柴志欣，宋娜娜，鐘金城*，何世明，吳錦波，蹇尚林

三江黃牛Y染色體ZFY基因遺傳多樣性研究

柴志欣1，宋娜娜1，鐘金城1*，何世明2，吳錦波2，蹇尚林3

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；2.阿壩州畜牧科學(xué)研究所，四川 汶川 623000;3.阿壩州畜牧工作站，四川 汶川 623000）

三江黃牛原產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣，具有軀干較長、役用性能良好、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，是經(jīng)長期人工選育的優(yōu)良地方黃牛品種，為遺傳資源寶貴基因庫。試驗(yàn)對三江黃牛Y染色體特異ZFY基因作遺傳多態(tài)性分析，發(fā)掘三江黃牛遺傳起源。結(jié)果表明，ZFY基因第11外顯子長度為1 090 bp，T、A、C、G平均含量分別為24.2%、34.2%、20.7%、20.9%，存在堿基偏好性；發(fā)現(xiàn)22個突變位點(diǎn)，18個轉(zhuǎn)換，4個顛換，其核苷酸多樣性（Pi）為0.007 61，檢出16種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.993，說明三江黃牛群體ZFY基因遺傳多樣性較豐富；系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳距離分析表明，三江黃牛優(yōu)先和大額牛、瘤牛、野牛聚為一類，研究為瀕危三江黃牛品種保種、選育及來源提供依據(jù)。

三江黃牛；ZFY基因；遺傳多樣性

三江黃牛產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣，三江、水磨、白石和映秀等鄉(xiāng)鎮(zhèn)為主產(chǎn)區(qū)，理縣、茂汶等地有少量分布，具有軀干較長、役用性能良好、肉質(zhì)好、抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，經(jīng)長期選育形成的優(yōu)良地方黃牛品種。但隨當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)社會發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式改變，三江黃牛產(chǎn)區(qū)功能布局空間受限，三江黃牛養(yǎng)殖規(guī)模、種群數(shù)量銳減，目前僅存2 000余頭，瀕臨滅絕。因此，加強(qiáng)三江黃牛遺傳資源研究和保護(hù)尤為重要。

目前，三江黃牛分子遺傳學(xué)研究較少，主要集中在線粒體基因組等母系遺傳基礎(chǔ)上，種群內(nèi)Y染色體重組多樣性相對較低，但分化程度較高[1-4]。因此，從Y染色體角度分析物種遺傳多樣性具有理論意義[5]。 ZFY基因是Y染色體鋅指蛋白（Zinc Finger Protein）編碼基因，位于 Y染色體短臂，包含 11個外顯子和 1個隨機(jī)重復(fù)區(qū)域“鋅-指”結(jié)構(gòu)，“鋅-指”結(jié)構(gòu)由 2個組氨酸和 2個半胱氨酸構(gòu)成[6-7]。ZFY基因共編碼 801個氨基酸，其堿基序列屬于 X-退化[8]，在未發(fā)現(xiàn)SRY基因?yàn)樾詣e決定因子前，ZFY基因作為重要候選基因用于物種性別鑒定[9]。ZFX和 ZFY基因具有較高一致性，但研究表明二者進(jìn)化過程不同，ZFY基因變異率和遺傳變異程度更高，進(jìn)化中更活躍，ZFX基因相對 ZFY基因較保守[10-12]。針對 Y染色體基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究較多。毛德才等通過擴(kuò)增牦牛ZFX、ZFY基因第 11外顯子部分序列，與其他 9個物種比較分析發(fā)現(xiàn) ZFX和 ZFY序列具有較高一致性[13]。朱睦楠等通過系統(tǒng)進(jìn)化分析巖羊和矮巖羊 226份糞便cytb基因和 Y染色體ZFY基因發(fā)現(xiàn)，喜馬拉雅塔爾羊和巖羊、山羊遺傳距離最近，綿羊與山羊、塔爾羊、巖羊親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)[14]。熊勇等通過測序獲得藏系綿羊ZFX、ZFY基因序列，探討藏系綿羊遺傳進(jìn)化情況，發(fā)現(xiàn)藏系綿羊與摩弗倫羊親緣關(guān)系最近[15]。金梅等利用ZFX、ZFY基因鑒定絨山羊性別和進(jìn)化情況[16]。Isa?cj等分析性染色體相關(guān)ZFX和 ZFY基因序列特征和多態(tài)性差異[17]。Han等探討馬ZFX、ZFY基因片段長度差異[18]。本研究通過測序 Y染色體特異性ZFY基因，結(jié)合其他牛亞科該基因序列數(shù)據(jù)，探討三江黃牛群體遺傳多樣性水平，為三江黃牛遺傳資源的保護(hù)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采集于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣三江鄉(xiāng)和水磨鎮(zhèn)，選取毛色黃色、體型較大、特征明顯三江黃牛個體，采集耳組織樣 60份（60頭個體），75%乙醇保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA提取

