譚霄，曾林，趙婷婷，劉波，張慶*，何紹志，向文良

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039) 2(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都，611731)

產(chǎn)γ-氨基丁酸釀酒酵母JM037釀造桑葚酒風(fēng)味物質(zhì)分析

譚霄1，曾林1，趙婷婷1，劉波1，張慶1*，何紹志2，向文良1

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039) 2(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都，611731)

探究以產(chǎn)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)釀酒酵母JM037發(fā)酵制備桑葚酒過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化。采用高效液相色譜和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，分析發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，并評(píng)估桑葚酒中GABA含量。結(jié)果表明：發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸共檢測(cè)出7種，其含量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共檢測(cè)出54種，其中酯類(lèi)19種、醇類(lèi)16種、醛類(lèi)8種、酮類(lèi)4種、酚類(lèi)3種及其他類(lèi)4種，相對(duì)含量從高到低依次為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)和酚類(lèi)，且揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)與相對(duì)含量隨發(fā)酵過(guò)程也不斷變化。主成分分析顯示，桑葚中的醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)為發(fā)酵桑葚酒中的其他風(fēng)味成分提供前體物質(zhì)。評(píng)估GABA含量發(fā)現(xiàn)，桑葚酒中GABA質(zhì)量濃度達(dá)到1 180 mg/L。

γ-氨基丁酸；釀酒酵母JM037；桑葚酒；風(fēng)味物質(zhì)；主成分分析

桑葚(Mulberry,MB)又稱(chēng)烏葚，為?？粕僦参铮涔麑?shí)呈深紫紅色，含有大量的天然紅色素，其色素主要成分為花色苷類(lèi)，具有抑制血小板凝固、預(yù)防心臟病、血栓、延緩衰老等生理作用[1-3]。我國(guó)衛(wèi)生部已把桑葚列為“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品之一[4]。因此，桑葚是一種極具開(kāi)發(fā)潛力和經(jīng)濟(jì)效益的藥食兩用型保健水果。目前，桑葚以鮮食為主，較少用于深加工，因其季節(jié)性強(qiáng)，保存時(shí)間短，不易貯藏，運(yùn)輸成本高昂，使鮮果的銷(xiāo)售受到很大限制，嚴(yán)重制約桑葚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。近年，在倡導(dǎo)水果產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展的指引下，發(fā)展桑葚果酒不僅能夠體現(xiàn)桑葚果品的風(fēng)味特色，而且能夠保持其果實(shí)中的部分營(yíng)養(yǎng)和保健功效[6]。因此，桑葚果酒的研究對(duì)桑葚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有積極意義。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱(chēng)GABA)是一種非蛋白質(zhì)類(lèi)氨基酸，具有降低血壓、利尿、增強(qiáng)記憶等多種生理功能[7-10]。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，富含GABA 的功能性發(fā)酵飲品已成為研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。而在發(fā)酵飲品的開(kāi)發(fā)中，風(fēng)味是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，風(fēng)味的好壞直接影響著飲品的品質(zhì)。但發(fā)酵飲品獨(dú)特的風(fēng)味與品質(zhì)受多種因素影響，其中與發(fā)酵微生物的關(guān)系尤為密切[11]。李艷等[12]研究了3種釀酒酵母對(duì)干紅葡萄酒釀造過(guò)程中香氣成分的影響及相關(guān)性，結(jié)果表明，這3種酵母菌發(fā)酵葡萄酒中主體香氣成分的相對(duì)含量存在顯著性差異；蔣錫龍等[13]分析了不同釀酒酵母對(duì)桃果酒香氣成分的影響；有研究表明[14]，酵母菌的糖苷酶活性以及其代謝產(chǎn)物對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要的影響?？得鼷惖萚6]分析了活性干酵母對(duì)柑橘酒釀造過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。而目前以產(chǎn)GABA的釀酒酵母發(fā)酵制備功能性桑葚酒過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)變化及相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以桑葚為原料，利用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的產(chǎn)GABA釀酒酵母JM037發(fā)酵制備功能性桑葚酒，通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)變化、相關(guān)性及GABA含量分析，為該釀酒酵母及其在發(fā)酵制備功能性桑葚酒的產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)中提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

