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(北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

咯萘啶逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性及機(jī)制探討

李柱，農(nóng)巧紅，童剛領(lǐng)，王樹濱*

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518000)

目的在明確咯萘啶(PND)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADM耐藥性的藥效基礎(chǔ)上，初步探索作用機(jī)制。方法采用MTT法檢測(cè)單用阿霉素(ADM)和聯(lián)用咯萘啶(PND)對(duì)人乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM的抑制作用，得出半數(shù)抑制濃度(IC50)，并計(jì)算耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Fas和Caspases-3蛋白表達(dá)。結(jié)果ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/ADM的IC50分別為1.399 μg/mL和43.885 μg/mL，耐藥倍數(shù)為31.4倍。PND(0.5 μg/mL)聯(lián)合ADM作用MCF-7/ADM的IC50為3.246 μg/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為13.5倍，并能提高耐藥MCF-7/ADM中Fas和Caspases-3蛋白表達(dá)。結(jié)論P(yáng)ND能夠逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADM耐藥性，通過上調(diào)膜蛋白Fas表達(dá)，增加MCF-7/ADM對(duì)ADM的敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

咯萘啶； 阿霉素； 乳腺癌； MCF-7/ADM細(xì)胞； 逆轉(zhuǎn)耐藥； 細(xì)胞凋亡

隨著人們生存環(huán)境和生活習(xí)慣的改變，乳腺癌已成為女性癌癥患者死亡率最高的的癌癥[1]。雖然乳腺切除術(shù)能夠有效降低腫瘤負(fù)荷，但存在預(yù)后差、免疫功能下降等問題，并且給患者心理帶來極大的負(fù)擔(dān)[2]?；熓橇硪环N乳腺癌治療手段，但容易出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的棘手問題，這極大限制了阿霉素(adriamycin，ADM)等藥物的抗腫瘤作用[3]。目前，解決MDR問題的主要研究方向?yàn)閷ふ矣行У哪[瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑[4]。本研究采用咯萘啶(pyronaridine，PND)聯(lián)合ADM作用于人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM，觀察PND對(duì)MCF-7/ADM的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，并初步探索作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。

1.1.2 藥物與試劑 阿霉素購于南京奧多福尼生物科技有限公司，使用滅菌注射用水稀釋成16 mg/mL的母液，分裝后-20 ℃保存；咯萘啶購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，使用DMSO配制為16 mg/mL的母液，分裝，-20 ℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT噻唑藍(lán)購于Solarbio公司。小鼠抗β-actin單抗、小鼠抗Fas單抗、兔抗Caspases-3單抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠或兔，均購自CST公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。以起始濃度為4 μg/mL的ADM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后，逐漸增加ADM的濃度，每次ADM濃度增加2倍，同時(shí)監(jiān)測(cè)MCF-7細(xì)胞對(duì)ADM的IC50，待IC50達(dá)到40 μg/mL左右時(shí)，認(rèn)為其出現(xiàn)較強(qiáng)耐藥性，即成功培養(yǎng)出MCF-7/ADM細(xì)胞，在含1 μg/mL的ADM的上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)MCF-7/ADM細(xì)胞，以維持其耐藥性。設(shè)置MCF-7/ADM組、MCF-7/ADM +ADM組、MCF-7/ADM +ADM +PND組，共三個(gè)組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(MCF-7或MCF-7/ADM)，制備成懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)為1×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，每組設(shè)3個(gè)副孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含相應(yīng)濃度藥物的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)，作為處理組，同時(shí)設(shè)立只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組和不加藥物的陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，每孔加入20 μL的 MTT溶液(5 mg/mL)，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液后每孔加入200 μL的DMSO，搖床搖晃10 min，待晶體全部溶解后，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度(OD)。使用公式計(jì)算抑制率，抑制率(%)=[1-(處理組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/ADM的抑制作用 使用無血清培養(yǎng)基將ADM母液進(jìn)行稀釋，終濃度為0.01、0.05、0.25、1.25、6.25、31.25 μg/mL，然后干預(yù)MCF-7。同時(shí)，另外配制終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL的ADM無血清培養(yǎng)基，用于干預(yù)MCF-7/ADM。其余操作方法同“1.2.2”，得出抑制率，分別計(jì)算出ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/ADM的半數(shù)抑制濃度(IC50)，然后計(jì)算耐藥倍數(shù)，耐藥倍數(shù)= (MCF-7的IC50)/(MCF-7/ADM的IC50)。

