鄭明潔, 王 水, 陳 列, 馬 哿

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 乳腺外科, 江蘇 南京, 210029)

轉(zhuǎn)錄抑制因子鋅指蛋白57在乳腺癌中的表達(dá)及意義

鄭明潔, 王 水, 陳 列, 馬 哿

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 乳腺外科, 江蘇 南京, 210029)

目的探討鋅指蛋白57(ZFP57)在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理的相關(guān)性。方法應(yīng)用QPCR及Western Blot方法檢測乳腺癌細(xì)胞株中ZFP57表達(dá)，用QPCR方法檢測80例乳腺癌及癌旁組織中ZFP57表達(dá)，并分析與臨床及病理結(jié)果的相關(guān)性。結(jié)果在5種乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中, mRNA水平ZFP57相對表達(dá)量分別是(2.866±0.1986)、(1.000±0.0993)、(6.362±0.2970)、(10.150±0.4218)、(7.8000±0.421)，蛋白水平相對表達(dá)量為(2.689±0.0905)、(1.018±0.0561)、(7.044±0.1232)、(9.328±0.2981)、(7.390±0.2332)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在80例乳腺癌組織中ZFP57的相對表達(dá)水平為(0.0558±0.0101)，與癌旁組織中ZFP57的相對表達(dá)水平(0.1708±0.0267)比較有顯著差異(P<0.05)。臨床病理分析結(jié)果顯示，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為(0.0707±0.0138)，與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(0.0209±0.0064)比較有顯著差異(P<0.05)。腫塊≤2 cm為(0.0957±0.0215), 2～5 cm為(0.0418±0.0111), >5 cm為(0.0198±0.0097)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論ZFP57在乳腺癌中表達(dá)明顯下降，其表達(dá)與腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)。

鋅指蛋白57; 乳腺癌; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位于女性惡性腫瘤前列[1]。對乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物的預(yù)測研究仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。腫瘤微環(huán)境對腫瘤的生物學(xué)特性有著重要的調(diào)節(jié)作用。在前期的研究中，作者建立了人源性乳腺微環(huán)境模型，該模型由于具備了組織特異性和種屬特異性，更接近于臨床，能更好地模擬乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[2]。在該模型基礎(chǔ)上獲得了受到人源性乳腺微環(huán)境調(diào)控的靶點(diǎn)基因譜，其中鋅指蛋白57(ZFP57)在人源性微環(huán)境調(diào)控下表達(dá)明顯下調(diào)[3]。

ZFP57基因是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，定位于6號染色體，ZFP57蛋白由536個(gè)氨基酸組成，其中包含一個(gè)KRAB域和7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，它所包含的KRAB結(jié)構(gòu)域，能夠與Trime28結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，再與啟動子區(qū)結(jié)合以維持基因印記來調(diào)控印記基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。近年來，國外少量研究[6-7]提示該基因可能與纖維肉瘤、腦膠質(zhì)瘤具有一定相關(guān)性。本研究探討ZFP57在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的收集

選取南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年8月—2016年12月具有完整病例資料的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的病理組織80例，每例患者手術(shù)取切除的乳腺癌組織5 mm ×5 mm ×5 mm, 同時(shí)取其距離癌組織邊緣2 cm以上的癌旁組織5 mm ×5 mm ×5 mm。詳細(xì)記錄患者的性別、年齡及臨床病理特征，患者在手術(shù)前未進(jìn)行任何的放療或化療等抗癌治療。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞株SUM1315由密歇根大學(xué)的Stephen Ethier教授惠贈, MDA-MB-231、T47D、MCF-7以及ZR-75-1購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)，這幾株細(xì)胞均是目前乳腺癌研究中最常用的細(xì)胞株。細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)使用的是含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)呈上皮樣貼壁生長。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成

用 Primer 5.0軟件進(jìn)行分析設(shè)計(jì)PCR引物，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下: β-actin forward: 5′-GCATCGTCACCAACTGGGAC-3′; β-actin reverse: 5′-ACCTGGCCGTCAGGCAGCTC-3′; ZFP57 forward: 5′-CAGAGGGTCCTTTACCAGGAT-3′; ZFP57 reverse: 5′-CTCTCAGACTGGGATGTTGTTC-3′。

1.4 總RNA提取

① 從之前在液氮中取出5 mm ×5 mm ×5 mm的組織，放在EP管中用一次性研磨棒輕輕研磨至勻漿狀。同樣乳腺癌細(xì)胞經(jīng)胰酶溶解，消化，離心置于EP管中，加入1 mL Trizol試劑，室溫靜置5 min。② 加入200 μL氯仿，振蕩15 s, 室溫靜置5 min, 在低溫高速離心機(jī)以4 ℃、12 000 r/min離心15 min。③ 吸取上層液體轉(zhuǎn)至另一新EP管中，加入500 μL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min, 4 ℃、12 000 r/min離心10 min。④ 棄上清，加入1 mL 75%乙醇，置于4 ℃、10 000 r/min離心5 min, 棄上清。⑤加入DEPC處理后的水20～40 μL, 經(jīng)反復(fù)吹打溶解RNA。⑥ 取2 μL抽提的RNA加入98 μL 0.1% DEPC滅活RNA酶的去離子水中。⑦ 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA可直接用于RNA擴(kuò)增。

