配子[25]。在苜蓿中，溫度影響第二次減數(shù)分裂的缺失而產(chǎn)生2n雌配子的發(fā)生[26]。細胞學研究表明短時間的低溫處理會改變末期Ⅱ的徑向微管陣列的形成，進而導致減數(shù)后胞質分離的缺失和細胞壁的形成[21]。環(huán)境因素對控制2n配子發(fā)生基因的影響機制尚不明確，而短時間的低溫處理可以誘導擬南芥產(chǎn)生未減數(shù)配子，可以作為研究逆境對有性多倍化影響的分子和細胞學機制的模式系統(tǒng)[8]。橡膠樹GT1可以穩(wěn)定產(chǎn)生2n雌配子，但不同溫度條件下2n雌配子的發(fā)生頻率不同，可以推測橡膠樹GT1具有產(chǎn)生2n雌配子的基因。本研究發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境下橡膠樹GT1的2n雌配子的發(fā)生頻率顯著提高，與擬南芥[8][8]相同，而與楊樹[6]、杜仲[7]等相反。推測其原因為橡膠樹作為熱帶植物，在進化過程中適應了高溫環(huán)境，而對低溫敏感，低溫更易誘導橡膠樹產(chǎn)生2n雌配子的基因表達，從而打破雌配子的正常發(fā)育進程，提高2n雌配子的發(fā)生頻率。橡膠樹在低于適宜生長溫度條件下多倍體發(fā)生頻率的提高可為橡膠樹的抗寒育種提供新的思路。

本研究沒有完全排除2n花粉導致三倍體產(chǎn)生的情況，但Yao，et al.證實2n雌配子發(fā)生是GT1與17個候選父本的自然授粉子代中篩選出的8株三倍體的唯一來源途徑[16]，可以作為本研究中2n雌配子發(fā)生為唯一來源的佐證。

4 結 論

本研究表明，溫度對橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生有顯著影響，配子體發(fā)育時期的低溫可以誘導橡膠樹GT1的2n雌配子發(fā)生頻率的提高。平均最低溫10～11 ℃，平均最高溫27～28 ℃條件下，2n雌配子的發(fā)生頻率可以達到7 %左右。本研究結果可為高效率的收集橡膠樹自然三倍體材料提供依據(jù)，并為人工施加溫度處理誘導橡膠樹2n配子發(fā)生，開展橡膠樹多倍體育種提供參考。

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EffectofTemperatureonFrequencyof2nFemaleGametesofDiploidCloneinRubberTree(HeveabrasiliensisMuell．Arg.)

ZHANG Yuan-yuan，HUANG Xiao，LI Wei-guo*

(Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ State Centre for Rubber Breeding/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, P.R.China, P.R.China, Hainan Danzhou 571737,China)

【Objective】This study aimed to reveal the effects of the ambient temperature on the frequency of 2n female gametes of the rubber tree GT1, and to provide reference for efficient collection of natural triploid rubber tree and artificial temperature treatment to induce triploid of rubber tree.【Method】The frequency of 2n female gametes was estimated based on the polyploid frequency of offspring.The frequency of 2n female gametes in different locations / years of GT1 was compared.The person correlation analysis was used to study the effect of daily temperature during flower development on the frequency of 2n gametes in GT1.【Result】The frequency of 2n female gametes in GT1 in different locations was significantly different, ranging from 0.71 % to 7.01 %, and the frequency of 2n female gametes in different years in the same location was stable.The frequency of 2n female gametes in GT1 was significantly correlated with the average daily minimum temperature in flower development.The lower the temperature of flower development period, the higher the frequency of 2n female gametes.【Conclusion】The ambient temperature of flower development had a significant effect on the frequency of 2n female gametes in GT1.The lower the temperature of flower development, the higher the frequency of 2n female gametes.

Temperature；2n gamete；Heveabrasiliensis

1001-4829(2017)12-2634-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.004

2017-06-18

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項資金(1630022015015)；國家天然橡膠產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-34)

張源源(1989-)，男，河南南陽人，助理研究員，主要研究方向為橡膠樹多倍體育種和誘變育種，E-mail: yuanyuanhill@sina.com，*為通訊作者：李維國，E-mail: leewg23@163.com。

S722.3+5

A

(責任編輯李 潔)