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基于智能手機的麻痹性貝毒現(xiàn)場快速檢測試紙條分析儀*

2017-12-26 08:27鐘隆潔萬梓健蘇凱麒潘宇祥黎洪波
傳感技術學報 2017年12期
關鍵詞:手持式貝類紙條

鐘隆潔,萬梓健,蘇凱麒,潘宇祥,黎洪波,王 平*

(1.浙江大學生物傳感器國家專業(yè)實驗室,生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室,生儀學院,杭州 310027;2.中國科學院傳感技術國家重點實驗室,上海 200050)

基于智能手機的麻痹性貝毒現(xiàn)場快速檢測試紙條分析儀*

鐘隆潔1,2,萬梓健1,2,蘇凱麒1,潘宇祥1,黎洪波1,王 平1,2*

(1.浙江大學生物傳感器國家專業(yè)實驗室,生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室,生儀學院,杭州 310027;2.中國科學院傳感技術國家重點實驗室,上海 200050)

石房蛤毒素(STX)是常見的麻痹性貝毒(PSP),通過食物鏈積累在貝類食品中,人類若食用這種有毒的貝類會影響健康,甚至中毒。因此迫切需要一種簡便的方法來檢測這種麻痹性貝毒以避免中毒事件的發(fā)生?;诟偁幮悦庖咴淼脑嚰垪l可以和石房蛤毒素產(chǎn)生特異性顯色反應,采用研發(fā)的新型手持式分析儀進行檢測分析。毒素分析儀采用智能手機作為光探測器,配合3D打印配件,再通過智能手機上研發(fā)的用于圖像采集和數(shù)據(jù)處理的應用程序,可對顯色后的試紙條進行分析處理并得出所測毒素的濃度。這種方法簡單、快速、檢出限低、靈敏度高。目前,本儀器可測得的STX的檢出限:5.2 ng/mL,檢測范圍:5.2 ng/mL~100 ng/mL。實驗表明,本文研制的基于智能手機系統(tǒng)和免疫分析的手持式試紙條分析儀有望成為對麻痹性貝毒進行現(xiàn)場快速檢測的有效工具。

手持式分析儀;智能手機;試紙條;現(xiàn)場快速檢測;麻痹性貝類毒素

海洋生物毒素是由海洋中的有毒藻類通過食物鏈傳遞給藻食性的魚、蝦及貝類等生物,并在其體內蓄積形成的有毒高分子化合物。海洋毒素種類繁多,其中貝類毒素是危害較大者之一。貝類毒素包括麻痹性貝類毒素(PSP)、腹瀉性貝類毒素(DSP)、神經(jīng)性貝類毒素(NSP)和記憶缺失性貝類毒素(ASP)。其中麻痹性貝類毒素是世界分布最廣、危害最大的一類赤潮藻毒。它是一類擁有胍基的三環(huán)氨基甲酸酯類化合物及其衍生物,包括石房蛤毒素STX(saxitoxin)及其天然衍生物如膝溝藻毒素GTXs(gonyantoxins)、新石房蛤毒素neoSTX(neosaxitoxin)組成,由海洋有毒甲藻代謝產(chǎn)生[1]。人們在食用麻痹性貝毒污染的貝類后,會對人體神經(jīng)肌肉產(chǎn)生麻痹作用,作用機理主要表現(xiàn)為阻斷神經(jīng)細胞鈉離子通道,從而造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙[2]。中毒嚴重時,則會出現(xiàn)呼吸困難,咽喉緊張,隨著肌肉麻痹不斷擴展加重,最終導致死亡[3]。麻痹性貝類毒素具有突發(fā)性和廣泛性,其毒性大、反應快、無適宜解毒劑的特點,因此開展對麻痹性貝類毒素的現(xiàn)場快速檢測及排除方法的研究對確保水產(chǎn)品及人民生命財產(chǎn)安全具有十分重要的意義。本文主要以麻痹性貝類毒素中的主要成份STX進行研究。

