張宇，馬永強(qiáng)，*，劉曉飛，，*，王鑫，孟慶虹，盧淑雯

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江哈爾濱150086）

發(fā)芽糙米中多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

張宇1，馬永強(qiáng)1，*，劉曉飛1，2，*，王鑫1，孟慶虹2，盧淑雯2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江哈爾濱150086）

以發(fā)芽糙米為原料，用超聲波輔助復(fù)合酶的方法提取發(fā)芽糙米中的多糖類物質(zhì)，以發(fā)芽糙米多糖得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)確定超聲波輔助復(fù)合酶法提取發(fā)芽糙米多糖的最佳工藝條件，通過測定DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除能力，檢測提取的多糖抗氧化活性。結(jié)果表明：復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶：果膠酶的添加質(zhì)量比例為4∶3∶2）的酶解pH值為6，酶解時間2.5 h，酶解溫度為50℃，酶添加量為1.5%，此條件下多糖得率為37.58%?？寡趸匝芯堪l(fā)現(xiàn)發(fā)芽糙米多糖對DPPH自由基和超氧陰離子，羥基自由基都具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

發(fā)芽糙米；多糖；超聲波；復(fù)合酶法；響應(yīng)曲面法；抗氧化性

糙米是稻谷脫去外保護(hù)皮層稻殼后的穎果，由米糠層、胚芽、胚乳組成，在米糠層和胚芽中含有很多營養(yǎng)成分。糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維、維生素和礦物質(zhì)等是其主要營養(yǎng)成分，糙米被視為一種綠色的健康食品。但由于糙米吸水困難、蒸煮時間較長導(dǎo)致米飯的口感差、糠味較重、咀嚼困難、不易消化，貯存期短，直接食用受到限制[4]。發(fā)芽糙米與糙米相比，其生理活性具有明顯的優(yōu)勢。糙米發(fā)芽后，組織軟化，炊煮方便，米中蛋白質(zhì)和淀粉被降解，使糙米的感官性能和風(fēng)味得以改善，而且在保留了豐富的維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維營養(yǎng)成分的同時，更是產(chǎn)生了多種具有促進(jìn)人體健康和防治疾病的成分，如γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇等，營養(yǎng)成分大大提高，發(fā)芽糙米也是一種比糙米更好的預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的食物。發(fā)芽糙米中有更多的人體所需營養(yǎng)成分和生理活性成分種類，具有明顯的生理活性優(yōu)勢[5]，因此需要更深入研究。

將超聲法和復(fù)合酶法這兩種方法結(jié)合起來，對糙米多糖提取工藝進(jìn)行研究，通過超聲使復(fù)合酶的活性得到提高，從而使破壁率得到提高；通過超聲還可以使傳質(zhì)過程得到強(qiáng)化，有利于多糖的溶解，使多糖得率得到大幅提升，旨在獲得一個得率高、品質(zhì)好的發(fā)芽糙米多糖提取條件[6-7]，分別就多糖的提取和抗氧化性進(jìn)行研究。利用正交試驗(yàn)確定提取發(fā)芽糙米多糖的方法的最佳條件，并測定多糖的抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試粳稻為“龍?！保汉邶埥链簝Z廠；纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎儀（JY92-2D型）：寧波新知生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS-12型）：上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（721E型）：上海光譜儀器有限公司；電子分析天平（BS224S型）：塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（M288479型）：北京東方德教育科技有限公司；臺式高速離心機(jī)（TGL-16G-B型）：閩南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 發(fā)芽糙米多糖的制備及測定

1.3.1 發(fā)芽糙米多糖的制備

用龔谷機(jī)去除稻子外殼得到糙米，于4℃條件避光儲藏。用浸泡-濕熱法對糙米進(jìn)行發(fā)芽前處理，浸泡3 h，當(dāng)糙米發(fā)芽結(jié)束后，放入到80℃的恒溫干燥箱中對發(fā)芽糙米進(jìn)行30min的滅酶處理，然后再放在50℃的恒溫干燥箱中對發(fā)芽糙米進(jìn)行干燥，粉碎過篩（80目）備用。按料液體積比1∶30加入蒸餾水，100 W超聲60min，再放入80℃水浴振蕩箱中振蕩4 h，離心過濾收集上清液，按體積比1∶3加入80%～85%的乙醇，放置24 h。離心，收集沉淀，冷凍干燥得發(fā)芽糙米粗多糖。

1.3.2 發(fā)芽糙米多糖的測定

采用苯酚-硫酸法[91]測定發(fā)芽糙米多糖的含量，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品準(zhǔn)確稀釋合適的倍數(shù)，吸取2mL樣品溶液，分別加入1mL的6%苯酚，5mL濃硫酸，490 nm下測量其吸光度值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算糖含量。

