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(南華大學附屬第二醫(yī)院骨科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

MicroRNA-638在骨肉瘤中表達下調(diào)及對其細胞增殖的影響

陳斌，符勇，夏雪，郭偉明，金浩成，王曉旭*

(南華大學附屬第二醫(yī)院骨科，湖南 衡陽 421001)

目的探討miR-638在人骨肉瘤(OS)細胞增殖行為中的影響。方法通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miRNA-638在人OS組織及癌旁組織、人OS細胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)和正常人成骨NHOst細胞株中的表達；用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-638模擬物或抑制物，細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)檢測轉(zhuǎn)染后的吸光光度值，平板克隆形成實驗檢測菌落數(shù)量。結(jié)果miR-638在各組細胞中均有表達；OS細胞株中miR-638的表達明顯下調(diào)(P<0.05)；高表達miR-638能抑制OS MG63和U2OS細胞的增殖(P<0.05)。結(jié)論miR-638高表達能抑制OS細胞的增殖。

骨肉瘤； MG63； U2OS； MicroRNA-638； 細胞增殖

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是兒童和青年中最常見的一種侵襲性骨腫瘤，最常見的原發(fā)部位為脛骨近端、肱骨近端及股骨遠端，大約60%的病例是10～20歲的青少年患者,占青少年腫瘤的6%[1]。在近幾十年來，人們雖然付出了大量努力來明確OS的致癌機制，但OS的生存率到達了一個瓶頸，晚期OS的預(yù)后依然很差。其增殖速度快、易轉(zhuǎn)移的特點，使得OS在臨床上的死亡率和致殘率都很高。

MicroRNA，簡寫為miRNA，又名微小RNA，是內(nèi)源性的、短小的單鏈RNA分子，由19．25個核苷酸組成，不參與蛋白質(zhì)的編碼，但調(diào)節(jié)基因的表達。因為miRNA與靶mRNA不完全互補配對，所以每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以共同調(diào)節(jié)同一靶基因，由此形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細調(diào)控功能基因的表達。miRNA是腫瘤分子生物學研究領(lǐng)域的熱點,研究發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存在上百種miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中有舉足輕重的作用，尤其在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測方面具有應(yīng)用價值。Wang等[2]檢測了非小細胞肺癌SPC-A1細胞培養(yǎng)上清液中miR-638表達水平及細胞凋亡率以及裸鼠移植瘤模型后體內(nèi)的血清miR-638表達水平。結(jié)果顯示血清miR-638水平與非小細胞肺癌患者的生存率是相關(guān)的，在臨床上miRNA-638水平可能被視為非小細胞肺癌預(yù)后的潛在獨立預(yù)測因子。但miR-638在人OS細胞增殖行為中的作用一直不明確，鑒于文獻報導(dǎo)miR-638對腫瘤的抑制作用，本實驗以miR-638為研究對象，觀察其在OS組織中的表達及對OS細胞系(MG63、U2OS)增殖的影響，為miRNA-638成為人OS新的有前景的治療靶點提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織與細胞收集中山大學腫瘤研究所2008年1月～2012年12月OS組織及癌旁組織標本64對，平均年齡21歲，其中男性42例，女性22例，收集后液氮冷凍。所有標本取得都獲得了家屬知情同意，且此項目經(jīng)附屬醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準。所有收集的標本符合OS診斷，即有典型臨床癥狀、體征、相應(yīng)影像學表現(xiàn)及病理學形態(tài)，術(shù)前未經(jīng)局部及全身治療。OS細胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)及永生化的正常骨組織細胞株NHOst購買于上海美軒公司。

1.2實驗試劑氯仿、異丙醇、無水乙醇、無酶水(用雙蒸水按1∶1 000的比例稀釋DEPC原液，振搖混勻，37 ℃過夜，高溫高壓使DEPC降解)、75%乙醇、RNAiso Reagent試劑盒(日本TaKaRa公司)、RT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)、PBS緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、miR-638 mimic、miR-638 inhibitor、mimic NC、inhibitors NC(上海吉瑪公司)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)。