在PSP毒性的評估方法中,作為標準方法的是動物實驗,如小鼠生物測定法(MBA)。小鼠生物學測定方法在1978年由Yasumoto建立,是許多國家普遍采用的檢測貝毒的方法[4]。具體步驟是將貝類樣品的酸性提取液在小鼠腹腔注射,記錄小鼠的死亡時間。該方法使用“鼠單位”(Mu)來表達,美國公職分析化學家協(xié)會(AOAC)定義一個鼠單位為一只 20 g重的小白鼠在腹腔注射后15 min內死亡的毒素最小劑量。小鼠生物測試法的優(yōu)點是檢測技術簡單、方法易掌握、儀器簡易,不需要精密的高端儀器和專門的操作人員。該方法雖然容易掌握,不需要使用專門儀器,缺點是不具有特異性,不能確定樣品中毒素成分和結構,不同品系、不同批次的小鼠對毒素的敏感性差異較大,并且小鼠死亡時間的判斷受主觀因素、實驗室飼養(yǎng)條件以及實驗人員操作手法影響,樣品中生物基質成分復雜、干擾程度比較大,特別是游離脂肪酸對小鼠毒性影響很大,常常造成假陽性[5-6]。高效液相色譜法(HPLC)是目前較為常用的檢測貝類毒素的理化分析方法,常見貝類毒素均能使用HPLC進行檢測,靈敏度和準確性高,是比較成熟的理化分析技術[7]。HPLC方法利用毒素分子上的羧基官能團與熒光物質反應,生成的熒光性物質經(jīng)反相色譜分離后在檢測器上響應。HPLC的靈敏度和準確性高,同時還能確定毒素種類,但其熒光標記試劑極不穩(wěn)定,且設備精密復雜,檢測用時長。而免疫方法檢測是利用抗原-抗體反應確定毒素的類型及含量,包括酶聯(lián)免疫反應(ELISA),放射免疫反應(RIA),競爭性酶免疫分析(EIA)等方法。ELISA技術檢測貝類毒素具有檢測下限低,檢測范圍廣,同時具有特異性高、儀器設備投資少、檢測成本低、樣品前處理簡便及陽性結果與其他方法相一致等優(yōu)點,非常適合于對貝類毒素進行快速篩選檢測[8-9]。而免疫方法在針對有些貝類毒素的檢測時,如麻痹性毒素STX,可能存在與其他毒素之間的交叉反應;在檢測過程中,還有可能出現(xiàn)假陽性的情況[10-12]。

目前實驗室檢測麻痹性貝類毒素的方法中,小鼠法和HPLC由于儀器設備龐大,專業(yè)性強等原因無法發(fā)展成現(xiàn)場的快速檢測方法[13];免疫方法則較為適合發(fā)展成現(xiàn)場檢測的方法。但由于常規(guī)酶標儀的體積較大,不適合在現(xiàn)場環(huán)境下使用。為了能夠適應貝類毒素的現(xiàn)場快速檢測,本文研究了一種基于試紙條的現(xiàn)場快速檢測麻痹性貝類毒素的手持式分析儀。所使用的試紙條采用競爭免疫分析方法檢測,可以快速測量海洋毒素。新型手持式試紙條毒素分析儀使用低成本智能手機和3d打印配件組成。圖像采集和數(shù)據(jù)處理都是采用自制的iOS應用程序iStrip完成的。該手持式試紙條毒素分析系統(tǒng)有望成為一個現(xiàn)場毒素快速測量的平臺。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

石房蛤毒素(STX)購自美國Calbiochem;貝肉樣品取自深圳大亞灣水產(chǎn)區(qū);金標免疫分析儀購自杭州奧唯生物技術有限公司;甲醇、純水、鹽酸、PBS、0.45 μm濾膜,便攜式離心機,手持式均質器,移液槍,振蕩器,手持式試紙條毒素分析儀。