1.4 超聲波輔助復(fù)合酶法提取發(fā)芽糙米多糖的條件優(yōu)化

取發(fā)芽糙米5.0 g，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，料液體積比1∶15，超聲波超聲30min，超聲溫度50℃，冷卻至室溫后，復(fù)合酶法提取多糖，添加復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶的添加質(zhì)量比例為4 ∶3 ∶2）[8]，單因素選擇酶解 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃），酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），酶添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）[9-10]。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶解溫度、酶解時間、酶解pH值、酶的添加量為變量，多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)[11-12]，試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 水平試驗(yàn)因素表Table 1 The factor level table

1.6 發(fā)芽糙米多糖抗氧化性的測定

1.6.1 自由基清除能力的測定

將樣品溶液稀釋后用移液槍吸取100μL，加入2mL 0.2 mmol/L DPPH的乙醇溶液，緩慢搖晃使其混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)20min，在57 nm處測定吸光度，空白組是2mL DPPH和100 μL磷酸鹽緩沖溶液的混合液的吸光度[13-14]。

式中：Ai為樣品吸光光度值；Aj為空白組吸光光度值。

1.6.2 超氧陰離子清除能力的測定

用移液槍吸取4.5mL pH8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液和3.2mL的雙蒸水加入到10mL的試管中，緩慢搖晃試管使其混合均勻，吸取1mL不同濃度的樣品溶液加入到試管中，吸取3 mmol/L的鄰苯三酚溶液加入到另一支試管中，將兩只試管置于25℃的恒溫水浴箱中，水浴20min。再將0.3mL的濃度是3 mmol/L的鄰苯三酚溶液快速加到混有待測樣品的緩沖液中，空白管用10 mmol/L鹽酸溶液調(diào)零，在325 nm波長下測定吸光度值，每隔30秒測一次，測定時間在300 s～360 s內(nèi)的吸光度值，最后計(jì)算吸光度每分鐘的增加值ΔAo。將各個吸光度值帶入到公式中，求出不同濃度樣品對超氧陰離子（O2-）的清除率[15]。

式中：ΔAo為樣品吸光光度每分鐘的增加值；ΔA為空白組吸光光度值每分鐘的增加值。

1.6.3 羥自由基清除能力的測定

用移液槍吸取1mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液2mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液和1mL雙蒸水，振蕩使其混合，再加入1mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵，再次振蕩使其混合均勻，最后加入1mL 0.01%的過氧化氫溶液，在37℃條件下放置60min，在536 nm波長下測其吸光度，為損傷管的吸光值A(chǔ)（損）；再用1mL蒸餾水代替1mL過氧化氫，測得吸光度為A（未）；用不同濃度待測樣品1mL代替1mL雙蒸水測得吸光度為A（樣），平行測定3次不同濃度的樣品，分別記錄吸光度值，求平均值。將所得的各個吸光度帶入公式以下求出不同濃度樣品對于羥基自由基（·OH）的清除率[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用硫酸-苯酚法[17]測定葡萄糖在波長490 nm處的吸光度值，橫坐標(biāo)為吸光度值（x），葡萄糖濃度值（y）為縱坐標(biāo)，得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

如圖1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.139 7x-0.144，擬合系數(shù)R2=0.998 4，表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系（在葡萄糖濃度0～0.05mg/mL范圍內(nèi)）。

2.2 超聲波輔助復(fù)合酶法提取發(fā)芽糙米多糖的單因素影響結(jié)果

2.2.1 pH值對發(fā)芽糙米多糖提取率的影響

pH值對發(fā)芽糙米多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 pH值對多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH on Polysaccharides Yield

pH值的大小和酶的活力之間存在著密切的關(guān)系，酶活性中心存在著三維構(gòu)象，當(dāng)pH值的大小適宜時，三維構(gòu)象通過靜電作用達(dá)到最佳狀態(tài)，從而使酶與底物充分的接觸[18]。同時pH值還會影響酶的催化速度[19]。在試驗(yàn)過程中，隨著pH值的大小不斷變大，提取的多糖含量也在不斷變大，而當(dāng)提取多糖的溶解達(dá)到平衡時，pH值的大小再次變大，開始減弱了酶的催化速度，從而提取的多糖含量便開始呈下降的趨向，在pH值為6時是發(fā)芽糙米多糖得率的最適宜值。

2.2.2 時間對發(fā)芽糙米多糖得率的影響

酶解時間對發(fā)芽糙米多糖得率的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間對多糖得率的影響Fig.3 Influence of enzymolysis time on polysaccharides yield