1.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

① 每個(gè)cDNA樣本都稀釋10倍(5 μL cDNA + 45 μL H2O)引物mixture(引物的F和R在同一管中)，濃度各為5 pmol/μL。② 上樣: 一個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，用移液器移至96孔板中。反應(yīng)體系: 2×的RTmix 10 μL; 模板(cDNA稀釋10倍)1 μL; 引物F和R各5 pmol/μL mix 2 μL; DEPC 水 7 μL; 共20 μL。③ PCR反應(yīng)程序: 95 ℃, 10 min; 95 ℃, 10 s, 40個(gè)循環(huán); 58 ℃退火，15 s; 72℃延伸，45 s。④ 每個(gè)樣品做3個(gè)副孔，以β-actin基因作為內(nèi)參。結(jié)果以基因的相對表達(dá)量即2-△△CT進(jìn)行比較。

1.6 蛋白印記

分別提取各乳腺癌細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，上樣總蛋白50 μg, 經(jīng)8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入SNCG一抗(1∶1 000稀釋)，置于搖床上4℃孵育過夜。次日，膜用TBST洗滌3次，每次10 min，洗膜后加入二抗(1∶3 000稀釋)，再次TBST洗滌3次，每次10 min, 用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(購于Pierce公司)檢測蛋白條帶，最后用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0的統(tǒng)計(jì)包，對于兩組間的比較，采用了t-檢驗(yàn),P<0.05(雙側(cè))。對于多組數(shù)據(jù)間的比較采取單因素方差分析,P<0.05(雙側(cè))。使用QPCR檢測結(jié)果, ZFP57在乳腺癌細(xì)胞及臨床標(biāo)本中的相對表達(dá)量采用2-△△CT表示。

2 結(jié) 果

2.1 ZFP57在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分析

QPCR法檢測發(fā)現(xiàn)，在5種乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中，ZFP57相對表達(dá)量分別是(2.866±0.1986)、(1.000±0.0993)、(6.362±0.2970)、(10.15±0.4218)、(7.800±0.6797)，相對于SUM1315，其余4種細(xì)胞的表達(dá)量均有顯著差異(P<0.05)。見圖1A。

Western法檢測發(fā)現(xiàn)，在5種乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、SUM1315、T47D、MCF-7以及ZR-75-1)中, ZFP57相對灰度值分別是(2.689±0.0905)、(1.018±0.0561)、(7.044±0.1232)、(9.328±0.2981)、(7.390±0.2332)，相對于SUM1315, 其余4種細(xì)胞的表達(dá)量均有顯著差異(P<0.05)。見圖1B、C。

圖1 ZFP57 在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 ZFP57在臨床組織標(biāo)本中表達(dá)水平分析

QPCR法檢測發(fā)現(xiàn), 80例乳腺癌患者的癌組織內(nèi)ZFP57的相對表達(dá)水平為(0.0558±0.0101), 80例乳腺癌患者的癌旁組織ZFP57的相對表達(dá)水平為(0.1708±0.0267), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 ZFP57 在乳腺癌及癌旁組織中的 相對表達(dá)量，* P < 0． 05

2.3 乳腺癌組織中ZFP57表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)不同臨床及病理分類，作者發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ZFP57相對表達(dá)量在≤50歲患者為(0.0496±0.0101), >50患者為(0.0626±0.0183), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.528)。絕經(jīng)前患者為(0.0601±0.0121), 絕經(jīng)后患者為(0.0527±0.0151), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.720)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為(0.0707±0.0138), 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為(0.0209±0.0064), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。腫塊≤2 cm為(0.0957±0.0215), 2～5 cm為(0.0418±0.0111), >5 cm為(0.0198±0.0097), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。根據(jù)分子分型, Luminal A型為(0.0782±0.0238), Luminal B型為(0.0579±0.0167), HER-2陽性型為(0.0359±0.0165), 三陰性型為(0.0484±0.0164), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.730)。

3 討 論

本研究中，作者首次探討了鋅指蛋白57(ZFP57)在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ZFP57的表達(dá)水平明顯低于癌旁乳腺組織。在與臨床及病理的相關(guān)性分析中，作者發(fā)現(xiàn)ZFP57的表達(dá)量與腫塊大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有顯著相關(guān)性，腫塊較大以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌組織中ZFP57表達(dá)量更低。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在惡性度較低的MCF7中ZFP57表達(dá)較高，而在易于轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231和SUM1315乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)較低。以上結(jié)果說明了ZFP57在乳腺癌中可能存在抑癌及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