三江黃牛總 DNA采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（購自天根生物技術(shù)有限公司），DNA純度采用2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)（A260/A280比值）檢測。

1.3 引物序列及合成

利用 Primer primer5.0軟件對三江黃牛 ZFY基因第 11外顯子設(shè)計(jì)兩對引物（見表1）。引物由英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司合成。

表1 三江黃牛ZFY基因引物序列Table 1 Primer of ZFY gene in Sanjiang cattle

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 9.5 μL，上游引物、下游引物、DNA模板各 1μL，2×long Taq DNA 預(yù)混酶（Thermo Scientific）12.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 1 min；51.7℃復(fù)性 1 min；72℃延伸 45 min（引物1）和50 min（引物2），30 個循環(huán)；最后72℃延伸 7 min， 4℃保存。PCR 產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳，95 V恒壓電泳 30 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.5 克隆及測序

將PCR產(chǎn)物膠回收、分離、純化得目的片段，與 PMD19-T載體連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5a）中，涂于含有 IPTG、X-Gal、Ampr抗生素平板上篩選藍(lán)白斑，獲白色單一菌落，接種于含 Amp LB液體培養(yǎng)基上獲得陽性菌落，送英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 牛亞科代表物種ZFY序列

測序得三江黃牛 ZFY基因序列，Genebank獲得大額牛（Bos frontalis）（DQ336550）、非洲水牛（Syncerus caffer）（DQ336554）、家牦牛（Bos grunni?ens）（DQ 336551）、 美 洲 野 牛（Bison bison）（DQ336552）、普通牛（Bos taurus）（DQ336546）、歐洲野牛（Bison bonasus）（DQ336553）、水牛（Bubalus bubalis）（DQ 336555） 、 野 牛 （Bos gaurus）（DQ336549）、瘤牛（Bosindicus）（DQ336547）等牛亞科代表物種ZFY基因序列。

參考汪琦等測序方法獲得三江黃牛cytb序列[19]， 從 Genebank 獲 得 大 額 牛（Bos frontalis）（EF061237） 、 非 洲 水 牛 （Syncerus caffer）（AF036275） 、 家 牦 牛 （Bos grunniens）（AF091631） 、 美 洲 野 牛 （Bison bison）（AF036273）、普通牛（Bostaurus）（D34635）、歐洲野牛（Bison bonasus）（Y15005）、水牛（Bubalusbubalis）（D88631）、野牛（Bos gaurus（AY079128）、 瘤牛（Bosindicus）（AF419237）等牛亞科代表物種 cytb基因序列。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用 DNAMAN、Seqman和 DNASTAR等軟件校正、比對、拼接所測序列。clustalX1.83比對Genebank下載同源序列[20]；選取牛亞科代表物種，NJ（Neighbor Joining Method）法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，MEGA5.0計(jì)算遺傳距離[21]；DNAsp4.0軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)（Polymorphic Site）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity）、核苷酸單倍型數(shù)目（Number of Haplotypes）、單倍型多樣度（Haplo?type diversity）及 Tajima′s D 中性檢驗(yàn)值[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三江黃牛ZFY基因PCR擴(kuò)增

參考普通牛 ZFY基因全序列（Accession No.:NC_016145），利用 ZFY-11-1引物擴(kuò)增三江黃牛不同個體第 11外顯子部分序列，片段長 602 bp（見圖1），測序所得序列與參考基因比對完全匹配，說明擴(kuò)增結(jié)果正確。ZFX基因和 ZFY基因一致性較高，屬同源基因，主要差異為ZFX基因上存在 AvaⅡ 酶切位點(diǎn)（識別位點(diǎn)），而 ZFY基因不存在[23-24]，因此根據(jù)酶切位點(diǎn)鑒定雄性個體。將擴(kuò)增出 60個個體序列利用在線酶切位點(diǎn)分析軟 件 （http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new）分析發(fā)現(xiàn)共有 17個個體序列未被 AvaⅡ酶切，鑒定 17個個體為雄性，43個個體為雌性。利用 ZFY-11-2引物擴(kuò)增雄性個體，目的片段長度為 734 bp（見圖2）。將兩對引物擴(kuò)增序列拼接獲得 1 090 bp片段，用于后續(xù)分析。

