楊娥 李歡 劉艷 徐紀(jì)茹

[摘要]目的：本研究擬通過多序列分型（MLST）方法研究是否存在某些和痤瘡發(fā)病密切相關(guān)的基因型。方法：分離培養(yǎng)痤瘡患者和健康志愿者皮膚中的痤瘡丙酸桿菌株，進(jìn)行管家基因擴(kuò)增、測序、比對，比較不同來源的菌株的基因型、親緣關(guān)系及分子流行病學(xué)特征。結(jié)果：痤瘡患者和健康志愿者皮膚標(biāo)本痤瘡丙酸桿菌檢出陽性率分別為80.49%和80.77%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。來自健康志愿者的21個(gè)菌株可以被分為8個(gè)序列類型（ST），分別是ST3、ST8、ST9、ST10、ST18、ST26、ST27和ST46；而來自于患者的33個(gè)菌株僅被分為3個(gè)ST，它們是ST3、ST26和ST28。結(jié)論：痤瘡的發(fā)生和皮膚中痤瘡丙酸桿菌的陽性檢出率并無明顯關(guān)系，但來自于痤瘡患者菌株的ST生物多樣性明顯降低，ST28等基因型與痤瘡的發(fā)病密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]痤瘡丙酸桿菌；多位點(diǎn)序列分型法；分子流行病學(xué)；痤瘡

[中圖分類號]R758.73+3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0125-04

Abstract： Objective To assess if certain Propionibacterium acnes STs have closed relationship to the developing of acne. Methods Propionibacterium acnes strains isolated from patients with acne and healthy controls were testified by multilocus sequence typing（MLST）， and phylogenetic analysis was carried out with MEGA7 software. Results The positive rates of Propionibacterium acnes in the skin samples of patients with acne and healthy volunteers was 80.49% and 80.77%， respectively， and the difference was not statistically significant（P>0.05）. The 21 strains isolated from volunteers were categorized into 8 different sequence types（STs）， include ST3， ST8， ST9， ST10， ST18， ST26， ST27， ST46 and the 33 strains isolated from patients were only categorized into 3 STs， include ST3， ST26 and ST28. Conclusion There was no significant relationship between the occurrence of acne and the detection rate of Propionibacterium acnes. The STs diversity of Propionibacterium acnes from acne patients were significantly reduced， and strains such as ST28 seems to be closely related to the occurrence of acne.

Key words： Propionibacterium acnes； multilocus sequence typing； molecular epidemiology； acne

尋常痤瘡是一種常見的毛囊皮膚慢性炎癥性疾病，受累人群主要是青少年及20～30歲成年人，發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)多樣，從生理性粉刺到炎癥性丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫，嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間也因人而異。痤瘡的病因較復(fù)雜，目前尚未完全明了，很多因素都參與了痤瘡的發(fā)病，其中內(nèi)分泌因素、微生物因素、皮脂腺導(dǎo)管的異常角化、免疫因素、精神因素、遺傳因素等在痤瘡的發(fā)病中起了重要的作用[1]。但是在痤瘡發(fā)病的各個(gè)階段，總是伴隨著或輕或重的炎癥反應(yīng)，當(dāng)痤瘡發(fā)生時(shí)，局部毛囊皮脂單位中，痤瘡丙酸桿菌、白色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的生長明顯增多，抑制它們的生長，痤瘡的癥狀可以得到部分緩解，這說明微生物因素在其中的重要性。其中與痤瘡關(guān)系最為密切的是痤瘡丙酸桿菌，研究表明，該菌可以促進(jìn)皮膚角栓形成、皮脂過度分泌、刺激炎癥應(yīng)答激活等，在痤瘡發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的作用[2]。