產(chǎn)GABA釀酒酵母JM037，本實(shí)驗(yàn)室從四川泡菜中分離獲得的菌株，NCBI登錄號(hào)為：KU761835[15]；商業(yè)安琪耐高溫釀酒高活性干酵母購(gòu)買(mǎi)于安琪酵母股份有限公司。菌株采用含5 g/LL-谷氨酸鈉(L-monosodium glutamate,L-MSG)的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面保存。

桑葚(大十)，購(gòu)于四川大邑桑葚基地(糖含量7 g/100mL)；GABA色譜純(含量≥99%)，上海金穗生物科技有限公司；鄰苯二甲醛(ortho-Phthalaldehyde,OPA)，成都華夏化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純或分析純，上海生工生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀(配有Waters2998紫外檢測(cè)器)，美國(guó)沃特世公司；GC-MS QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；固相微萃取針頭75 μm CAR/PDMS、SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄，美國(guó)Supelco公司；7820A氣相色譜儀(配有氫火焰離子化檢測(cè)器)，安捷倫科技有限公司；pHS-3C酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀制過(guò)程

參考潘訓(xùn)海等[16]桑葚酒的釀造工藝，挑選并完全粉碎桑葚后，蔗糖調(diào)節(jié)糖度至19%，添加偏重亞硫酸鉀，使有效SO2含量達(dá)到60 mg/L，并加入L-MSG至5 g/L。以安琪耐高溫釀酒高活性干酵母(AQ)為對(duì)照，按6 lg CFU/mL接種量的釀酒酵母JM037接種，溫度控制在(22±2) ℃，至殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降到4 g/L后，加至30 mg/L亞硫酸封罐，終止發(fā)酵，并將溫度降至0～5 ℃，靜置澄清。

1.3.2 理化指標(biāo)分析

酵母菌計(jì)數(shù)：采用稀釋涂布YPD平板測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母數(shù)量變化；pH值測(cè)定：采用pHS-3C酸度計(jì)測(cè)定桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中pH變化；可滴定酸測(cè)定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》滴定；糖含量測(cè)定：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》方法測(cè)定；乙醇含量測(cè)定：采用氣相色譜法，參照謝文等[17]利用甲醇稀釋法進(jìn)行乙醇產(chǎn)量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)未接種AQ和JM037酵母的桑葚汁檢測(cè)為實(shí)驗(yàn)的空白組。

1.3.3 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸含量測(cè)定

運(yùn)用HPLC方法分析，參照商敬敏等[18]有機(jī)酸檢測(cè)方法測(cè)定桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量，色譜條件：色譜柱為樹(shù)脂色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad)，流動(dòng)相為0.057 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫60℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 GC-MS分析

參照PAULO等[19]基于HS-SPME/GC-MS對(duì)不同桑葚品種揮發(fā)性物質(zhì)的分析，采用頂空固相微萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜方法分析桑葚酒風(fēng)味物質(zhì)形成過(guò)程及不同發(fā)酵階段的差異性。

1.3.5 桑葚酒中GABA含量測(cè)定

參照AMIR等[20]利用鄰苯二甲醛衍生化的方法測(cè)定桑葚酒發(fā)酵結(jié)束后GABA的產(chǎn)量，HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm,5 μm)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為醋酸鈉(pH 6.2)∶甲醇∶四氫呋喃(84∶25∶1,V/V)；流速1 mL/min；梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相B比例為：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，維持0%；11～15 min，返回80%。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、多重比較法(LSD)和主成分分析(principal component analysis,PCA)。折線圖和熱點(diǎn)圖分別采用Origin 8.0和Heml 1.0.3.3-Heatmap Illustrator進(jìn)行繪制。每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)水平，所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程理化指標(biāo)分析

釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母發(fā)酵制備桑葚酒過(guò)程中的理化指標(biāo)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桑葚酒不同發(fā)酵時(shí)期酵母總數(shù)和理化成分分析Table 1 The yeast number and physicochemical properties of mulberry wine during different fermentation periods

注：“MB”是將桑葚汁調(diào)整酸和糖并采用超高溫瞬時(shí)殺菌技術(shù)處理后的樣品；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)；“-”表示未檢出。