1.3儀器設(shè)備高速冷凍離心機、各種量程移液器、吸頭、EP管、PCR管、NanoDrop 2000、超凈工作臺、PCR熱循環(huán)儀、Thermal Cycler Dice Real Time System II 、6孔板和96孔板、細胞計數(shù)板、細胞培養(yǎng)箱、超速離心機、生物安全柜、倒置顯微鏡、酶標儀、-80 ℃超低溫冰箱。

1.4實驗分組定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組織中miR-638相對表達量分組：實驗組為64組人骨肉瘤組織/人骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株；對照組為64組對應(yīng)的非癌組織/永生化的正常骨細胞株NHOst。

細胞增殖檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)實驗分組：實驗組為分別轉(zhuǎn)染miRNA-638 mimic與miRNA-638 inhibitor的MG63、U2OS細胞株；陰性對照組為分別轉(zhuǎn)染mimic NC與inhibitor NC的MG63、U2OS細胞株。

平板克隆形成試驗分組：實驗組為轉(zhuǎn)染 miRNA-638 mimic的MG63、U2OS細胞株；陰性對照組未轉(zhuǎn)染的MG63、U2OS細胞株。

1.5人OS細胞的培養(yǎng)將標本于37 ℃ 水浴溶化呈懸液，于培養(yǎng)基內(nèi)混勻,離心后棄上清,將細胞沉淀用1.0 mL培養(yǎng)基混勻加入裝有14.0 mL培養(yǎng)基質(zhì)的75 cm2方瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合至80%～90%時開始傳代，繼續(xù)放置于飽和濕度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天更換培養(yǎng)基，之后根據(jù)細胞生長情況繼續(xù)給予傳代。

1.6 qRT-PCR檢測各組織中miR-638的表達按RNAiso Reagent說明書分別提取實驗組與對照組的總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度。應(yīng)用PrimeScript RT試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)在Applied Biosystems 2700熱循環(huán)儀上進行。按說明書操作，配置反應(yīng)液的所有操作均在冰上進行。反應(yīng)體系如表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s,4 ℃(注：10 μL反應(yīng)體系最多使用500 ng的Total RNA)。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品按照適當?shù)谋壤♂尯?，?yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，在Thermal Cycler Dice Real Time System II 擴增儀上進行PCR反應(yīng)，實驗流程按說明書進行，反應(yīng)體系如表2。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，以U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。根據(jù)PCR所得的CT值運用2-△△CT法計算miRNA-638的相對表達量。

表1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系

表2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系

1.7 CCK-8實驗及平板克隆形成實驗

1.7.1 細胞鋪板 以MG63細胞為例。取處于對數(shù)生長期且細胞匯合度約為80%的MG63細胞，去除培養(yǎng)基后，經(jīng)胰蛋白酶溶液消化呈懸浮狀態(tài)時，終止消化并輕柔吹打使細胞全部脫壁。將細胞懸液置入10 mL PE管中，在37 ℃恒溫下，離心后去上清液，繼續(xù)加入培養(yǎng)液，輕柔吹吸使細胞懸浮。分別吸取10 μL細胞懸液加入相應(yīng)細胞計數(shù)板，計算懸液濃度以及吸取3 000個細胞所需懸液體積。繼續(xù)輕柔吹吸離心管中懸液50次后，加入相應(yīng)體積細胞懸液至96孔板的6組中，然后每孔添加培養(yǎng)液至150 μL，周圍孔取100 μL PBS溶液填充，鋪完后 “十字”搖勻。每次鋪4塊96孔板，分別用作24 h、48 h、72 h和96 h的CCK-8實驗，每隔48 h換液。U2OS細胞鋪板步驟同MG63細胞。

1.7.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。

1.7.3 CCK-8實驗 轉(zhuǎn)染完成后，在細胞箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h取一塊孔板，在每一孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶標儀中震動10 min，用490 nm波長測定OD值，以630 nm為參考波長。

1.7.4 平板克隆形成實驗 取培養(yǎng)于10%胎牛血清RPMI培養(yǎng)基中的對指數(shù)生長期的MG63、U2OS細胞以及轉(zhuǎn)染miR-638 mimic的MG63、U2OS細胞，分別制成每毫升200個細胞的細胞懸液。取MG63/MG63-mimic細胞系液2 mL,U2OS/U2OS-mimic細胞懸液取4 mL,分別接種于六孔板的每一個孔中，使細胞分散均勻。六孔板置于37 ℃ 、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)。甲醇固定15 min后空氣干燥。用0.1%結(jié)晶紫進行染色20 min，倒置顯微鏡觀察超過30個細胞的菌落數(shù)。