圖1 試紙條檢測原理圖

1.2 試紙條檢測原理

利用試紙條來檢測海洋毒素是采用競爭性免疫分析原理。滴加在加樣槽上的溶液在硝酸纖維素膜的毛細管作用下發(fā)生了顯色變化。這是由于測試樣品與分析物受體進行了免疫反應,在樣品通過特定區(qū)域時,免疫復合物被固定,因此實驗結果是在試紙條上會出現(xiàn)肉眼可辨別的顏色變化的條帶。如圖1所示,Au-Ab1是抗體Ab1耦合膠體金而形成的抗體標記物,固定在共軛層上。檢測線固定了抗原或抗原的類似物,質控線固定了另一種抗體Ab2。在加樣槽中滴加樣品溶液時,測試樣品中的抗原會先與抗體標記物形成Au-Ab1-Ag復合物,在毛細管作用下,樣品溶液進行流動到質控線與Ab2結合,形成Au-Ab1-Ag-Ab2復合物以確定試紙條的可用性[14]。

1.3 標準品及實際樣品的配制

為了建立STX標準曲線,用HCl(pH=3.0)配制6.25 ng/mL~100 ng/mL的STX標準溶液,本文采用的STX標準品濃度分別是6.25 g/mL,12.5 ng/mL,25 ng/mL,50 ng/mL,100 ng/mL。在實際樣品貝肉中用0.1M鹽酸提取,將貝肉攪碎后加入萃取液后,充分振蕩,水浴加熱5 min,離心10 min,使用0.45 μm濾膜過濾后收集上清液即可。

圖3 研制的軟件iStrip操作流程圖

1.4 手持式試紙條毒素分析系統(tǒng)設計

1.4.1 手持式試紙條毒素分析系統(tǒng)硬件設計

手持式分析儀包括兩大部分,一是智能手機,一個是3d配件(如圖2(a)所示)。手持式分析儀配件是用Solidworks設計,采用ABS(acrylonitrile butadiene styrene)塑料進行3D打印。整個配件的尺寸為97 mm×58mm×39 mm,可使手機及試紙條固定在同一直線上方便進行檢測,如圖2(b)。配件主要有手機定位槽和試紙條定位槽兩個部分,手機定位槽上的孔洞是為了配合手機上的按鈕以防止機械觸碰影響手機操作。智能手機上的攝像頭為35 mm的焦距,這個焦距成像距離短不足以滿足實驗的需要,因此我們在檢測儀上外加了一個11 mm的微焦鏡頭,它的成像距離為25 mm剛好可以連接手機鏡頭和匹配分析儀的后端。

圖2 手持式分析儀結構圖和實物圖

1.4.2 手持式試紙條毒素分析系統(tǒng)軟件設計

海洋毒素的濃度主要是通過檢測線的的顏色強度來確定的。智能手機通過拍攝試紙條圖像,采用自制軟件iStrip進行分析,軟件流程圖如圖3所示,提取子圖像特征值,建立標準曲線。實際樣品的濃度便可根據(jù)已建立的標準曲線來計算得到。iStrip的工作流程包括校準,樣品測量和數(shù)據(jù)共享。在校準過程中,iStrip進行標準物質標定并建立標準曲線,在界面中對標準物質實驗中數(shù)和標準物質重復數(shù)組進行設置。當所有標準物質實驗組的圖像采集完畢時,系統(tǒng)內部將進行分析,建立標準曲線,并將校準參數(shù)寫入校準文件及更新內置運算單元參數(shù)。使用iStrip采集未知樣品的圖像,然后利用線性相關性計算樣品濃度。在這些過程中,校準和測量階段的數(shù)據(jù)都能以txt格式存在智能手機中。