提取時間影響著酶解的進(jìn)行程度，如果酶解提取時間太少，酶解反應(yīng)進(jìn)行的就會不是很充分，當(dāng)溶解達(dá)到平衡時，增加酶促反應(yīng)的時間沒有很明顯的提高多糖提取得率[20]。在超聲波輔助下，不同酶解時間條件下的多糖得率，試驗(yàn)過程中多糖的得率隨著提取時間的不斷增加而增加，在2.5 h左右多糖得率最大，如果再增加提取時間，提取率反而呈下降趨勢。從操作費(fèi)用方面進(jìn)行來看如果提取的時間過長會拖延整個生產(chǎn)周期，操作費(fèi)用增多，導(dǎo)致多糖水解，所以多糖提取的最佳時間為150min。

2.2.3 溫度對發(fā)芽糙米多糖得率的影響

酶解溫度對多糖得率的影響如圖4所示。

圖4 溫度對多糖得率的影響Fig.4 Influence of enzymolysis temperature on polysaccharide yield

溫度對酶催化反應(yīng)有著極為重要的影響，溫度不僅影響了酶的活性，還影響著溶解度、組織細(xì)胞等[21]。在一定的溫度范疇里，提升溫度，多糖的溶解度也隨之變大，減弱了提取液的黏度，增大了溶劑的擴(kuò)散速率、也增大了多糖固體成分的破碎程度。當(dāng)超過了最適溫度，過高的溫度破壞了酶蛋白質(zhì)，使其變性，從而使酶活力不斷降低直到失活。隨著溫度的不斷升高，酶解速度也會逐漸變慢[22]。

一定范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的不斷變大，多糖的得率也變大，而當(dāng)提取的多糖達(dá)到溶解平衡，組織細(xì)胞內(nèi)外濃度也達(dá)到平衡時，多糖的得率也呈下降的趨向，這是由于當(dāng)溫度超過最適溫度，酶活會變?nèi)?，因?0℃為發(fā)芽糙米多糖得率的最佳提取溫度。

2.2.4 酶添加量對發(fā)芽糙米多糖提取率的影響

不同復(fù)合酶添加量條件下的糙米多糖得率結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶添加量對多糖得率的影響Fig.5 Influence of enzyme addition on polysaccharides yield

在一定的范圍內(nèi)，隨著酶的添加量的增大，增大了酶和底物接觸的機(jī)會，在相同的時間里增大了水解的分子數(shù)量[23]，使多糖能快速地分離出來從而使提取效率升高，當(dāng)復(fù)合酶用量過大時，過于飽和，一部分酶，無法與底物接觸，減弱了水解底物的速度，使多糖得率變低，增加操作成本[24]。因此，需要找到最佳的酶添加量。

多糖得率隨著酶添加量的增加而上升，隨著酶添加量的增多，多糖的得率也會上升；當(dāng)酶添加量為1.5%時，多糖得率達(dá)到最高值；當(dāng)添加酶的量多于1.5%時，酶的添加量繼續(xù)變大，多糖的得率隨之變小，也許是因?yàn)榇藭r酶用量達(dá)到了飽和。因此，選擇復(fù)合酶添加量為1.5%。

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對酶解溫度（A）、酶解時間（B）、pH 值（C）和酶添加量（D）采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-expert8.0.6建立四因素三水平的響應(yīng)分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表Table 2 Experimental design and results

并利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到發(fā)芽糙米多糖提取率（y）對編碼自變量A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程：

y=48.12+5.12A+2.35B+4.18C+7.22D-0.32AB+1.12AC+1.51AD+1.38BC+0.012BD-5.6CD-12.45A2-12.17B2-10.21C2-12.11D2

由該模型的方差分析表3可知：該試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.000 1），方差的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.100 4＞0.05），說明模型的選擇是合適的；在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，B、AB 項(xiàng)顯著（P＜0.05），A、C、D、CD、AC、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)均為極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與最佳提取條件的確定

如圖6所示，通過對6個響應(yīng)曲面和6個等高線圖的分析可以預(yù)測和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值和確定變量之間的關(guān)系[25]，如果響應(yīng)曲面越陡則各因素之間具有越顯著的交互作用。分析等高線圖也可判斷交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不明顯[26]。通過響應(yīng)曲面發(fā)現(xiàn)，酶解溫度、酶解pH值和酶添加量對發(fā)芽糙米多糖提取率的影響都最大，酶解時間對發(fā)芽糙米多糖提取率的影響稍弱，這與方差分析結(jié)果一致。通過Design-Expert 7.5軟件分析，獲得發(fā)芽糙米多糖的最佳提取條件：酶解溫度為50℃、酶解時間為2.5 h、酶解pH值為6、酶添加量為1.5%。在此條件下，發(fā)芽糙米多糖的提取率最高，提取率的預(yù)測值為38.14%，在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)（做3個平行試驗(yàn)），得到實(shí)際粗多糖的平均提取率為37.58%；與理論預(yù)測值相比相差不顯著，說明模型可以較好地反映出發(fā)芽糙米多糖提取的條件。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of different extraction parameters on the yield of polysaccharide