多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequencing typing， MLST） 是一個(gè)具有很高分辨能力的微生物分子流行病學(xué)分析方法[3]，它是由多位點(diǎn)酶電泳MLEE衍生出來的一種分型方法，通過對微生物多個(gè)管家基因（一般為6～11個(gè)位點(diǎn)）的片段進(jìn)行序列測定，來揭示每個(gè)位點(diǎn)等位基因的多樣性，并根據(jù)各位點(diǎn)不同等位基因的排列組合譜所形成的序列類型（Sequence type，ST），來提供細(xì)菌基因組信息，在追查病原菌的傳染源、傳播途徑等方面均有重要意義。本研究通過分離培養(yǎng)患者及健康人群皮膚標(biāo)本中痤瘡丙酸桿菌，進(jìn)行核酸多序列分型，研究該菌的基因分型與痤瘡臨床疾病的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集：41例尋常痤瘡患者用自來水清洗局部皮膚后，選取未破損痤瘡皮損用70%的酒精進(jìn)行消毒，用滅菌粉刺針擠出痤瘡內(nèi)容物至無菌采樣拭子，而后采用分區(qū)劃線法接種于布魯氏菌血瓊脂（Brucella blood agar，BBA）平板。26例健康志愿者采用無菌PBS浸濕棉拭子，于面部前額正中選擇4cm×4cm區(qū)域由內(nèi)向外稍用力涂抹采集樣本，分區(qū)劃線法接種于BBA平板。

1.2 痤瘡丙酸桿菌的分離、培養(yǎng)及鑒定：將BBA平板置于厭氧罐中37℃恒溫培養(yǎng)72～96h，觀察瓊脂表面是否有肉眼可見的淡黃色、半透明、圓形、凸起的菌落生長。選取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，將鏡下呈現(xiàn)革蘭陽性、分節(jié)狀排列、呈雜亂粗大桿菌的單菌落進(jìn)行雙份轉(zhuǎn)種，一份繼續(xù)厭氧培養(yǎng)，另一份使用VITEK2全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定。

1.3 細(xì)菌全基因組DNA提取：分離、培養(yǎng)鑒定到的54株痤瘡丙酸桿菌臨床株，使用北京TIANGEN公司細(xì)菌基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增管家基因：用于PCR擴(kuò)增的引物序列參照Http：//pacnes.mlst.net/，實(shí)驗(yàn)中分析的9個(gè)管家基因及其編碼產(chǎn)物如下：cel（Transcription regulator ），轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；coa（O-succinylbenzoate-CoA synthase），O-琥珀酰苯甲酸-CoA合成酶；fba（Fructose bisphosphate aldolase），果糖二磷酸醛縮酶；gms（Glutamyl-tRNA synthetase），谷氨酰-tRNA合成酶；lac（L-lactate dehydrogenase）， L-乳酸脫氫酶；oxc（Cytochrome C Oxidase Subunit Ⅱ），細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ；pak（Pantothenate kinase），泛酸激酶；recA （Recombinase A），重組酶A；zno（Zn-dependant alcohol dehydrogenase），鋅依賴性醇脫氫酶。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1，由北京博奧生物公司合成。

除recA基因以外的其他8個(gè)基因PCR反應(yīng)條件如下：96℃預(yù)變性40s；94℃ 35s，55℃ 40s，72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。recA基因的PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3min；95℃ 1min，55℃ 30s， 72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化后送上海生工生物工程技術(shù)公司雙向測序。測序和PCR反應(yīng)采用同樣的引物，所得序列采用Laser-gene 7.0軟件包的SeqMan軟件進(jìn)行拼接和分析。

1.5 MLST序列分析：每個(gè)管家基因的測序結(jié)果通過與Http：//pacnes.mlst.net/網(wǎng)站上痤瘡丙酸桿菌的等位基因序列進(jìn)行比對，確定所測基因的等位基因類型，得到9個(gè)等位基因的組合之后，與網(wǎng)站上等位基因排列組合譜進(jìn)行比較，即得到實(shí)驗(yàn)菌株的ST信息。