有研究[4-5]表明, ZFP57基因作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，與Trime28結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，再與啟動子區(qū)結(jié)合以維持基因印記來調(diào)控印記基因的轉(zhuǎn)錄?；蛴∮浭侵阁w細(xì)胞來源于不同親代的一對等位基因發(fā)生的差異性表達(dá)，即機(jī)體僅表達(dá)來自親本一方的等位基因，而另一方不表達(dá)或很少表達(dá)。它是表觀遺傳學(xué)中重要的組成部分。在維持印記基因正常印記中，印記控制區(qū)(ICR)起重要作用。印記控制區(qū)是一組富含CpG島的序列，該區(qū)域的甲基化水平在兩條等位基因中存在差異。當(dāng)子代細(xì)胞同時(shí)獲得來自父源和母源的等位基因，其中一條表現(xiàn)為高甲基化，而另一條甲基化程度較低，造成這兩條等位基因表達(dá)的差異[6-8]。這種一方基因高甲基化的形成就與ZFP57密切相關(guān)。ZFP57與Trime28結(jié)合形成的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)與印記基因的印記控制區(qū)相連接，防止DNA的主動去甲基化，同時(shí)在甲基轉(zhuǎn)移酶的參與下維持印記基因的父源或母源的高甲基化。當(dāng)ZFP57表達(dá)缺失或下調(diào)，其調(diào)控的下游印記基因的差異性表達(dá)就難以維持，從而造成印記缺失，表達(dá)異常[9]。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，腫瘤中普遍存在印記基因的單等位基因調(diào)控缺失(LOI)。在正常組織中，印記基因的單等位基因甲基化，從而使表達(dá)處于中等水平。當(dāng)單等位基因的甲基化無法維持，就會出現(xiàn)雙等位基因的普遍低甲基化，導(dǎo)致印記基因高表達(dá)。同時(shí)研究[11-12]表明多種惡性腫瘤中都存在印記缺失的現(xiàn)象，在病理級別高和更易于轉(zhuǎn)移的腫瘤中印記基因的印記缺失比例更高。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中ZFP57的表達(dá)較正常組織明顯下降，這可能是腫瘤的異質(zhì)性決定的，來源于不同組織不同器官的腫瘤發(fā)生機(jī)制均存在差異[13]。由于采用的病例數(shù)量有限，本研究仍存在一定的局限性，如作者發(fā)現(xiàn)ZFP57的表達(dá)與分子分型并無顯著相關(guān)性，可能在增加樣本量的情況下會出現(xiàn)不同的結(jié)果。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄抑制因子ZFP57在乳腺癌中表達(dá)明顯下降，同時(shí)其表達(dá)與腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)的特征。該基因在乳腺癌中表達(dá)異常的發(fā)現(xiàn)可能成為新的乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物，并作為靶點(diǎn)基因運(yùn)用于乳腺癌的治療。

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Expressionoftranscriptioninhibitorzincfingerprotein57inbreastcanceranditsclinicalsignificance

ZHENGMingjie,WANGShui,CHENLie,MAGe

(DepartmentofBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029)

ObjectiveTo investigate the expression of zinc finger protein 57 (ZFP57) in breast cancer and its clinical significance.MethodsThe ZFP57 expressions were detected by quantitative real-time PCR(QPCR) and Western Blot technique. And its expressions in breast cancer and para-tumorous tissues in 80 patients were detected by QPCR method, and its correlation with clinical and pathogenic results were explored.ResultsIn these breast cancer cells (MDA-MB-231, SUM1315, T47D, MCF-7 and ZR-75-1), the expression contents of ZFP57 in mRNA level detected by QPCR was (2.866±0.1986), (1.000±0.09928), (6.362±0.2970), (10.15±0.4218), (7.800±0.6797), respectively, (P<0.05), while in protein level was (2.689±0.09051), (1.018±0.05613), (7.044±0.1232), (9.328±0.2981), (7.390±0.2332), respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). The average expression of ZFP57 in breast carcinoma was (0.0558±0.0101), while was (0.1708±0.0267) in para-carcinoma and they showed significant differences (P<0.05). The clinical pathogenic analysis revealed that there were significant differences in the average expression of ZFP57 in breast carcinoma without lymph nodes involvement and with lymph nodes involvement [(0.0707±0.0138) vs. (0.0209±0.0064),P<0.05]. The average expression of ZFP57 in masses smaller than 2 cm was (0.0957±0.0215), was (0.0418±0.0111) in masses between 2～5cm, and (0.0198±0.0097) in masses larger than 5 cm, which showed significant differences (P<0.05).ConclusionThe expression of ZFP57 in breast carcinoma is decreased. And the expression of ZFP57 is negatively correlated with the lymph nodes involvement and the size of masses.

Zinc finger protein 57; breast cancer; lymph node involvement

2017-07-10

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81702607); 江蘇省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(BK20151023)

R 737.9

A

1672-2353(2017)23-053-04

10.7619/jcmp.201723016