由表1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值在發(fā)酵初期時(shí)下降，隨后略有上升，而可滴定酸含量的變化并不顯著(p>0.05)。這可能與發(fā)酵初期酵母形成乙酸、草酸等酸性物質(zhì)(見(jiàn)圖1(A))，導(dǎo)致pH值的降低，但其后酵母轉(zhuǎn)入酒精發(fā)酵階段，其分泌的蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成氨基酸，氨基酸脫氨作用生成NH3，造成pH值上升[21]。此外，由桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)桥c乙醇含量變化可看出，隨著釀酒酵母JM037發(fā)酵的進(jìn)行，殘?zhí)秋@著降低(p<0.05)，乙醇含量明顯增高，顯示該酵母菌株具備良好的乙醇轉(zhuǎn)化能力。

2.2 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸變化

采用HPLC對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期桑葚酒中有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1(A)。在桑葚汁中檢測(cè)出蘋(píng)果酸(malic acid,MLA)、檸檬酸(citric acid,CTA)、酒石酸(tartaric acid,TTA)、琥珀酸(succinic acid,SCA)、乳酸(lactic acid,LTA)和草酸(oxalic acid,OLA)6種有機(jī)酸，總有機(jī)酸質(zhì)量濃度為7.00 g/L，其中蘋(píng)果酸和檸檬酸含量較高，分別為2.73 mg/L和2.24 mg/L。與KOYUNCU[22]測(cè)定桑葚果汁中有機(jī)酸含量的結(jié)果略有不同，可能是桑葚品種差異造成的。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)期桑葚酒中有機(jī)酸含量變化和主成分分析Fig.1 The content and principal component analysis of organic acids in mulberry wine at different fermentation time

由圖1(A)可知，接種釀酒酵母JM037發(fā)酵第1天后，6種有機(jī)酸含量均在增加，并有少量乙酸生成，在發(fā)酵初期，酵母菌利用底物發(fā)酵生成各種有機(jī)酸。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵受到酒精發(fā)酵的抑制[23]，導(dǎo)致乳酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸迅速減少。而接種商業(yè)活性干酵母的發(fā)酵液中有機(jī)酸變化趨勢(shì)和幅度大致相同，除乳酸含量維持穩(wěn)定，其余各種有機(jī)酸基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并產(chǎn)生大量丙酸(propionic acid,PPA)和乙酸(acetic acid,ATA)。

主成分分析(PCA)是常用的數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法，它能在多個(gè)指標(biāo)表現(xiàn)的多元信息中進(jìn)行降維處理，并篩選出關(guān)鍵特征和有用信息[24]。由圖1(B)可知，分別接種釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母的前2個(gè)主成分分別占總方差73.82%和24.62%，二者合占98.44%，表明2個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征，能用來(lái)分析桑葚酒發(fā)酵過(guò)程釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母與發(fā)酵桑葚酒中有機(jī)酸的相關(guān)性。在PC1的正向端，蘋(píng)果酸和檸檬酸與桑葚汁和桑葚酒發(fā)酵過(guò)程均相關(guān)。在PC2的正向端，蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸和草酸與桑葚汁、商業(yè)活性干酵母發(fā)酵1 d和釀酒酵母JM037發(fā)酵1 d相關(guān)；在PC2的負(fù)向端，琥珀酸、乳酸、草酸、丙酸和乙酸與商業(yè)活性干酵母發(fā)酵5 d、9 d，釀酒酵母JM037發(fā)酵5 d、9 d相關(guān)。

2.3 HS-SPME/GC-MS檢測(cè)桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)

采用HS-SPME/GC-MS聯(lián)用方法對(duì)桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取并檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)出桑葚汁中揮發(fā)性物質(zhì)27種，釀酒酵母JM037發(fā)酵1 d、5 d、9 d分別為23、27、34種，而商業(yè)活性干酵母發(fā)酵1 d、5 d、9 d分別有20、24和26種揮發(fā)性成分。由表3可知，桑葚汁中醇類(lèi)、醛類(lèi)和酚類(lèi)的相對(duì)含量較高，分別占38.57%、26.80%和17.24%。在商業(yè)活性干酵母釀造的桑葚酒第1天，酯類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)顯著增加(p<0.05)，醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)顯著降低(p<0.05)，隨后各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)總相對(duì)含量變化不顯著(p>0.05)，但種類(lèi)發(fā)生改變，呈先減少后增加的趨勢(shì)。在釀酒酵母JM037釀造的桑葚酒過(guò)程中，各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢(shì)與安琪酵母釀造桑葚酒相一致，而酯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量相對(duì)較低，醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量相對(duì)較高，其余相對(duì)含量基本保持一致，但在揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)上明顯優(yōu)于商業(yè)活性干酵母。結(jié)果表明，釀酒酵母JM037作為發(fā)酵菌株能夠制備風(fēng)味豐富的桑葚酒。

