楊松柳，劉媛媛，金松根，趙鳴雁

褪黑素誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究

楊松柳，劉媛媛，金松根，趙鳴雁*

目的探討褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。方法將0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素在體外與NB4細(xì)胞共同培養(yǎng)，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性，Hoechst熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例，分光光度計(jì)檢測(cè)上清液中Caspase-3及Caspase-9含量。結(jié)果褪黑素能顯著抑制NB4細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加凋亡因子的表達(dá)。結(jié)論褪黑素促進(jìn)NB4細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與增加Caspase-3及Caspase-9表達(dá)有關(guān)。

褪黑素；NB4細(xì)胞；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

0 引言

傳統(tǒng)化療藥物通過(guò)抑制白血病腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡發(fā)揮治療作用，但由此帶來(lái)的對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用不容忽視[1-3]。因此，應(yīng)尋找一種低毒、安全、不良反應(yīng)小的藥物替代或輔助現(xiàn)有治療藥物，達(dá)到減少耐藥性、降低不良反應(yīng)的目的。褪黑素是一種由松果體分泌的具有強(qiáng)抗氧化能力的自由基清除劑，作為一種生物類激素，褪黑素由人體自身合成并分泌，其安全性得到保證。劉沁華等[4]研究顯示，褪黑素聯(lián)合全反式維甲酸可以抑制人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，誘導(dǎo)其分化，從而延緩病情發(fā)展；曾慶曙等[5]研究顯示，褪黑素能維持胰島細(xì)胞的正常生理功能和生化指標(biāo)，促進(jìn)NB4細(xì)胞的凋亡，但作用的具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)觀察褪黑素對(duì)人急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞的增殖抑制作用并探討相關(guān)機(jī)制，希望為白血病的治療提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 主要材料 褪黑素(美國(guó)Sigma公司，純度97%)，青霉素、鏈霉素(華北制藥公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，四甲基偶氮唑鹽(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT,Sigma公司)，AnnexinV FITC/PI凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)，Caspase-3、Caspase-9酶檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，酶標(biāo)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NB4細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT法，NB4細(xì)胞接種于96孔板中(3×104個(gè)，200 μL/孔)，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別加入0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，換掉培養(yǎng)液，PBS沖洗3次后加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的MTT溶液20 μL，溫育4 h，棄上清液加入100 μL DMSO溶液，室溫下?lián)u床低速震蕩20 min后全自動(dòng)酶標(biāo)光度儀測(cè)定各孔490 nm的光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 按“1.2.2”項(xiàng)分組方法將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，收集各處理組NB4細(xì)胞，PBS洗滌2次后，1 200 r/min離心棄上清液，用試劑盒中的緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入FITC-Annexin Ⅴ和PI染液各5 μL，溫箱孵育20 min后離心棄上清。于避光環(huán)境內(nèi)PBS洗滌2次后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡的Hoechst 33285熒光染色測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS洗滌2次，在150 μL的Binding Buffer中加入2 μL Hoechst染液，避光、室溫反應(yīng)5 min后置于熒光顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為400倍。

1.2.5 Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè) 采用分光光度法，按“1.2.2”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞并用0.1%胰酶消化，1 200 r/min離心10 min，收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次，加入30 μL細(xì)胞裂解液后冰上孵育20 min，10 000 r/min離心10 min，進(jìn)行Caspase活性檢測(cè)。檢測(cè)方法按試劑盒進(jìn)行。Caspase活性=OD405 nm/OD595 nm。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞增殖的抑制作用 陰性對(duì)照組NB4細(xì)胞活性為(101.00%±3.02%)，用不同濃度褪黑素處理后，細(xì)胞活性分別下降到76.33%±2.04%、59.67%±3.52%和46.67%±3.21%，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，NB4細(xì)胞經(jīng)過(guò)0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素處理后，細(xì)胞凋亡率分別為2.11%±0.54%、25.76%±2.97%、33.72%±2.86%和47.53%±3.05%，隨著褪黑素濃度的增加，NB4細(xì)胞凋亡比例逐漸增加。見(jiàn)圖2。