圖1 三江黃牛ZFY-11-1引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresisof PCR products of ZFY-11-1 primers of Sanjiang cattle

圖2 三江黃牛ZFY-11-2引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresisof PCR products of ZFY-11-2 primers of Sanjiang cattle

2.2 三江黃牛ZFX/ZFY基因一致性比對

采用 DNAMAN軟件比對ZFY-11-1引物擴(kuò)增出 43頭雌性個體 ZFX基因和 17頭雄性個體 ZFY基因序列，一致性為 97.3%。將三江黃牛與 NCBI上獲得綿羊、家貓、家犬、人、黑猩猩、猴子、家鼠 ZFY/ZFX基因核苷酸序列比對，三江黃牛 ZFY基因核苷酸序列與綿羊ZFY序列一致性最高為 95.55%，與家貓、家犬、人、黑猩猩、猴子、家鼠一致性為 87.72～92.35%。ZFX基因核苷酸序列與綿羊 ZFX序列一致性為98.72%，和家貓、家犬、人、黑猩猩、猴子、家鼠的一致性為 92.35～95.81%（見表2）。ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 在 線 分 析將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，結(jié)合 DNA?MAN軟件將三江黃牛候選基因氨基酸序列與其他 7個物種比對，可知三江黃牛與其他物種ZFY基因氨基酸序列一致性為 92.13%～97.19%，ZFX基因氨基酸序列一致性為98.85%～100%（見表3）。

表2 ZFY/ZFX基因核苷酸序列一致性比較Table 2 Consistency comparison of theof ZFY/ZFX gene nucleotide sequences (%)

表3 ZFY/ZFX基因編碼氨基酸序列一致性比較Table3 Consistency comparison of amino acid sequenceencoded by ZFY/ZFX gene (%)

2.3 三江黃牛ZFY基因遺傳多樣性

兩對引物擴(kuò)增序列拼接得基因11外顯子部分片段長度為 1 090 bp，個體間序列無長度差異，T、A、C、G平均比例分別為 24.2%、34.2%、20.7%、20.9%，A+T含量為 58.3%，G+C含量為 41.7%，說明 ZFY基因 A+T含量相對豐富，存在一定堿基偏倚性。

利用DNAsp軟件計(jì)算三江黃牛 ZFY基因核苷酸多樣性和單倍型多樣性，獲 16種單倍型（見表4）和 22個同義突變位點(diǎn)，其中 18個轉(zhuǎn)換，4個顛換，單倍型多樣性（Hd）為 0.993，核苷酸多樣性（Pi）為 0.007 61。單倍型分類中僅第 2種單倍型包含2個個體（18號，55號），其余 15種單倍型僅包含1個個體，但單倍型種類較多，說明三江黃牛群體遺傳多樣性較豐富。試驗(yàn)獲得ZFY基因序列保守區(qū)域1個，長度 374～1 076 bp，A、T、C、G含量分別為 34.1%、24.5%、21.1%、20.3%，在該保守區(qū)域 A+T含量為 58.6%，與總A+T堿基含量相近。Tajima值為 1.04 088，中性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著（P＞0.1）。