1.2.4 PND對(duì)MCF-7/ADM的抑制作用 使PND在無血清培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16 μg/mL，求出對(duì)MCF-7/ADM的抑制率，然后將各濃度對(duì)應(yīng)的抑制率與不加藥物的陰性對(duì)照組比較，計(jì)算出抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的PND濃度。

1.2.5 PND逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM對(duì)ADM耐藥的作用

將“1.2.4”篩選出的對(duì)MCF-7/ADM無顯著抑制作用濃度的PND，與濃度分別為1、2、4、8、16、32 μg/mL的ADM聯(lián)用，按照“1.2.2”的步驟，求出逆轉(zhuǎn)后ADM對(duì)MCF-7/ADM的IC50，并計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(逆轉(zhuǎn)前IC50)/(逆轉(zhuǎn)后IC50)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路蛋白 同時(shí)設(shè)置MCF-7/ADM組、MCF-7/ADM +ADM組、MCF-7/ADM +ADM +PND組，共三個(gè)組。MCF-7/ADM組正常培養(yǎng)傳代。根據(jù)“1.2.3”和“1.2.5”中ADM對(duì)MCF-7/ADM的抑制率，選取單用ADM對(duì)MCF-7/ADM抑制率較低，但聯(lián)用PND對(duì)MCF-7/ADM抑制率較高的某一濃度作為ADM的濃度，用于MCF-7/ADM +ADM組和MCF-7/ADM +ADM +PND組。MCF-7/ADM +ADM +PND組中的PND濃度與“1.2.5”中的濃度相同。將細(xì)胞配制成密度為3×104/mL的懸液，然后接種于6孔板，每孔2 ml，24 h后， MCF-7/ADM組只更換培養(yǎng)基，MCF-7/ADM +ADM組加入相應(yīng)濃度的ADM，MCF-7/ADM +ADM +PND組同時(shí)加入ADM和PND，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，棄去上清液，加入200 μL含1%PMSF的細(xì)胞裂解液，冰上放置，并于振蕩器上搖晃15 min，然后用細(xì)胞刮將細(xì)胞碎片刮至一側(cè)，移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，放于4 ℃恒溫離心機(jī)中，13 000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量，加入蛋白上樣緩沖液，并補(bǔ)雙蒸水將總蛋白濃度調(diào)至5 μg/μL，沸水浴加熱5 min，分裝，-20 ℃保存。配制聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，取10 μL樣品上樣，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜3 h，室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜(內(nèi)參β-actin濃度1∶500，F(xiàn)as和Caspases-3濃度1∶1 000)，二抗(濃度1∶5000)室溫孵育2 h，顯色并曝光膠片。

2 結(jié) 果

2.1 ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/ADM的抑制作用

表1和表2結(jié)果表明，ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/ADM的抑制作用均與濃度呈正相關(guān)，但對(duì)兩種細(xì)胞的效價(jià)差別較大，對(duì)MCF-7的IC50為1.399 μg/mL，但對(duì)MCF-7/ADM的IC50達(dá)43.885 μg/mL，耐藥倍數(shù)為31.4倍。

表1 ADM對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05

表2 ADM對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞的抑制作用

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05

2.2 PND對(duì)MCF-7/ADM的抑制作用表3結(jié)果顯示，高濃度PND對(duì)MCF-7/ADM具有較強(qiáng)的抑制作用，在較低濃度時(shí)僅有微弱的抑制作用，因此，選擇無顯著抑制作用濃度為0.5 μg/mL的PND，用于下一步逆轉(zhuǎn)耐藥性研究。

2.3 PND逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM對(duì)ADM耐藥的作用表4結(jié)果表明，與單用ADM比較，在聯(lián)用PND時(shí)，低濃度的ADM對(duì)MCF-7/ADM具有顯著的抑制作用，IC50為3.246 μg/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為13.5倍。

表3 PND對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞的抑制作用

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05

表4 PND逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM對(duì)ADM耐藥的作用

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05

2.4細(xì)胞凋亡通路蛋白與MCF-7/ADM組比較， MCF-7/ADM +ADM組Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)；而MCF-7/ADM +ADM+PND組中Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

