林燕超 吳佩文(通訊作者) 林東(通訊作者)

350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1 350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病模型的影響因素

林燕超1吳佩文(通訊作者)1林東(通訊作者)2

350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2

目的：通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病的SD大鼠模型，觀察給藥劑量、給藥次數(shù)對大鼠成模率、死亡率的影響。方法：將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(N組)及造模組(A、B、C組)，予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)8周后，造模組分別給予鏈脲佐菌素(STZ)20 mg/kg單次腹腔內(nèi)注射(A組)、20 mg/kg連續(xù)2 d腹腔內(nèi)注射(B組)及30 mg/kg單次腹腔內(nèi)注射(C組)，然后測空腹血糖。結(jié)果：A組成模率較低(33.3%)，死亡率0%；B組成模率較高(66.7%)，死亡率13.3%；C組成模率高(100%)，死亡率高(60.0%)。結(jié)論：高糖、高脂飼養(yǎng)8周后聯(lián)合小劑量STZ 20 mg/kg連續(xù)2 d腹腔內(nèi)注射組SD大鼠成模率較高，死亡率較低。

鏈脲佐菌素；動物模型；2型糖尿病；SD大鼠；血糖

構(gòu)建2型糖尿病發(fā)病特點(diǎn)的動物模型，對于研究糖尿病的病因、發(fā)病機(jī)制、防治極其重要。目前國內(nèi)外研究學(xué)者大多數(shù)用高糖、高脂膳食聯(lián)合鏈佐脲菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠形成糖尿病模型的造模方法[1]。但相關(guān)文獻(xiàn)對于以下問題報(bào)道各不相同：糖尿病大鼠判斷標(biāo)準(zhǔn)、STZ注射方法、STZ注射次數(shù)、STZ注射劑量及高糖、高脂膳食飼養(yǎng)時間。本研究通過不同劑量、不同注射次數(shù)向SD大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素，從而誘導(dǎo)SD大鼠形成糖尿病，觀察對SD大鼠的空腹血糖值的影響，研究建立2型糖尿病模型的最佳方法。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件：清潔級SD雄性大鼠60只，體重180～220 g，購于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng)，飼以高糖、高脂飼料，自由飲水。

儀器與試劑：pH計(jì)，上海梅特勒公司，DELLTA320。微量血糖測定儀和血糖試紙，強(qiáng)生公司美國生產(chǎn)。電子體重秤，大連星海電子衡器有限公司。枸櫞酸緩沖液由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，0.1 mol/L，pH 4.3。鏈脲佐菌素(STZ)，100 mg瓶裝，Sigma公司S-0130(分裝)。新鮮配制成1%STZ溶液，裝入無菌玻璃瓶中避光，備用(現(xiàn)配現(xiàn)用，配完20 min內(nèi)使用完畢)。

分組及造模方法：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后禁食12 h，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組：正常對照組(N組)、模型組A組(20 mg/kg STZ單次腹腔內(nèi)注射)、模型組B組(20 mg/kg STZ連續(xù)2 d腹腔內(nèi)注射)、模型組C組(30 mg/kg STZ單次腹腔內(nèi)注射)，每組15只。第2周起予高脂、高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周，然后依不同試驗(yàn)組，腹腔注射STZ或枸櫞酸緩沖液。腹腔注射前1 d禁食但不禁水12 h。正常對照組大鼠腹腔注射1 mL枸櫞酸緩沖液。

觀察指標(biāo)及檢測方法：①觀察造模組大鼠進(jìn)食量、飲水量、排尿量、一般狀態(tài)及死亡情況。②于腹腔注射3 d、1周、2周、3周、4周行空腹血糖測定：大鼠禁食8 h后尾靜脈采血，用微量血糖測定儀測空腹血糖，計(jì)算出SD大鼠成模率及死亡率。

糖尿病判斷標(biāo)準(zhǔn)：注藥后3 d測空腹血糖，≥16.7 mmol/L者選為糖尿病大鼠模型。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

成模狀況：注射后3 d空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。A組SD大鼠成模5只，在注射后無死亡。B組SD大鼠成模10只，在注射后死亡2只。C組SD大鼠成模15只，在注射后死亡9只。成模后的SD大鼠出現(xiàn)糖尿病典型的臨床表現(xiàn)，即多飲、多食、多尿、體重下降，見表1。