1.6 親緣關(guān)系分析：基于MLST 9個(gè)等位基因測序信息，利用MEGA7軟件采用鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）對所分離菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 痤瘡丙酸桿菌陽性檢出率：本次實(shí)驗(yàn)共收集了54株痤瘡丙酸桿菌，其中33株來自于41例臨床痤瘡患者，21株來自于26例健康志愿者，患者和健康志愿者標(biāo)本中痤瘡丙酸桿菌的陽性檢出率分別為80.49%和80.77%，該菌在痤瘡患者和健康志愿者中的檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 PCR擴(kuò)增管家基因：以54株痤瘡丙酸桿臨床分離株的基因組DNA為模板，進(jìn)行9個(gè)管家基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1顯示，PCR產(chǎn)物均條帶清晰，目的片段同預(yù)期大小一致（DNA Marker為Takara公司的DL2000）。

2.3 MLST分型檢測結(jié)果：54株菌的9個(gè)管家基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測定，序列拼接后與Http：//pacnes.mlst.net/數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，如表2所示，這些菌株可以被分為 9個(gè)ST，其中來自于健康志愿者的21個(gè)菌株可以被分為8個(gè)ST，分別是ST3（4例）、ST8（2例）、ST9（3例）、ST10（3例）、ST18（2例）、ST26（2例）、ST27（3例）、ST46（2例）；而33株分離自患者標(biāo)本的痤瘡丙酸桿菌僅可被分為3個(gè)ST，分別是ST3（13例）、ST26（6例）和ST28（14例）。

2.4 菌株間親緣關(guān)系分析結(jié)果：根據(jù)MLST分型結(jié)果，利用MEGA7軟件采用鄰位相連法對本次試驗(yàn)中檢測到的9個(gè)痤瘡丙酸桿菌基因型的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

3 討論

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，因其主要發(fā)生于面部，易反復(fù)發(fā)作，可以導(dǎo)致瘢痕形成，色素沉著，嚴(yán)重影響美觀，給患者帶來一系列社會及心理問題從而越來越受到重視[4]。痤瘡丙酸桿菌是皮膚生物膜微生物群落的重要組成部分，也是一種機(jī)會致病菌。長期以來，人們對于該菌在痤瘡的發(fā)病過程中到底有何作用具有一定爭議。但是來自多中心的臨床研究均表明，作用于痤瘡丙酸桿菌的不同抗生素、抗菌劑和細(xì)菌素是治療痤瘡的有效方法，說明該菌在痤瘡發(fā)病中應(yīng)該占有一席之位。

本研究發(fā)現(xiàn)，患者痤瘡皮損處和健康志愿者皮膚標(biāo)本中痤瘡丙酸桿菌的檢出率均比較高，分別為80.49%和80.77%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無顯著性差異，痤瘡患者的毛囊中并沒有比正常人群具有更多的痤瘡丙酸桿菌，說明該菌的陽性率顯然不是決定痤瘡發(fā)病的首要因素。利用基于高通量測序的宏基因組研究也同樣發(fā)現(xiàn)[5]，痤瘡丙酸桿菌是皮膚微生物群中最主要和最豐富的細(xì)菌，其相對豐度在痤瘡和痤瘡患者中是相似的（87%～89%），并無明顯差異。所以可以推測來自于這兩類人群的痤瘡丙酸桿菌臨床分離株遺傳背景應(yīng)當(dāng)存在一定差異，某些痤瘡丙酸桿菌菌株可能是真正的皮膚共生菌，有助于皮膚健康，而某些菌株則有可能充當(dāng)機(jī)會致病菌誘發(fā)痤瘡。除了細(xì)菌因素外，痤瘡患者還普遍存在皮脂分泌過多的問題，這可以造成毛囊皮脂腺淤積即脂肪栓形成，局部微環(huán)境中氧分壓下降，從而有利于痤瘡丙酸桿菌的增殖。而痤瘡丙酸桿菌又可以攝取皮脂中的甘油三酯作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，產(chǎn)生很多胞外酶如包括脂酶、蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等，從而加重痤瘡毛囊局部的炎癥。并促進(jìn)毛囊漏斗部角化增強(qiáng)形成粉刺，進(jìn)一步導(dǎo)致皮脂排泄不暢，加重了毛囊皮脂腺過度增生，從而有利于痤瘡的發(fā)生和發(fā)展[6]。

