嚴 佳，鐘桂香，檀巧婷，宋洪濤，周 欣

感寧顆粒的質量標準提高研究

嚴 佳，鐘桂香，檀巧婷，宋洪濤，周 欣*

目的提高感寧顆粒的質量標準。方法采用薄層色譜(TLC)法對感寧顆粒中連翹及黃芩進行定性鑒別并優(yōu)化梔子的鑒別方法，用高效液相色譜法(HPLC)法同時測定黃芩苷、梔子苷、綠原酸的含量，色譜柱為Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，進行梯度洗脫，柱溫：25 ℃，檢測波長為238 nm；流速：1.0 mL/min。結果TLC 法定性鑒別重復性好，陰性無干擾；黃芩苷、梔子苷、綠原酸分別在12～120 μg/mL (r=0.999 9)、9.6～96 μg/mL (r=0.999 7)、14.4～144 μg/mL (r=0.999 7)濃度范圍內線性關系良好，平均回收率分別為99.32%、98.90%、99.14%。結論提高后的質量標準方法簡便可行，專屬性強，重復性好，能有效地控制感寧顆粒的質量。

感寧顆粒；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芩甘；梔子苷；綠原酸

0 引言

感寧顆粒為中國人民解放軍第105醫(yī)院非標準制劑[南NFB-(Z151)-2011]，處方由金銀花、板藍根、黃芩、連翹、梔子、玄參、知母、麥冬、地黃、龍膽、紫花地丁、石膏等12味中藥組成。有疏風清熱、解毒消腫的功效，用于熱毒壅盛所致發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛等癥，主治外感風熱型由表入里之感冒、上呼吸道感染、肺炎等熱癥，其療效顯著，安全性好。該制劑現(xiàn)行標準中對金銀花、梔子進行鑒別；用紫外分光光度法對總黃酮進行了含量測定[1]。為進一步控制制劑質量，保證臨床用藥安全有效，筆者通過試驗摸索，建立了黃芩苷、梔子苷、綠原酸的HPLC含量測定方法，增加了連翹、黃芩的TLC鑒別，并優(yōu)化梔子的TLC鑒別條件，完善了該制劑的質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫)、FA1004型電子天平(上海天平儀器廠)、KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 綠原酸對照品(批號：110753-200413，中國食品藥品檢定研究院，含量96.2%)；連翹苷對照品(批號：110821-201213，中國食品藥品檢定研究院，含量98.9%)；梔子苷對照品(批號：110749-201316，中國食品藥品檢定研究院，含量97.5%)；黃芩苷對照品(批號：110715-201318，中國藥品生物制品檢定所，含量93.3%)；蘆丁對照品(批號：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院，含量92.5%)；金銀花對照藥材(批號：121060-201107，中國食品藥品檢定研究院)；連翹對照藥材(批號：120908-201216，中國食品藥品檢定研究院)；梔子對照藥材(批號：121054-201115，中國食品藥品檢定研究院)；黃芩對照藥材(批號：120955-201309，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇(色譜純，上海科豐實業(yè)有限公司)；感寧顆粒(10 g/袋)(批號：150613、150625、150704，中國人民解放軍第105醫(yī)院)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 梔子[2-3]取本品30 g，研細，加70 ℃熱水50 mL，加氯化鈉0.5 g，超聲處理20 min，使溶解，放冷，加入乙醚100 mL振搖提取，棄去上層乙醚液，收集下層水提取液，用水飽和的正丁醇振搖2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用0.25%的氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次30 mL，棄去下層堿水層，再用正丁醇飽和的水20 mL洗滌，棄去下層水溶液，取上層正丁醇提取液吹干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。另取梔子對照藥材2 g，加水30 mL，70～80 ℃水浴回流1 h，加入乙醚30 mL振搖提取，其余操作同上述供試品溶液制備法，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。取梔子苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作為梔子苷對照品溶液。取缺梔子的感寧顆粒陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各15 μL，點于同一硅膠G板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(12∶2.5∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液在相同位置無干擾，見圖1。

圖1 梔子的TLC鑒別

2.1.2 連翹 取連翹苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL 溶液，作為連翹苷對照品溶液。取連翹對照藥材2 g，按“2.1.1”項下梔子對照藥材溶液制備方法制成對照藥材溶液。取缺連翹的感寧顆粒陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取“2.1.1”項下供試品溶液及上述溶液各15 μL，照“2.1.1”項下方法試驗，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液在相同位置無干擾，見圖2。