圖1 褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞活性的影響

2.3 Hoechst 33285核染色法檢測(cè)各組NB4細(xì)胞凋亡 在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的顆粒狀高熒光，未發(fā)生凋亡的細(xì)胞核呈均勻淡黑色低熒光。本實(shí)驗(yàn)顯示，陰性對(duì)照組(2.00%±1.11%)未見(jiàn)明顯凋亡染色的細(xì)胞核，不同濃度的褪黑素處理后，凋亡細(xì)胞比例逐漸增加(29.08%±3.34%、36.00%±2.07%、56.73%±4.52%)，與陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

2.4 褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9含量的影響 加入褪黑素作用后，NB4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組NB4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9含量(n=3)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖2 褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響

圖3 褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響

圖4 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

白血病的治療機(jī)制為通過(guò)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。白血病有很多分類，不同類型的白血病對(duì)化療敏感性不同，化療可以使部分白血病患者病情得到緩解，但是由于化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期與藥物接觸，逐漸產(chǎn)生耐藥性，影響化療效果及患者生存率[7]。因此，研發(fā)出一種自然低毒、不良反應(yīng)少的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為治療的新方向。

通過(guò)研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，不但可以為腫瘤的防治提供新的理論依據(jù)，還可以進(jìn)一步探索腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。褪黑素化學(xué)名稱為5-甲氧基-N-乙酰色胺，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其基本功能包括調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、情緒及睡眠[7-8]。褪黑素具有雙向作用機(jī)制：對(duì)于正常細(xì)胞，褪黑素能抑制其凋亡，對(duì)于腫瘤細(xì)胞，褪黑素能誘導(dǎo)其凋亡。臨床上褪黑素也被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病的治療[9-11]。近年來(lái)有人將其用于白血病的治療上，也取得一定效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT分析細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠劑量依賴性地抑制NB4細(xì)胞活性。Hoechst 33285核染色法是一種定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)方法，可以直觀發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)，并初步評(píng)估凋亡細(xì)胞數(shù)量。本研究結(jié)果顯示，NB4細(xì)胞經(jīng)過(guò)褪黑素干預(yù)后，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮呈致密濃染的亮藍(lán)色高熒光，表明褪黑素誘導(dǎo)了NB4細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了褪黑素能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。

腫瘤的形成是腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡比例失衡的結(jié)果。凋亡過(guò)程中有許多蛋白酶的參與，其中Caspase家族蛋白酶在其中發(fā)揮重要作用[12]。有研究顯示，褪黑素可以使人B淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)B淋巴母細(xì)胞瘤凋亡[13]。本研究結(jié)果與其相似，褪黑素處理后的NB4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)均升高，證實(shí)了褪黑素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，褪黑素可以誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，其抑制作用呈量-效相關(guān)性，為該藥物應(yīng)用于臨床白血病的治療提供了理論依據(jù)。

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MelatonininducedtheapoptosisofNB4cellsanditsmechanism

YANG Song-liu,LIU Yuan-yuan,JIN Song-gen,ZHAO Ming-yan*

(the Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of melatonin on the proliferation inhibition and apoptosis induction of NB4 cells.MethodsNB4 cells and 0,10-8,10-6and 10-4mol/L melatonin were cultured togetherinvitro.The cell viability was measured by MTT colorimetric assay;the apoptosis was detected by Hoechst fluorescent staining,and the rate of apoptosis cells were measured by flow cytometry;the contents of Caspase-3 and Caspase-9 in supernatant were checked by spectrophotometer.ResultsMelatonin significantly inhibited NB4 cell proliferation,promoted cell apoptosis,and increased the expression of apoptosis factors.ConclusionThe mechanism of melatonin promoting the apoptosis rate of NB4 cells may be related to increasing the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

Melatonin;NB4 cell;Apoptosis;Caspase-3;Caspase-9

2017-05-30

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，哈爾濱 150001

國(guó)家自然科學(xué)基金(81171785)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712006