表2 基于HS-SPME/GC-MS的桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分分析(匹配度≥80%) 單位：%Table 2 Volatile compounds profiles of mulberry wine at different fermentation period identified by HS-SPME/GC-MS

續(xù)表2

序號(hào)化合物名稱(chēng)英文名稱(chēng)MBAQJM0371d5d9d1d5d9d444?羥基?2?丁酮4?Hydroxy?2?butanone0 220 610 940 311 420 401 9445甲基庚烯酮Methylheptenone0 72------46大馬士酮Damascenone5 843 252 562 013 102 592 2647香葉基丙酮Geranylacetone---0 080 250 120 0648丁香酚Eugenol6 50 410 390 50 160 240 13492，4二叔丁基苯酚2，4?Ditertbutylphenol3 790 130 260 180 130 630 4750桉樹(shù)酚1，4?Cineole0 36------512?氨基?5甲基苯甲酸2?Amino?5-methylbenzoicacid0 86------52葑烯Fenchene----0 13--53甲基萘Methylnaphthalene--0 01-0 030 350 1254萘Naphthalene--0 12-1 312 991 87

注：“-”代表未檢出；MB是將桑葚汁調(diào)整酸和糖并采用超高溫瞬時(shí)殺菌技術(shù)處理后的樣品。

表3 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中各類(lèi)揮發(fā)物質(zhì)的相對(duì)含量 單位：%Table 3 The relative content of various volatile compounds classes of mulberry wine at different fermentation time

注：相對(duì)含量是以總揮發(fā)性物質(zhì)為100%，各種揮發(fā)性占總香氣物質(zhì)的比例；MB是將桑葚汁調(diào)整酸和糖并采用超高溫瞬時(shí)殺菌技術(shù)處理后的樣品；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)成分比較

2.4.1 酯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)分析

酯類(lèi)是桑葚酒中揮發(fā)性風(fēng)味種類(lèi)最多的物質(zhì)，也是呈現(xiàn)出特殊花香和果香味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[25]。由圖2可以看出，釀酒酵母JM037發(fā)酵過(guò)程中酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量先增加后減少，而酯種類(lèi)增加。在發(fā)酵過(guò)程中，乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯為桑葚酒主要酯類(lèi)物質(zhì)，且隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。此外，2種酵母菌發(fā)酵桑葚酒中共有的酯類(lèi)物質(zhì)是丙酸乙酯(菠蘿香味)、乙酸丁酯(水果香味)、丁酸乙酯(水果香味)、乙酸異戊酯(香蕉香味)、辛酸乙酯(白蘭地的香味)、苯乙酸乙酯(蜂蜜香味)、乙酸苯乙酯(甜蜜的香味)、苯丙酸乙酯(甜水果味)、反式-43癸烯酸乙酯(梨香味)、癸酸乙酯(椰子香味)和月桂酸乙酯(花生香味)，而乙二醇單甲酸酯、丙烯酸正戊酯、己酸甲酯(菠蘿香味)、甲酸異丁酯(甜水果味)、甲基丁酸異戊酯為釀酒酵母JM037釀造的桑葚酒所獨(dú)有，其中，己酸甲酯、甲酸異丁酯為桑葚中酯類(lèi)特征風(fēng)味物質(zhì)，釀酒酵母JM037不僅能最大限度的保留原有的特征風(fēng)味，還能豐富桑葚酒的風(fēng)味物質(zhì)。

圖2 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的熱點(diǎn)圖Fig.2 Hierarchical clustering analysis dendrogram associated with heatmap of volatile compounds profiles of mulberry wine at different fermentation time