表4 三江黃牛ZFY基因單倍型分布Table 4 ZFY gene haplotypesof Sanjiang cattle

2.4 三江黃牛與其他牛種的遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用三江黃牛 ZFY基因序列，選取 9個牛亞科代表性物種，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖3），可聚為 2大類，三江黃牛和大額牛、瘤牛、野牛聚為一類；普通牛、歐洲野牛、美洲野牛、家牦牛聚為一類；之后三江黃牛、大額牛、瘤牛、野牛、普通牛、歐洲野牛、美洲野牛、家牦牛聚為一大類；非洲水牛和水牛聚為一類。利用Cytb基因序列聚類結(jié)果也為2類，三江黃牛首先與大額牛聚為一類；瘤牛和野牛聚為一類；三江黃牛、大額牛、瘤牛、野牛又與普通牛、歐洲野牛聚為一類；家牦牛與美洲野牛聚為一類；之后三江黃牛、大額牛、瘤牛、野牛、普通牛、歐洲野牛與家牦牛、美洲野牛聚為一大類；非洲水牛和水牛聚為一類。三江黃牛 ZFY基因和Cytb基因聚類結(jié)果相同，均優(yōu)先與大額牛、瘤牛、野牛聚為一類，說明其親緣關(guān)系較接近。MEGA5.0軟件分析 10個牛種間的遺傳距離，ZFY基因雙參數(shù)遺傳距離（見表5），三江黃牛與大額牛、瘤牛、野牛的遺傳距離為 0，說明三者之間遺傳距離較近。普通牛、歐洲野牛、美洲野牛、家牦牛為0.004，非洲水牛最遠(yuǎn)為0.012，水牛為0.010，與地理位置分布一致。cytb基因 Kimura雙參數(shù)遺傳距離（見表6），可知三江黃牛與大額牛遺傳距離最近為 0.002，與瘤牛、野牛遺傳距離相對較近，分別為 0.016和0.018。10個品種間普通牛和非洲水牛距離最遠(yuǎn)為0.153。ZFY基因計(jì)算遺傳距離結(jié)果低于cytb，說明線粒體基因的分化程度高于 Y染色體基因，但兩種結(jié)果均說明三江黃牛與大額牛、瘤牛、野牛的遺傳距離更接近，且與聚類分析結(jié)果一致。

表5 基于ZFY基因牛亞科不同物種間遺傳距離Table 5 genetic distance among species of Bovinae ZFY gene

表6 基于cytb基因牛亞科不同物種間遺傳距離Table 6 genetic distance among species of Bovinae cytb gene

圖3 NJ法構(gòu)建牛亞科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighborjoining treereconstructed in Bovinae

3 討論與結(jié)論

近年研究發(fā)現(xiàn)，在生物進(jìn)化過程中，ZFX較ZFY穩(wěn)定、保守，ZFY基因變異率大于ZFX。ZFX/ZFY作為性別鑒定主要工具，依據(jù)樣品類型如糞便、羽毛等對稀有物種作性別鑒定。線粒體基因組作為母系遺傳研究主要依據(jù)，為物種起源進(jìn)化及遺傳多樣性研究提供理論支持；而動物Y染色體遵循父系遺傳，突變率低，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是研究父系起源進(jìn)化及遺傳多樣性理想工具。近年來，隨Y染色體SNPs遺傳標(biāo)記（Y-SNPs）廣泛用于家牛起源進(jìn)化研究[25]。

本研究利用Y染色體ZFY基因，參考已測序三江黃牛cytb序列作聯(lián)合分析，利用ZFY-11-1引物擴(kuò)增出ZFY基因第11外顯子602 bp序列，通過在線酶切位點(diǎn)軟件分析發(fā)現(xiàn)無AvaII酶切位點(diǎn)17個個體，鑒定為雄性個體（與采樣記錄性別結(jié)果一致），ZFX/ZFY基因序列一致性比對結(jié)果為97.3%，與魏麗敏等研究馬鹿ZFX/ZFY基因序列一致性結(jié)果相同，說明不同物種ZFX/ZFY基因間存在變異[26]。通過對三江黃牛與另外7個物種ZFX/ZFY基因核苷酸序列比對分析可知，ZFX/ZFY基因核苷酸序列與綿羊序列一致性高，與其他6個物種序列一致性為87.72%～92.35%，氨基酸序列一致性為92.35%～95.81%，同時不同物種ZFX基因比對一致性結(jié)果均高于ZFY，說明ZFX基因在進(jìn)化過程中相對穩(wěn)定。

ZFY-11-2引物擴(kuò)增17個雄性個體第11外顯子部分序列，長734 bp，兩對引物擴(kuò)增序列拼接獲得1 090 bp片段，針對拼接片段分析得T、A、C、G平均比例分別為24.2%、34.2%、20.7%、20.9%，表現(xiàn)一定偏倚性。17個雄性個體中共鑒定出22個突變位點(diǎn)，其中18個轉(zhuǎn)換，4個顛換，轉(zhuǎn)換數(shù)量明顯多于顛換，說明ZFY基因堿基變異具有同位性、保守性特點(diǎn)，其核苷酸多樣性（Pi）為0.007 61，與郝榮超等報道荷斯坦牛核苷酸多樣性結(jié)果（0.006 25）接近[27]。針對17個個體檢出16種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.993，說明三江黃牛群體單倍型多樣性豐富，高于劉若余等報道貴州黃牛4個品種單倍型多樣性（0.695～0.909）[28]，與賴松家等研究四川5個黃牛品種單倍型多樣性結(jié)果相比，高于巴山黃牛（0.9048）、峨邊花牛（0.6000）、四川荷斯坦（0.5000），低于漢源黃牛（1.0000）[29]，說明三江黃牛群體遺傳多樣性較豐富，Tajima值為1.040 88，中性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著。