1.8數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義?；蛳鄬Ρ磉_量用2-△△CT法計算。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR實驗檢測骨肉瘤組織、癌旁組織、骨肉瘤細胞及正常人骨細胞中成熟的miR-638的表達水平qRT-PCR檢測了64組骨肉瘤組織中成熟的miR-638的表達水平。結(jié)果顯示與相應(yīng)的非癌組織(對照組)相比有36組(56.25%)骨肉瘤組織中miR-638的表達是下調(diào)的(P<0.001,圖1)。

圖1 64組骨肉瘤及癌旁組織中成熟的miR-638的表達水平 與對照組比較，*：P<0.001

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分別檢測骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株和永生化的正常骨組織細胞株NHOst(對照組)中的miR-638的表達水平。結(jié)果顯示在骨肉瘤細胞株中miR-638的表達明顯下調(diào)(P<0.001，圖2)。

圖2 熒光定量PCR檢測骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株與人正常骨組織細胞株NHOst中miR-638的表達與對照組NHOst比較，*:P<0.001

2.2 CCK-8實驗檢測miR-638的高表達或低表達對骨肉瘤MG63及U2OS細胞的增殖能力的影響

結(jié)果顯示miR-638高表達能顯著降低MG63和U2OS細胞的增殖能力(P<0.05,見圖3)。抑制miR-638表達顯著促進了MG63和U2OS細胞的生長(P<0.05,圖4)。

2.3平板克隆實驗檢測高表達miR-638對骨肉瘤MG63及U2OS細胞的集落形成能力的影響結(jié)果顯示miR-638的高表達能抑制人骨肉瘤MG63及U2OS細胞的增殖功能(P<0.05,圖5、圖6)。

圖3 高表達miRNA-638抑制人OS MG63與U20S細胞增殖與對照組比較，*:P<0.05

圖4 抑制miR-638的表達促進人OS MG63與U20S細胞增殖與對照組比較，*:P<0.05

圖5 高表達骨肉瘤U2OS細胞中的miR-638會抑制其集落形成能力與對照組比較，*:P<0.05

圖6 高表達骨肉瘤MG63細胞中的miR-638會抑制其集落形成能力與對照組比較，*:P<0.05

3 討 論

研究表明，OS的病因極其復(fù)雜，同時還具有龐大基因組的不穩(wěn)定性及高度異常的核型，多個染色體拷貝數(shù)的增加或者丟失會使得OS中多條染色體發(fā)生改變[3]。OS的治療包括手術(shù)、術(shù)前和術(shù)后的標準化療或放療，5年生存率為60%～70%；晚期診斷、轉(zhuǎn)移性及復(fù)發(fā)性的腫瘤患者生存率更低(20%)，而其中位生存期僅為23個月[4]。為了監(jiān)測OS的發(fā)展、改善OS患者的預(yù)后，探索一種能用于OS早期診斷的更方便、微創(chuàng)的方式，尋找新的治療靶點成為OS診斷及治療上亟需解決的問題。

深入研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA都在細胞增殖、凋亡、分化、運動等過程中起著重要調(diào)控作用。自20年前發(fā)現(xiàn)他們以來，生物信息學研究已經(jīng)確定了超過1 000種的miRNA可參與人類基因組中一半基因的調(diào)節(jié)，每個miRNA可能控制數(shù)百個人類基因的轉(zhuǎn)錄[5]。超過50%的miRNA基因位于染色體脆弱位點，它的缺失或擴增對人類癌癥有重要影響，提示miRNA直接參與腫瘤的發(fā)生過程[6]。2002年Calin等人發(fā)現(xiàn) miRNA-15a和miRNA-16-1可能與慢性淋巴細胞白血病的發(fā)病密切相關(guān)[7]。這一重要發(fā)現(xiàn)公布以后，人們逐漸在大量的腫瘤細胞系和臨床腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了異常表達的miRNA，隨后在動物模型實驗也證實了miRNA對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要作用[8]。