2.4.2 醇類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)分析

由表3可以看出，釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母發(fā)酵的桑葚酒中，均為醇類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，主要來(lái)源于微生物代謝物和氨基酸代謝[25]。其中，異戊醇呈香蕉味，可以柔和桑葚酒中苦味氨基酸的苦和澀味[26]。β-苯乙醇是桑葚酒中的特征性香氣物質(zhì)，具有清甜的玫瑰香味，落口有綿甜清爽之感[27]。由圖2可知，釀酒酵母JM037發(fā)酵過(guò)程中，醇種類(lèi)逐漸減少，為形成酸類(lèi)、酯類(lèi)等香氣物質(zhì)提供前體物質(zhì)[28]。而異戊醇呈先增加后減少，β-苯乙醇呈線性增加，且發(fā)酵結(jié)束后，，異戊醇和β-苯乙醇是桑葚酒中的主要醇類(lèi)，其分別占醇類(lèi)相對(duì)含量的38.79%和44.91%。

2.4.3 醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)分析

相對(duì)酯類(lèi)和醇類(lèi)，醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯較少，但它們對(duì)酒體風(fēng)味的形成也具有重要作用。由表2可知，在桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中，共檢測(cè)出了癸醛(檸檬香味)、香草醛(柑橘香味)、壬醛(花香氣味)、苯甲醛、4-羥基-2-丁酮、大馬士酮(玫瑰芳香)、香葉基丙酮、丁香酚(丁香辛香氣)和2,4-二叔丁基苯酚等醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)，對(duì)酒體香氣的融合和協(xié)調(diào)也有重要作用。由圖2可以看出，桑葚果中含有豐富的醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，隨發(fā)酵進(jìn)行，其種類(lèi)及相對(duì)含量逐步減少，僅香草醛和癸醛為發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。

2.5 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析

對(duì)釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母發(fā)酵桑葚酒過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖3所示。前2個(gè)主成分分別占總方差74.64%和22.23%，二者合占98.44%，能用來(lái)分析桑葚酒發(fā)酵過(guò)程釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母與發(fā)酵桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性。在PC2的正向端，釀酒酵母JM037和商業(yè)活性干酵母發(fā)酵過(guò)程與丙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、甲基丁酸異戊酯、異戊醇、1,3-丁二醇、β-苯乙醇、苯甲醛和大馬士酮相關(guān)，其中異戊醇和β-苯乙醇的貢獻(xiàn)率最大，在PC2的負(fù)向端，其余揮發(fā)性物質(zhì)與桑葚果汁相關(guān)。此外，在PC1的正向端，主要以苯甲醛、大馬士酮、丁香酚等醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)貢獻(xiàn)率最大，在PC1的負(fù)向端，主要以丙酸乙酯、乙酸丁酯和乙酸苯乙酯等酯類(lèi)貢獻(xiàn)較大，其次為異戊醇、β-苯乙醇等醇類(lèi)。分析表明，釀酒酵母JM037與商業(yè)活性干酵母都能釀制風(fēng)味良好的桑葚酒，同時(shí)還能高度保持桑葚果固有的風(fēng)味。

圖3 桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的PCA分析Fig.3 Principal component analysis of volatile compounds profiles of mulberry wine at different fermentation time

2.6 桑葚酒中GABA含量分析

利用HPLC對(duì)發(fā)酵桑葚酒中GABA含量進(jìn)行測(cè)定，其定性定量結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4(A)可以看出，2種發(fā)酵桑葚酒中前體物L(fēng)-MSG明顯減少，有研究表明，釀酒酵母能將L-谷氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨基生成L-苯丙氨酸，進(jìn)一步通過(guò)艾麗希途徑生成β-苯乙醇[29]。而本研究篩選的產(chǎn)GABA釀酒酵母JM037具有較高谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)活性，能將L-MSG催化脫羧生成GABA。由圖4(B)可知，釀酒酵母JM037產(chǎn)GABA能力顯著高于商業(yè)活性干酵母(P<0.05)。在發(fā)酵結(jié)束后，桑葚酒中GABA質(zhì)量濃度達(dá)到1 180 mg/L。結(jié)果表明，釀酒酵母JM037能釀制出風(fēng)味良好且富含GABA的功能性桑葚酒。

A:HPLC色譜圖；B:GABA質(zhì)量濃度圖A：a-5g/L的L-MSG和GABA混合標(biāo)準(zhǔn)品；b-釀酒酵母JM037釀制的桑葚酒；c-商業(yè)活性干酵母釀制的桑葚酒圖4 發(fā)酵桑葚酒中GABA的 HPLC色譜圖及其質(zhì)量濃度Fig.4 The HPLC chromatogram and GABA concentration in the fermented mulberry wine