圖1 聯(lián)用PND對(duì)Fas和Caspase-3蛋白的影響1：MCF-7/ADM組；2：MCF-7/ADM+ADM組；3：MCF-7/ADM+ADM+PND組與MCF-7/ADM組比較，*:P<0.05

3 討 論

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是一種由基因調(diào)控的主動(dòng)的死亡方式，在生理與病理中起到重要作用[5]。細(xì)胞凋亡通路主要分為線粒體途徑和死亡受體途徑，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)是兩條細(xì)胞凋亡通路的共同效應(yīng)因子，在細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用[6]。死亡受體Fas(又稱APO-1或CD95)是一種細(xì)胞膜表面受體，能將凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游的Caspase，從而啟動(dòng)凋亡功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[7]。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡通路密切相關(guān)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的有效策略[8]。通過上調(diào)乳腺癌細(xì)胞膜表面Fas表達(dá)，進(jìn)而將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游Caspase，能促進(jìn)該腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]。ADM可通過Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)，激活Caspase，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11]。但是，在治療中可能會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM敏感性下降，導(dǎo)致療效不佳，雖然加大劑量可提高療效，但容易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了臨床使用，因此，尋找有效的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑成為是有效提高抗腫瘤治療的重要手段[12-13]。PND是我國(guó)研制的抗瘧藥，能夠逆轉(zhuǎn)瘧原蟲對(duì)氯喹的耐藥性，并且具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的作用，有望成為新一代腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑[14-15]。

本研究主要觀察PND對(duì)乳腺癌的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，結(jié)果表明，CMF-7/ADM對(duì)ADM具有較強(qiáng)的耐藥性，耐藥倍數(shù)達(dá)31.4倍，而與PND聯(lián)用可有效逆轉(zhuǎn)耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為13.5倍。PND和ADM聯(lián)用可上調(diào)細(xì)胞凋亡通路中Fas和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而增加CMF-7/ADM對(duì)ADM的敏感性，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，PND可逆轉(zhuǎn)CMF-7/ADM對(duì)ADM的耐藥性，其機(jī)制可能為上調(diào)膜表面Fas表達(dá)，增加CMF-7/ADM對(duì)ADM的敏感性，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

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ReversaleffectandmechanismofpyronaridineondrugresistanceofbreastcancercellMCF-7/ADM

LI Zhu,NONG Qiaohong,TONG Gangling,et al

(DepartmentofOncology,ShenzhenMedicalCollege,PekingUniversity,Shenzhen518000,GuangdongChina)

ObjectiveBased on the effect of pyronaridine (PND) in reversing drug- resistance of human breast cancer cell MCF-7/ADM,to explore the mechanism of action.MethodsThe inhibitory effect of simple adriamycin (ADM) and combined with PND on sensitive human breast cancer cell MCF-7 and drug-resistance MCF-7/ADM was detected by MTT assay,and to calculate median inhibitory concentration,resistance index and reversal index.Cells were designated as MCF-7/ADM group,MCF-7/ADM+ADM group and MCF-7/ADM+ADM+PND group.Western blot detected the expression of Fas and Caspases-3 in cells.ResultsThe IC50of ADM to MCF-7 and MCF-7/+ADM were 1.399 μg/mL和43.885 μg/mL,respectively,and the resistance index was 31.4.The IC50of PND combined with ADM to MCF-7/ADM was 3.246 μg/mL,and the reversal index was 13.5.Compared with MCF-7/ADM group,the expression of Fas and Caspases had no statistic difference (P>0.05) in MCF-7/ADM +ADM group,but the expression increased significantly in MCF-7/ADM +ADM+PND group (P<0.05).ConclusionPND could reverse drug- resistance of MCF-7/ADM by up-regulating expression of membrane protein Fas,which increased sensibility of MCF-7/ADM to ADM,and induced the cell apoptosis.

pyronaridine;adriamycin;breast cancer;MCF-7/ADM cell;reversing drug-resistance;apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.005

2017-02-20；

2017-05-23

深圳市創(chuàng)新知識(shí)計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ2015040309144300).

*通訊作者，E-mail:zhuewt@163.com.

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