空腹血糖檢測結(jié)果：大鼠空腹血糖測試結(jié)果表明，注射后3 d A組、B組和C組大鼠血糖均明顯高于注射前(P＜0.05)，而正常對照組注射前后血糖無明顯變化(P＞0.05)。A組、B組和C組大鼠血糖均明顯高于N組。注射后1周、2周、3周、4周檢測血糖結(jié)果，A組、B組和C組SD大鼠血糖均保持在高水平狀態(tài)，見表2。

一般情況：模型組大鼠在造模成功后逐漸出現(xiàn)典型的糖尿病癥狀：多飲、多食、多尿、消瘦、毛失去光澤、脫毛、活動減少和傷口易感染等。觀察4周，模型組A、B、C組大鼠體重減輕15%，飲水量增加近200%。

討 論

STZ作為一種廣譜抗生素被研發(fā)出來，在運(yùn)用過程中，具有抗腫瘤作用，但具有明顯的胰島毒性，通過特異性的損傷胰島β細(xì)胞，從而使胰島素合成減少，引發(fā)糖尿病。其為無色固體，易溶于水，但其水溶液穩(wěn)定性差，且具有光敏性，故現(xiàn)配現(xiàn)用且避光使用[2]。2型糖尿病動物模型的胰島素抵抗和糖耐量受損可以通過高糖、高脂飲食實(shí)現(xiàn)，而胰島細(xì)胞破壞引起的胰島素分泌相對不足一般采用STZ誘導(dǎo)[3]，故對2型糖尿病動物模型予高糖、高脂飲食后并予腹腔或靜脈注射STZ來造模，從而表現(xiàn)出糖尿病典型臨床癥狀，即多飲、多食、多尿、體重減輕、高血糖[4]。

表1 4組SD大鼠造模情況

糖尿病模型使用STZ注射的劑量差異明顯，從15～65 mg/kg均有報(bào)道[5]。造成劑量差異巨大的原因可能如下：①高糖、高脂飼養(yǎng)SD大鼠的時間：高糖、高脂飼養(yǎng)的時間越長，動物體重越重，胰島素抵抗越明顯，胰島負(fù)擔(dān)越重，其所需的STZ每kg體重劑量減少，但總STZ劑量增多[6]。SD大鼠予高糖、高脂飼養(yǎng)時間越長，動物越肥胖，造成糖尿病模型后期并發(fā)癥越多，因此，我們建議高脂、高糖飼養(yǎng)時間8周為宜。②SD大鼠空腹時間：空腹時間越長，機(jī)體對STZ越敏感，所需STZ的劑量越少[7]，但空腹時間過長，易引發(fā)低血糖，從而導(dǎo)致動物死亡率升高，因此，我們建議空腹時間12 h為宜。③STZ給藥的次數(shù)：STZ對胰島細(xì)胞有明顯毒性，1次大劑量STZ注射，引起胰島細(xì)胞大量死亡，從而誘發(fā)動物明顯高血糖酮癥死亡[8]；多次小劑量STZ注射，使胰島細(xì)胞部分受損，仍然能分泌胰島素[9]，但多次注射明顯增加工作量，增加實(shí)驗(yàn)誤差，且糖尿病動物抵抗力差，注射部位易誘發(fā)感染灶，從而增加死亡率。因此，依我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議予20 mg/kg，連續(xù)2 d腹腔注射為宜。④目前STZ給藥途徑主要有尾靜脈和腹腔注射兩種。據(jù)相關(guān)報(bào)道，尾靜脈注射所需劑量比腹腔注射要低，但是尾靜脈注射操作技術(shù)要求較高[10]，因此，我們使用腹腔注射。⑤其他原因：如STZ的避光、低溫、密封保存，糖尿病造模成功標(biāo)準(zhǔn)、STZ注射操作、STZ水溶液配置時間等。