3 結(jié)論

本研究以產(chǎn)GABA釀酒酵母JM037發(fā)酵制備富含GABA桑葚酒，在發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出7種有機(jī)酸，分別為蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、草酸和乙酸，其中蘋(píng)果酸和檸檬酸含量最高，含量整體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；揮發(fā)性成分共鑒定出54種，分別為酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)及其他類(lèi)等，其中酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最多，但醇類(lèi)物質(zhì)在含量上所占比重最高，且揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)與相對(duì)含量隨發(fā)酵進(jìn)行也不斷變化。主成分分析顯示，蘋(píng)果酸和檸檬酸與整個(gè)發(fā)酵過(guò)程均相關(guān)，桑葚中的醛類(lèi)、酮類(lèi)和酚類(lèi)為發(fā)酵桑葚酒中的其他風(fēng)味成分提供物質(zhì)基礎(chǔ)。發(fā)酵桑葚酒中GABA含量達(dá)到1 180 mg/L。研究表明，釀酒酵母JM037能釀制出風(fēng)味豐富且富含GABA的桑葚酒。

[1] HUANG H P,CHANG Y C,WU C H,et al.Anthocyanin-rich mulberry extract inhibit the gastric cancer cell growthinvitroand xenograft mice by inducing signals of p38/p53 and c-jun[J].Food Chemistry,2011,129(4):1 703-1 709.

[2] 黃曉杰,田雪瑛,郭彥玲,等.桑葚果漿中花色苷及其色澤的熱降解動(dòng)力學(xué)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(5):51-55.

[3] 曹倩雯,鄭飛云,趙佳迪,等.桑葚果酒專(zhuān)用酵母的分離、篩選及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2017,43(3):94-98.

[4] 寧維穎,邵秀芝,盛玉鳳.桑葚的營(yíng)養(yǎng)及其原果汁的加工[J].糧油加工與食品機(jī)械,2004(9):66-67.

[5] 吳瓊,馮衛(wèi)敏,蔣和體.不同殺菌方式對(duì)桑葚原汁品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué),2016,37(9):144-149.

[6] 劉瑋,陳亮,吳志明,等.不同酵母發(fā)酵的桑葚果酒香氣成分的分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013(24):212-217.

[7] MARINA D,JOAN Q,MAGDALENA R,et al.Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods:a review[J].Journal of Functional Foods,2014,10:407-420.

[8] 張暉,姚惠源,姜元榮.富含γ-氨基丁酸保健食品的研究與開(kāi)發(fā)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(9):69-72.

[9] CALIXTO E.GABA withdrawal syndrome:GABAA receptor synapse,neurobiological implications and analogies with other abstinences[J].Neuroscience,2016,313:57-72.

[10] 趙國(guó)群,關(guān)軍鋒.高產(chǎn)γ氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在梨酒釀制中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2015,36(23)： 173-175.

[11] 張明霞,吳玉文,段長(zhǎng)青.葡萄與葡萄酒香氣物質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(7):2 098-2 104.

[12] 李艷,康俊杰,成曉玲,等.3種釀酒酵母釀造赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分分析[J].食品科學(xué),2010,31(22):378-382.

[13] 蔣錫龍,孫玉霞,董興全,等.不同釀酒酵母發(fā)酵桃果酒香氣成分研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(21):91-96.

[14] 蓋禹含,辛秀蘭,楊國(guó)偉,等.不同酵母發(fā)酵的藍(lán)莓酒香氣成分GC-MS分析[J].食品科學(xué),2010,31(4):171-174.

[15] 曾林,劉波,許小艷,等.四川泡菜中產(chǎn)γ-氨基丁酸微生物的系統(tǒng)發(fā)育與表達(dá)能力評(píng)估[J].食品科學(xué),2017,38(2):87-91.

[16] 潘訓(xùn)海,劉新露,羅惠波,等.桑葚果酒酵母的分離及篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(5):249-251.

[17] 謝文,丁慧瑛,章曉氡,等.葡萄酒、果酒中乙醇含量的測(cè)定方法[J].色譜,2004,22(5):561-561.