基于管家基因測序分析的MLST分型方法簡單，快速，重復(fù)性好，分辨率高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于研究幾乎所有細(xì)菌（特別是難以培養(yǎng)的細(xì)菌），并可直接用于檢測細(xì)菌培養(yǎng)陰性的可疑臨床標(biāo)本。由于其數(shù)據(jù)源于高通量核苷酸序列測定技術(shù)，故易于對來自于不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行快捷的比較分析，被認(rèn)為是進(jìn)行大規(guī)模全球性流行病學(xué)研究“金標(biāo)準(zhǔn)”，更易于解釋菌株與流行病學(xué)之間的相關(guān)性，也易于在不同實(shí)驗(yàn)室間作分析比對[7]。

通過MLST基因分型方法發(fā)現(xiàn)，定植在痤瘡患者與健康人毛囊皮脂腺處的痤瘡丙酸桿菌菌株存在差異。來自健康人群標(biāo)本中的痤瘡丙酸桿菌的序列類型具有更豐富的生物多樣性，21株臨床分離株的基因型可以被分為8個(gè)ST，分別是ST3（4株）、ST8（2株）、ST9（3株）、ST10（3株）、ST18（2株）、ST26（2株）、ST27（3株）、ST46（2株）；而從患者標(biāo)本中分離培養(yǎng)到的痤瘡丙酸桿菌菌株的生物多樣性大大降低了，33株臨床分離株的基因型集中在3個(gè)ST，分別為ST3（13株）、ST26（6株）和ST28（14株），這說明痤瘡病變的發(fā)生僅與某些特定ST的菌株有關(guān)。雖然本研究中ST3和ST26也見于健康人群，但是在痤瘡患者中更為常見，而ST28在本次研究中只見于痤瘡患者，同樣說明健康志愿者和痤瘡患者皮膚分離到的痤瘡丙酸桿菌菌株的多樣性和主要ST類型均存在差異。對于分離到ST3和ST26的健康志愿者，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行后續(xù)的回訪，觀察他們是否有可能會發(fā)生痤瘡。

基于MLST的痤瘡丙酸桿菌的研究自從Lomholt HB等2010年建立了9個(gè)管家基因的方法學(xué)以來[8]，取得了很多進(jìn)展。研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)、不同種族痤瘡患者的痤瘡丙酸桿菌基因型存在差異。點(diǎn)突變導(dǎo)致痤瘡丙酸桿菌出現(xiàn)新等位基因比重組的多1.5倍，eST3和痤瘡的發(fā)生高度相關(guān)，尤其是rRNA變異的eST3更常見且與耐藥菌株密切相關(guān)，而CC72 （type Ⅱ） and CC77 （type Ⅲ）僅僅見于健康人群[9]；CC18是導(dǎo)致背部痤瘡的優(yōu)勢克隆復(fù)合體，特別是與高加索地區(qū)人群的痤瘡發(fā)病密切相關(guān)[10]；前列腺癌標(biāo)本中的優(yōu)勢克隆復(fù)合體是CC53/60和CC36[11]。ST1和ST3與痤瘡丙酸桿菌的耐藥性密切相關(guān)[12]且ST3基因型菌株可以在人單核細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎因子如IFN-γ和IL-17[13]，從而更容易適應(yīng)高活性脂溢性皮腺皮膚，加重痤瘡的發(fā)生。

在對本研究中的痤瘡丙酸桿菌親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，ST9、ST10、ST8、ST18這些菌株的親緣關(guān)系比較密切，它們僅見于健康志愿者。而ST3、ST26、ST28和ST27親緣關(guān)系更為密切，后四種ST中，ST3、ST26和ST28都是在痤瘡患者中更多見，這進(jìn)一步說明痤瘡的發(fā)生和發(fā)展可能與痤瘡丙酸桿菌菌株的ST差異有一定關(guān)系，這幾個(gè)基因型和痤瘡發(fā)生的關(guān)系如何尚需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行深入研究，或者進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得結(jié)果可為臨床痤瘡的防控提供理論依據(jù)。

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[收稿日期]2018-07-12 [修回日期]2018-09-14

編輯/朱婉蓉