圖2 連翹的TLC鑒別

2.1.3 黃芩 取本品10 g，研細，加甲醇溶液20 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用稀鹽酸溶液調節(jié)pH值至1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 g，加甲醇溶液20 mL，其余操作同黃芩供試品溶液制備方法，殘渣加甲醇1 mL，作為對照藥材溶液。取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺黃芩的感寧顆粒陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-醋酸-水(10∶7∶5∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1 %三氯化鐵乙醇溶液[4]。供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液在相同位置無干擾，見圖3。

圖3 黃芩的TLC鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[4-9]色譜柱Agilent Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，按表1進行梯度洗脫，檢測波長為238 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 溶液的制備 ①對照品溶液的制備：取黃芩苷對照品6 mg、梔子苷對照品4 mg、綠原酸對照品5 mg至100 mL容量瓶中，加50%甲醇，溶解完全后稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。②供試品溶液的制備：精密稱取本品1.0 g，置100 mL的容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置，濾過，取續(xù)濾液，即得。③陰性對照溶液的制備：按處方量，分別稱取除黃芩、梔子、金銀花外的其余藥材制成的陰性顆粒1.0 g，按“2.2.2”項供試品溶液的制備方法同法處理，即得。

2.2.3 方法學考察 專屬性試驗：分別精密吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。結果見圖4，在陰性對照溶液色譜圖上黃芩苷、梔子苷、綠原酸出峰相應位置未見色譜峰，表明本方法專屬性良好。

線性關系考察：精密稱取黃芩苷對照品 15.0 mg、梔子苷10.0 mg、綠原酸12.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，超聲使其完全溶解，得到混合對照品儲備溶液。分別精密吸取混合對照品儲備溶液1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0 mL至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經過濾，分別精密吸取各濃度對照品溶液續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以峰面積對對照品濃度進行線性回歸，得標準曲線。黃芩苷Y=29.194 X-4.756 (r=0.999 9)，梔子苷Y=3.382 X+0.378 (r=0.999 7)，綠原酸Y=3.887 X-0.035 (r=0.999 7)。結果表明，黃芩苷、梔子苷、綠原酸分別在12～120、9.6～96、14.4～144 μg/mL內具有良好的線性關系。

精密度試驗：精密吸取同一份混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算黃芩苷、梔子苷、綠原酸的RSD分別為0.28%、0.52%、0.67%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h時，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結果黃芩苷、梔子苷、綠原酸RSD分別為0.13%、0.89%、0.92%，表明供試品在10 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一批感寧顆粒(批號：140613)，分別制備6份供試品溶液，結果黃芩苷、梔子苷、綠原酸的RSD分別為0.46%、0.95%、1.02%，表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗(表2)：分別精密稱取已知含量的同一批感寧顆粒(黃芩苷2.10 mg/g，梔子苷0.44 mg/g，綠原酸0.74 mg/g，批號：150613)6份，每份約1.0 g，分別加入黃芩苷對照品溶液3.5 mL (0.605 7 mg/mL)、梔子苷1.1 mL (0.414 2 mg/mL)、綠原酸1.5 mL (0.508 8 mg/mL)，按“2.2.2”項下“供試品溶液的制備”同法操作，根據(jù)“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算平均回收率。

圖4 感寧顆粒的HPLC圖

成分取樣量(g)樣品量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)黃芩苷100202183221200428359907986217810009212472120041906974510019214782120042001968110002209952120042413101031003022004212004259897141001121211212004246210024梔子苷1002004534045560898597709780096100090449604556089659809100190455504556089629673100020460104556090129682100300478504556093049919100110452004556089989829綠原酸100200770607632151029691982719310009078140763215487100541001907712076321541210089100020761507632150089687100300769807632151219726100110790907632153259717

2.2.4 樣品含量測定 分別從3批感寧顆粒中精密稱取顆粒約1.0 g，每批3份，按“2.2.2”項下同法操作，制備供試品溶液，測定并計算黃芩苷含量。結果批號為150613、150625、150704的3批樣品中黃芩苷的含量分別為2.10、2.18、2.16 mg/g；梔子苷的含量分別為0.44、0.46、0.47 mg/g；綠原酸的含量分別為0.74、0.78、0.77 mg/g。