[18] 商敬敏,牟京霞,孟啟山,等.桑葚酒發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(4):241-243.

[19] PAULO R R M,MARIA A P C C,JAILSON B A,et al.Discrimination ofEugeniaunifloraL.biotypes based on volatile compounds in leaves using HS-SPME/GC-MS and chemometric analysis[J].Microchemical Journal,2017,130:79-87.

[20] AMIR H,TAJ M J,MUHAMMAD Y K,et al.HPLC determination of gamma amino butyric acid (GABA) and some biogenic amines (BAs) in controlled,germinated,and fermented brown rice by pre-column derivatization[J].Journal of Cereal Science,2015,64:56-62.

[21] 朱佳娜,王英,李思睿,等.自然發(fā)酵黑莓果酒中降酸酵母的篩選與鑒定[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(10):182-187.

[22] KOYUNCU F.Organic acid composition of native black mulberry fruit[J].Chemistry of Natural Compounds,2004,40(4):367-369.

[23] ANA L F,CINTIA L R,ROSANE F S.Microbiological and chemical parameters during cassava based-substrate fermentation using potential starter cultures of lactic acid bacteria and yeast[J].Food Research International,2015,76:787-795.

[24] 呂姍,凌敏,董浩爽,等.烘干溫度對(duì)大棗香氣成分及理化指標(biāo)的影響[J].食品科學(xué),2017,38(2):139-163.

[25] GUSTAV S,BERNARD P,FLORIAN F B.Wine flavor and aroma[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2011,38:1 145-1 159.

[26] YU H Y,DAI X,YAO G Y,et al.Application of gas chromatographybased electronic nose for classification of Chinese rice wine by wine age[J].Food Analytical Methods,2014,7(7):1 489-1 497.

[27] BERENGUER M,VEGARA S,BARRAJOn E,et al.Physicochemical characterization of pomegranate wines fermented with three differentSaccharomycescerevisiaeyeast strains[J].Food Chemistry,2016,190:848-855.

[28] 栗連會(huì).瀘型酒酒醅中乳酸菌和乳酸降解菌的多樣性和代謝特性[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2016.

[29] 杜閃,王雪花，楊政茂,等.生物轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇代謝途徑及其調(diào)控的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(1):168-173.

AnalysisonflavorsofmulberrywinebrewingbySaccharomycescerevisiaeJM037producingγ-aminobutyricacid

TAN Xiao1,ZENG Lin1,ZHAO Ting-ting1,LIU Bo1,ZHANG Qing1*,HE Shao-zhi2,XIANG Wen-liang1

1(Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,College of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China) 2(Sichuan Institute for Food and Drug Control,Chengdu 611731,China)

Flavors change of mulberry wine fermented bySaccharomycescerevisiaeJM037 with γ-aminobutyric acid(GABA) production capacity were analyzed during fermentation process.The changes of organic acid and volatile compounds were evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC) and head-space solid phase micro-extraction associated with gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME/GC-MS),respectively.Meanwhile,the production of GABA in mulberry wine was measured.The results showed that 7 kinds of organic acids were detected,and their contents were firstly increased and then decreased.Totally 54 volatile compounds were identified in mulberry wine,including 19 esters,16 acohol,8 aldehydes,3 ketones,3 phenols,4 others,and the relative content of volatile compounds from high to low was as follows:alcohols,esters,ketones,aldehydes and phenols.Moreover,the kinds and relative content of volatile compounds were changed during fermentation process.Finally,the principal component analysis (PCA) demonstrated that aldehydes,ketones and phenols of mulberry provided the precursor substance for other flavor compounds of the fermented mulberry wine.Furthermore,the concentration of GABA in mulberry wine reached 1 180 mg/L.

γ-aminobutyric acid;SaccharomycescerevisiaeJM037; mulberry wine; flavor compounds; principal component analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015173

碩士研究生(張慶副教授為通訊作者，E-mail：biozhan gq@163.com)。

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2016JY0253)；四川省科技成果轉(zhuǎn)化示范項(xiàng)目(2016CC0074)；四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(szjj2016-019)；西華大學(xué)大健康管理發(fā)展中心重點(diǎn)項(xiàng)目(szjj2017-037)

2017-07-12，改回日期：2017-08-28