2.4 發(fā)芽糙米多糖抗氧化性測定結(jié)果

2.4.1 DPPH法測定發(fā)芽糙米多糖抗氧化性的變化

多糖濃度與DPPH自由基清除的關(guān)系如圖7所示。

圖7 多糖對DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH free radical-scavenging effect of polysaccharides

由圖7可知，抗氧化能力隨多糖濃度升高逐漸增強(qiáng)，這是由于多糖類化合物的抗氧化作用。在研究中多糖濃度為0.6mg/mL時，DPPH自由基清除率最高，達(dá)到95.85%，基本達(dá)到DPPH自由基清除率的最高值，抗氧化性最強(qiáng)[27-28]。

2.4.2 鄰苯三酚自氧化法測定發(fā)芽糙米多糖抗氧化性的變化

圖8 多糖對O2-自由基的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of polysaccharides on superoxide anion free radicals

多糖濃度與O2-自由基清除的關(guān)系如圖8所示。由圖8可知，多糖含量越高，其對O2-自由基清除作用越強(qiáng)，因此抗氧化能力隨多糖濃度升高逐漸增強(qiáng)，多糖濃度為0.6mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率最高，達(dá)到66.67%，基本達(dá)到超氧陰離子自由基清除率的最高值，抗氧化性最強(qiáng)。

2.4.3 鄰二氮菲法測定發(fā)芽糙米多糖抗氧化性的變化多糖濃度與羥基自由基清除的關(guān)系如圖9所示。

圖9 多糖羥自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacities of polysaccharide

由圖9可知，多糖的濃度對羥基自由基的清除不太穩(wěn)定，其與多糖濃度并不成正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，多糖濃度0.1mg/mL～0.5mg/mL葡萄糖濃度為0.5mg/mL時，羥基自由基清除率最高，達(dá)到53.35%，抗氧化性最強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過超聲波輔助復(fù)合酶法對發(fā)芽糙米中的多糖類物質(zhì)進(jìn)行提取，對影響多糖得率的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)確定超聲波輔助復(fù)合酶法提取發(fā)芽糙米多糖的最佳工藝條件為：復(fù)合酶的酶解pH值為6，酶解時間2.5 h，酶解溫度為50℃，酶添加量為1.5%，此條件下多糖得率為37.58%。

利用發(fā)芽糙米多糖檢測DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除能力。結(jié)果表明：多糖濃度為0.6mg/mL時，對DPPH自由基清除率達(dá)到了95.85%；對超氧陰離子自由基清除率達(dá)到了66.67%；對羥基自由基清除率最高了達(dá)到53.35%。這些結(jié)果說明糙米中多糖對DPPH自由基和超氧陰離子，羥基自由基均有較強(qiáng)的抗氧化作用。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Polysaccharide in Germinated Brown Rice

ZHANG Yu1，MA Yong-qiang1，*，LIU Xiao-fei1，2，*，WANG Xin1，MENG Qing-hong2，LU Shu-wen2
（1.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Key Laboratory for Food Science and Engineering in Heilongjiang College and University，Harbin 150076，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

The germinated brown rice is the raw material，extract polysaccharides from brown rice germination by ultrasonic assisted method of compound enzyme，the germinated brown rice yield of polysaccharide was the index of single factor experiment，and through the response surface experiment to determine the optimum conditions.Meanwhile，the anti-oxidative activity of polysaccharides were detected.The results showed that the optimal ultrasonic-assisted extraction parameters were composite enzyme of （papaya protease，cellulase，pectinase adding quantity proportion for 4 ∶3 ∶2）at 1.5%dosage for 2.5 h at pH 6 and 50 ℃.Under such conditions，the maximum yield of polysaccharides from the germinated brown rice was 37.58%.The polysaccharide of germinated brown rice had strong clearance power to OH-，O2-and DPPH free radicals.

germinated brown rice；polysaccharides；ultrasound；enzyme complex method；response surface method；antioxidant activity

張宇，馬永強(qiáng)，劉曉飛，等.發(fā)芽糙米中多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：30-37

ZHANG Yu，MA Yongqiang，LIU Xiaofei，et al.Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Polysaccharide in Germinated Brown Rice[J].Food Research and Development，2018，39（1）：30-37

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.007

哈爾濱商業(yè)大學(xué)校級科研項(xiàng)目（17XN023）

張宇（1992—），男（漢），在讀碩士研究生，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程專業(yè)。

*通信作者：馬永強(qiáng)（1963—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與利用；劉曉飛（1980—），女，副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物。

2017-10-16