3 討論

3.1 測定波長的選擇 取混合對照品溶液，在200～400 nm范圍內進行掃描，結果黃芩苷在276 nm 處有最大吸收波長，梔子苷在238 nm處有最大吸收波長，綠原酸在326 nm處有最大吸收波長?？紤]到樣品中梔子苷的含量較低，為使梔子苷檢測靈敏度較高，且在238 nm波長處3個成分均有較好的紫外吸收，故選擇梔子苷的最大吸收波長238 nm為本試驗檢測波長。

3.2 薄層色譜鑒別 現(xiàn)行標準金銀花中綠原酸的薄層色譜鑒別方法，試驗結果明顯，可重現(xiàn)，且未用毒性較大的有機溶劑，故本試驗對原標準未做改動?，F(xiàn)行標準中沒有建立連翹的薄層色譜鑒別方法，筆者經多次試驗及參考藥典成方制劑中連翹的鑒別，選擇連翹中的指標性成分連翹苷進行鑒別。

現(xiàn)行標準中梔子的薄層色譜鑒別方法，需要使用大孔吸附樹脂柱進行純化，操作復雜。在進行連翹鑒別時，發(fā)現(xiàn)梔子鑒別可與其使用同樣的供試品處理方法和展開條件，且不需進行過柱純化，操作相對簡單，故本標準研究優(yōu)化了梔子的鑒別方法。

黃芩的TLC鑒別試驗中，曾參考文獻[10]，使用聚酰胺薄膜板，但陰性始終有干擾。本試驗參考八寶坤順丸[4]中黃芩鑒別項下供試品的處理方法，對參考文獻中展開劑的比例進行微調，采用硅膠G薄層板，供試品中黃芩苷斑點明顯，陰性無干擾，說明該方法可行。

3.3 含量測定方法 現(xiàn)行標準中含量測定項下對總黃酮用紫外分光光度法進行測定，無指標性成分的含量測定。本方中石膏為君藥，石膏中的主要成分為含水硫酸鈣(CaSO4·2H2O)，其含量測定采用滴定法，而本品為中藥制劑，其背景顏色會干擾滴定終點的判斷。因此，本試驗采用HPLC法同時測定黃芩甘、梔子苷、綠原酸3種成分的含量。

4 結論

本試驗所建立的連翹、梔子、黃芩的TLC鑒別，分離效果好，專屬性強，陰性無干擾；黃芩苷的HPLC法含量測定，靈敏準確，簡便快捷，重現(xiàn)性好。上述定性和定量方法的結合，有助于更科學、更全面地進行感寧顆粒的質量評價，確保臨床用藥的安全、有效。

[1] 趙剛,吳新安,方云,等.感寧顆粒質量控制[J].中國藥師,2007,10(1):77-78.

[2] 張秋玲,黃志豪,伍柏堅,等.消炎解毒丸質量標準研究[J].廣東藥學院學報,2014,30(5):599-603.

[3] 張永峰,姬雪禮,張澤,等.止咳化痰片質量標準研究[J].食品與藥品,2014,15(4):269-272.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:461,968,1552.

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[10] 李桂本,李振國,宋漢敏.潰瘍散膠囊質量標準提高研究[J].中國藥業(yè),2015,24(1):41-43.

StudyonqualitystandardimprovementofGanninggranules

YAN Jia,ZHONG Gui-xiang,TAN Qiao-ting,SONG Hong-tao,ZHOU Xin*

(Department of Pharmacy,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region,Fuzhou 350025,China)

ObjectiveTo improve the quality standard for Ganning particles.MethodsForsythia suspensa and Scutellaria baicalensis and Georgi were identified by TLC.HPLC was used to determine the contents of Baicalin,Geniposide and Chlorogenic acid.The method employed a column of Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm,5 μm) with the mobile phase of acetonitrile (A)-0.1% hydrochloric acid (B) at a temperature of 25 ℃.The detection wavelength was set at 238 nm;the flow rate was 1.0 mL/min.ResultsThe TLC statutory identification was repeatable and negative without interference.The calibration curve showed a good linear relationship within the range of 12～120 μg/mL for Baicalin (r=0.999 9),9.6～96 μg/mL for Geniposide (r=0.999 7) and 14.4～144 μg/mL for Chlorogenic acid (r=0.999 7),the average recovery was 99.32%,98.90% and 99.14%.ConclusionThe improved quality standard is simple,specific and reproducible,and can effectively control the quality of Ganning granules.

Ganning granules;Quality standard;TLC;HPLC;Baicalin;Geniposide;Chlorogenic acid

2017-05-25

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科，福州 350025

軍隊醫(yī)療機構制劑標準提高科研專項重點課題(14Z-JZ17)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712016