1.4.3 手持式檢測儀用于STX的檢測

進行STX實際樣品的檢測時,需先用手持式分析儀確定STX的標準曲線(如圖4)。將準備好的各5種不同濃度的STX標準溶液(本文采用的濃度梯度為6.25 ng/mL,12.5 ng/mL,25 ng/mL,50 ng/mL和100 ng/mL)分別吸取50 μL滴加到試紙條的加樣槽中,等待15 min左右,試紙條上的檢測線和質控線顏色發(fā)生變化,便可用檢測儀對試紙條進行采集分析,提取試紙條中心的G分量曲線。對每個樣品的G分量曲線進行去基線,排除光源強度不穩(wěn)定,試紙條暈染過程不均勻等因素干擾。再對G分量曲線進行濾波算法,去除試紙條或溶液中雜質的帶來的尖刺影響,使曲線光滑,利于后續(xù)分析。最終把G分量曲線上T檢測線的谷值作為標準曲線的特征值。在一定的檢測范圍內,每個濃度與之相對應的谷值相對應(在本文中標準品濃度以10為底的對數(shù)與各濃度對應圖像的特征值成線性關系),即可得到一條標準曲線。得出加標濃度的標準曲線后,可以直接檢測未知濃度樣品,并且通過分析儀的軟件界面上讀取樣品中所含毒素的濃度。

圖4 用手持式分析儀檢測樣品流程圖

圖5 快速檢測系統(tǒng)標定曲線

2 結果與討論

2.1 手持式試紙條毒素分析儀性能測試

使用濃度分別為6.25 ng/mL,12.5 ng/mL,25 ng/mL,50 ng/mL和100 ng/mL的STX標準品制定標準曲線,用手持式檢測儀逐個采集試紙條上的圖像,如圖5(a)所示,五條試紙條的質控線是一致的,均為有效,檢測線隨著濃度的增大而顏色變淺。在整個軟件分析過程中,我們使用的是RGB顏色通道中的G通道值進行像素值的獲取;在圖像采集中,iStrip會掃描整個試紙條來獲取到每個試紙條上相應位置的G通道值,因此掃描軟件上會出現(xiàn)整條G通道分量的掃譜線(如圖5(b))。用自制的軟件iStrip進行分析,可以檢測到每條試紙條上的像素出現(xiàn)兩個波谷,一個為質控線,一個為檢測線,質控線的像素點值基本一致,而檢測線的像素點值隨著濃度的增大而變大,因此濃度越高,顏色越淺,像素值越大,相對應的特征值,也就是檢測線T線的谷值越大,依據(jù)這個規(guī)律可建立起STX的標準曲線(標準曲線結果如圖5(c)。其中,橫坐標為各個STX標準品濃度以10為底的對數(shù),縱坐標為各濃度對應圖像的特征值,各濃度采用6個重復組,標定曲線斜率為-36.624,截距為145.122,線性度為0.967 2。)

使用手持式試紙條毒素分析儀對濃度分別為40×10-9,80×10-9的STX進行檢測,每種濃度將測得的結果與已知濃度數(shù)值相對比,測試裝置的準確度。在此標定曲線的基礎上,對已知濃度STX標準品的測試結果如表1所示。

表1 STX加標檢測結果

相對標準偏差體現(xiàn)了手持式試紙條分析儀對毒素檢測的重復性。表中可以看出,分析儀對于毒素濃度的濃度有著較高的平均回收率(>80%),且儀器相對標準偏差小于10%,說明本儀器對樣品中STX毒素的濃度進行檢測是可靠和穩(wěn)定的,所設計的現(xiàn)場快速檢測麻痹性貝毒STX的儀器性能可滿足現(xiàn)場檢測的需求。對于商用試紙條分析儀而言,主要通過檢測照射在試紙條后的反射光強來計算吸光度。在入射光的光強確定的情況下,假如試紙條顯色區(qū)域較薄而且均勻,即反射的光程保持一樣,則反射光的光強只和試紙條上的待測物濃度成單值函數(shù)。而試紙條分析儀采集的試紙條圖像的有效區(qū)域為紅色,使用互補色G分量進行分析,實驗證明與濃度成線性關系,符合朗伯-比爾定律。兩者都是使用了綠光通道上的吸光度來檢測濃度,原理上是互通的。使用手持式試紙條毒素分析儀和商用的金標免疫分析儀分別對6.25 ng/mL~80 ng/mL的16個加標樣品進行檢測,檢測結果如圖5(d),圖為兩種檢測方法的Bland-Altman圖,橫坐標為同一樣品兩種測量方法的測量均值,縱坐標為其同一樣品測量結果比值。從圖中可以看出,13.5%(2/16)的點(圖中實心圓圈代表的點)在95%一致性界限以外;在一致性界限范圍內,比值的最大值為1.12,最小值為0.81。也就是手持式毒素分析儀的測量值是商用讀卡器的0.81到1.12倍,即對于大多數(shù)樣品來說,手持式毒素分析儀的測量值與商用讀卡器測量結果相差12%到19%。在STX毒素檢測的實際應用中,這種差異是可接受的,因此這兩種儀器具有較好的一致性。