為了提高造模成功率，降低大鼠死亡率，我們提出注意以下幾個方面：①STZ要求在棕色瓶子避光保存，密閉防潮并置于-20℃的冰箱里，因其水溶液不穩(wěn)定，故應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，配置到注射過程中始終避光低溫放置。②為保持SD大鼠良好的營養(yǎng)狀態(tài)及較強(qiáng)的抵抗力，造模前大鼠體重應(yīng)＞200 g。③注射STZ前大鼠應(yīng)空腹12 h，有文獻(xiàn)表明大鼠空腹時成模率明顯高于非空腹時[11]，空腹時間越長者，STZ用量越少，但空腹時間過長，動物死亡率提高[9]，因此建議空腹12 h。④造模成功后大鼠多尿癥狀明顯，故應(yīng)勤換墊料，保持鼠籠清潔、干爽，防止感染。⑤造模后的糖尿病大鼠，因其抵抗力較差，測尾靜脈時，其采血部位應(yīng)消毒，并且保持鼠籠清潔、干爽[12]。⑥實(shí)驗(yàn)室保持適宜、恒定的溫度和濕度，應(yīng)注意通風(fēng)，防止誘發(fā)肺炎等疾病，甚至造成死亡。

高糖、高脂飼養(yǎng)SD大鼠8周后予腹腔注射STZ造成2型糖尿病大鼠模型的方法，目前應(yīng)用比較多，本研究予1次小劑量STZ 20 mg/kg，其成模率低，未見大鼠死亡；相較于STZ 30 mg/kg，其成模率100%，但大鼠死亡率60%。當(dāng)予連續(xù)2 d腹腔注射小劑量STZ 20 mg/kg，造模成功率66.7%，死亡率低13.3%。依實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議予高糖、高脂飼養(yǎng)8周后聯(lián)合小劑量STZ 20 mg/kg連續(xù)2 d腹腔內(nèi)注射，SD大鼠成模率較高，死亡率較低。本實(shí)驗(yàn)為糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究提供了一種適用的動物模型。

表2 4組SD大鼠空腹血糖檢測結(jié)果(±s，mmol/L)

表2 4組SD大鼠空腹血糖檢測結(jié)果(±s，mmol/L)

組別 注射前 注射后3 d 注射后1周 注射后2周 注射后3周 注射后4周A組 3.87±0.31 21.45±4.85 21.51±4.78 21.31±4.90 21.55±4.23 21.35±4.91 B組 3.78±0.45 22.50±6.25 22.55±6.38 22.45±6.60 22.53±6.23 22.57±6.51 C組 3.82±0.36 21.15±5.75 21.22±5.87 21.23±5.92 21.28±5.83 21.19±5.86 N組 3.92±0.42 3.98±0.35 3.76±0.45 3.95±0.39 3.90±0.40 3.87±0.43

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Influencing factors of streptozotocin induced diabetes mellitus in SD rats

Lin Yanchao1,Wu Peiwen(Corresponding author)1,Lin Dong(Corresponding author)2
The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University 3500001Stomatological Hospital Affiliated to Fujian Medical University 3500002

Fund projectYoung science foundation of National Natural Science Foundation of China:81400805;Fujian Natural Science Foundation:2016J449;Category B technology project of Fujian Provincial Education Department:JB12108

Objective:The SD rats model of type 2 diabetes mellitus were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ),and we observed the effects of dose and number of administration on the rate of mold formation and mortality in rats.Methods:60 male SD rats were randomly divided into the normal control group(N)and the model group of A-C group.After feeding high glucose and high fat diet for 8 weeks,the model group was given streptozotocin(STZ)20 mg/kg single intraperitoneal injection(the A group),20 mg/kg continuous two days intraperitoneal injection(the B group)and 30 mg/kg single intraperitoneal injection(the C group),then fasting glucose was measured.Results:In A group,the molding rate was low(33.3%),and the mortality rate was 0%.In B group,the molding rate was higher(66.7%),and the mortality rate was 13.3%.In C group,the molding rate was high(100%),and the mortality rate was high(60%).Conclusion:After feeding high glucose and high fat diet for 8 weeks,combined with small dose of STZ 20 mg/kg continuous two days intraperitoneal injection,the molding rate of SD rats was higher,and the mortality rate was lower.

Streptozotocin;Animal model;Type 2 diabetes mellitus;SD rats;Blood sugar

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.35.2

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目，81400805；福建省自然科學(xué)基金：2016J449；福建省教育廳B類科技項(xiàng)目：JB12108