系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳距離分析，結(jié)果聚為2大類，三江黃牛優(yōu)先和大額牛、瘤牛、野牛聚為一類，再與其他牛種聚為一類，與汪琦等對三江黃牛D-loop序列聚類結(jié)果一致[30]。cytb序列系統(tǒng)進(jìn)化分析得到2大類，三江黃牛與大額牛、瘤牛、野牛先聚為一類，再與其他牛種聚為一類。分析結(jié)果均說明三江黃牛與大額牛、瘤牛、野牛親緣關(guān)系較近、遺傳相似性高，而與其他牛屬遺傳相似性相對較低。優(yōu)先與瘤牛聚為一類說明三江黃牛有瘤牛血統(tǒng)，與張成忠通過Y染色體G帶帶型、Ag-NORs、血液蛋白多態(tài)性等分析的結(jié)果一致，認(rèn)為四川黃牛屬瘤牛種[31]。張桂香等分析推測云南和四川等地區(qū)可能是中國瘤牛發(fā)源地之一[32]，說明三江黃?？赡転榱雠：蟠?。大額牛主產(chǎn)于云南貢山縣獨(dú)龍江一帶，從地理位置上和四川接近，推測為地緣或貿(mào)易等因素促進(jìn)兩種牛類基因交流，使之聚為一類。

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Genetic diversity of ZFY gene on Y chromosome in Sanjiang cattle/

CHAIZhixin,SONG Nana,ZHONG Jincheng,HE Shiming,WU Jinbo,JIAN Shanglin
(1.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;2.Animal Husbandry Science Institute of Aba Autonomous Prefecture,Sichuan Wenchuan 623000,China;3 Animal Husbandry and Veterinary Station of Aba Autonomous Prefecture,Sichuan Wenchuan 623000,China)

Native to Wenchuan County,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture,Sichuan Province,Sanjiang Cattle,featured by long body,good working capacity and adaptability as well as highquality meat,was a local improved cattle breed artificially selected and bred in long time,and it was also an extremely precious gene pool in genetic resources.This test made an analysis on its genetic polymorphism of Sanjiang Cattle in term of Y-chromosome specific ZFY gene to explore its genetic ancestry.According to the results,the exon 11 of ZFY gene was 1 090 bp long,and the contents of T,A,C and G were 24.2%,34.2%,20.7%and 20.9%in average respectively,showing a base bias;there were 22 mutation sites,including 18 in conversion and four in transversion,with the nucleotide diversity(Pi)of 0.007 61,and 16 haplotypes detected with the diversity(Hd)of 0.993,all of which meant that the Sanjiang Cattle group had a richer genetic diversity in ZFY gene.From the view of phyletic evolution and genetic distance analysis,Sanjiang Cattle firstly should be included into the same classification with gayal,zebu and buffalo.Such result could provide the theoretical basis for breed conservation and further breeding of the endangered Sanjiang Cattle breed and might be referenced as a basis for the possible source of Sanjiang Cattle.

Sanjiang cattle;ZFY gene;genetic diversity

Q93-332;S852.62

A

1005-9369（2017）12-0028-08

時間2017-12-18 13:44:45 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171218.1344.014.html

柴志欣,宋娜娜,鐘金城,等.三江黃牛Y染色體ZFY基因遺傳多樣性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(12):28-35.

Chai Zhixin,Song Nana,Zhong Jincheng,et al.Genetic diversity of ZFY gene on Y chromosome in Sanjiang cattle[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(12):28-35.(in Chinese with English abstract)

2017-09-19

中央高?；究蒲许?xiàng)目（2016NZYQN30）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015JY0248）；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）

柴志欣（1984-），女，碩士，講師，研究方向?yàn)殛笈＿z傳育種。E-mail：chaizhixin2525@163.com

*通訊作者：鐘金城（1963-），男，博士，教授，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種學(xué)。E-mail:zhongjincheng518@126.com