2.2 手持式試紙條毒素分析儀重現(xiàn)性與檢測下限測試

使用加標40 ppb的STX加標樣品進行實驗,在2 h每間隔5 min記錄測量儀器的特征值,共24組記錄值,測定其變異系數(shù),通過變異系數(shù)反應手持式毒素分析儀的重現(xiàn)性,實驗結果如圖6所示。在標定曲線的濃度范圍內,變異系數(shù)為1.6%,小于10%,重現(xiàn)性較好。

圖6 手持式毒素分析儀檢測特征值2 h變化圖

使用空白樣品檢測結果計算快速檢測裝置的檢測下限。測定一定數(shù)量的空白樣品試紙條,通過毒素分析儀計算得出對應數(shù)值,如表2所示。

表2 空白樣品檢測結果 單位:μg/kg

表1中,C0為空白樣品的實際檢測值,AVG為空白樣品實際檢測值的平均值,SD為測量值的標準差,LOD為檢測下限。其中檢測下限的計算方法如下:

LOD=AVG+3SD

由計算結果可知,分析儀檢測下限約為5.19 ppb,當樣品中STX濃度小于檢測下限時,系統(tǒng)檢測誤差較大。在實際應用中,應選擇合理的稀釋或濃縮倍數(shù)對樣品進行處理。

2.3 手持式試紙條毒素分析儀特異性測試

使用50×10-9的標準品和50×10-9的膝溝藻毒素(GTX-2,3)、短裸甲藻毒素(PbTx-2)、大田軟海綿酸(OA)標準品對手持式試紙條毒素分析儀的特異性進行實驗。其中GTX-2,3、PbTx-2與STX同屬于麻痹性的貝類毒素,而OA屬于腹瀉性貝類毒素??傻孟到y(tǒng)的響應曲線如圖7所示。

圖7 毒素分析儀特異性響應

圖7中,橫坐標為毒素標準品濃度以10為底的對數(shù),縱坐標為檢測系統(tǒng)得出的毒素濃度特異性結果。STX毒素濃度檢測特異性為95.2%,由于GTX-2,3與STX具有類似的分子結構,因此手持式試紙條毒素分析儀對GTX-2,3有較高的交叉反應率(15.0%),而對于PbTx-2和OA的交叉反應率較低(<15.0%)。由實驗結果可知,手持式試紙條毒素分析儀對STX有著良好的特異性。

2.4 實際樣品測試

聯(lián)合國衛(wèi)生組織規(guī)定100 g貝類可食部分的PSP限量為80 μg STX eq/100 g,毒素試紙條分析儀的檢測范圍是5.2 ng/mL~100 ng/mL,因此在檢測實際樣品時需要對樣品中的毒素進行提取和稀釋以盡量保證在分析儀的檢測范圍之內。若樣品超出檢測范圍,可對待測溶液進一步稀釋后,即可使用手持式試紙條毒素分析儀對實際貝肉樣品中的毒素含量進行測定。表3為9個實際樣品的檢測結果,其中第1、2、3號為在貝肉基質中加標1 000 ppb的樣品,超出系統(tǒng)檢測范圍,均檢出濃度>100 ppb。第7、8、9是貝肉基質空白樣品,系統(tǒng)均檢出小于檢測下限。對于4,、5、6號加標80×10-9的貝肉樣品,本系統(tǒng)檢測濃度有較高的準確率。

表3 STX樣品檢測結果

在實驗室環(huán)境下使用手持式試紙條毒素分析儀完成1個實際樣品檢測的用時為20 min,而且操作簡便,適用于批量檢測,樣品數(shù)量越多能夠節(jié)省的時間越多。由實驗結果可知,所設計的手持式試紙條毒素分析儀能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。

表4 快速檢測裝置與其他方法的比較

由表4可知而對于手持式試紙條毒素分析儀和主流的小鼠法,質譜法的比較可知,所設計的手持式試紙條毒素分析儀具有檢測時間短,一致性好,檢測限低,操作難度低等優(yōu)點,體現(xiàn)了儀器方法的優(yōu)越性。

3 結論

本論文采用手持式試紙條分析儀以現(xiàn)場和快速為目的對海洋毒素濃度定量化水平分析。這種方法是用基于試紙條并配合智能手機和相關電路實現(xiàn)的,由于傳統(tǒng)檢測方法(如小鼠生物法)存在著一些不足,不能滿足現(xiàn)場的快速檢測,因而采用試紙條及其檢測設備,可以更快速更方便的滿足檢測的需要。研制的軟件iStrip操作方便,只需幾個按鈕便能完成操作,而且還能對檢測的海洋毒素進行定量化分析。總之,由于智能手機的普及和便攜式儀器的高適應、高集成和容易操作的特點,可將此儀器廣泛推廣和應用。對比現(xiàn)有的商用儀器對STX的檢測,可證明此檢測儀器可定性和定量化檢測實際樣品的毒素濃度。因此,手持式試紙條毒素分析儀在海洋環(huán)境監(jiān)測應用和食品分析領域中將有很好的應用前景。

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NewHandheldStripAnalyzerforOn-SiteRapidDetectionofParalyticShellfishPoisoningBasedonaSmartphone*

ZHONGLongjie1,2,WANZijian1,2,SUKaiqi1,PANYuxiang1,LIHongbo1,WANGPing1,2*

(1.Biosensor National Special Laboratory,Key Laboratory for Biomedical Engineering of Education Ministry,Department of Biomedical Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China;2.State Key Laboratory of Transducer Technology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200050,China)

Saxitoxin(STX)are common marine toxins which can affect human health through food chain by accumulating in shellfishes. It is urgently required to have a convenient method for on-site detection of marine toxins to avoid the poisoning incidents that have occurred frequently. In this work,a handheld analysis meter system cooperating with competitive immunoassay strips is designed for rapid detection of STX. The smartphone is used as light detector,for image acquisition and data processing by a specific application. The 3D-printed portable accessory of smartphone is fixed for test strip. The method is simple and fast,with a detection limit of STX of 5.2 ng/mL,respectively. It can provide quantitative analysis of STX in the range of 5.2 ng/mL~100 ng/mL. Based on the smartphone system and biochemical analysis,it will be promising tool for on-site rapid detection for paralytic shellfish poisoning.

handheld analyzer;mobile terminal;test strip;on-site rapid detection;paralytic shellfish poisoning

10.3969/j.issn.1004-1699.2017.12.002

項目來源:國家海洋公益專項項目(201305010)

2017-05-10修改日期2017-07-18

R318

A

1004-1699(2017)12-1787-07

鐘隆潔(1994-),男,浙江大學生物醫(yī)學工程2016級碩士研究生,從事生物醫(yī)學工程與生物醫(yī)學傳感器研究,21615047@zju.edu.cn;

王平(1962-),男,浙江大學,教授,博士生導師,主要研究方向為傳感器與檢測技術、生物芯片與生物電子學、人工嗅覺與人工味覺等,cnpwang@zju.edu.cn。

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