Tan等[9]人的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌進展中，miR-638 是最重要的因子之一，miR-638 強制性表達可顯著降低細胞增殖率及三陰乳腺癌細胞侵襲能力。在Ma的研究中[10]發(fā)現(xiàn)，大腸癌標本中的miR-638由于腫瘤分級不同而表達不同。miR-638 抑制 Sox2的表達，同時，miR-638表達水平與在人結(jié)直腸癌組織中 Sox2 m RNA 表達水平呈負相關(guān)，這些可以說明miR-638可以作為一種新的結(jié)直腸癌侵襲相關(guān)腫瘤抑制因子。

鑒于miR-638在前期研究中“抑癌基因”的作用，本實驗采用實時熒光定量PCR的方法檢測64組人OS組織及相應(yīng)的非癌組織中成熟的miR-638的表達水平，結(jié)果顯示與相應(yīng)的非癌組織相比有36組(56.25%)OS組織中miR-638的表達是下調(diào)的，推測miR-638的表達下調(diào)可能對人OS的發(fā)生發(fā)展有促進作用，而并不能說明miRNA-638的表達與OS患者的生存率有顯著相關(guān)性，同時miR-638的表達與性別、年齡，腫瘤的位置、大小、分期與分級也沒有顯著的聯(lián)系。在CCK-8實驗中，與相應(yīng)的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-638 mimic的實驗組細胞增殖速度明顯減慢，而轉(zhuǎn)染miR-638 inhibitor的實驗組細胞增殖速度明顯加快。這與之前研究miRNA-638的“抑癌基因”作用一致。

值得提出的是，在轉(zhuǎn)染mimic與inhibitor的實驗組中，隨著實驗時間的推移,其增殖速度有一定的加快或減慢。主要考慮miR-638 mimic及inhibitor為瞬轉(zhuǎn),其mimic及inhibitor隨著時間推移在細胞中逐漸降解，導(dǎo)致細胞增殖速度有一定變化。另外，CCK-8實驗作為檢測細胞存活與增殖的方法之一，其檢測原理同常規(guī)的MTT略有差異，試劑生成物具有高度水溶性，所以簡便了實驗步驟也提高了實驗的敏感性。有文獻比較過兩者的靈敏度和準確性，CCK-8法操作更簡便,靈敏度高,準確性和重復(fù)性更好,是一種優(yōu)于MTT法的檢測細胞增殖活性的方法[11]。

本研究表明，在人OS組織中，miR-638呈低表達；miR-638的高表達顯著抑制人OS MG63及U2OS的細胞增殖，而下調(diào)miR-638的表達能顯著促進其增殖，為miRNA-638成為人OS新的有前景的治療靶點提供了一定的理論依據(jù)。但還需繼續(xù)進行體內(nèi)荷瘤動物實驗，及進一步研究miR-638抑制人OS細胞增殖的作用機制，為基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床生物治療打下基礎(chǔ)。

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EffectofMicroRNA-638expressionontheproliferationofhumanosteosarcomacells

CHEN Bin,FU Yong,XIA Xue,et al

(DepartmentofOrthopaedics，theSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveTo investigate the role of miR-638 in biological behavior of osteosarcoma cell.MethodsThe expression of miR-638 in osteosarcoma MG63 and U2OS cells was detected by RT-PCR.miRNA-638 mimics (inhibhors) were transfected into MG63 and U2OS by using LipofectamineTM2000 to upregulate(deregulate) the expression of miRNA-638.The absorbance value in 24 h,48 h,96 h and 72 h following the transfection was detected by CCK-8.And colony forming assay was used to detect colony counts over 30 cells after 2 weeks.ResultsMiR-638 expressed in each group.The expression of miR-638 was down regulated (P<0.001) in the 36 groups (56.25%) compared with the corresponding non cancerous tissues.Mir-638 expression can significantly reduce the MG63 and U2OS cells growth rate (P<0.05),on the contrary,the suppression of miR-638 expression significantly promoted the growth of cells of U2OS and MG63 (P<0.05).ConclusionsHigh expression of miR-638 significantly inhibits the proliferation of osteosarcoma cells.MiR-638 may become a new target for the early diagnosis and treatment of osteosarcoma.

osteosarcoma; MG63; U2OS; MicroRNA-638; cell proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.004

2017-02-10；

2017-06-18

湖南省教育廳資助項目(15C1215).

*通訊作者，E-mail:wxx1024@163.com.

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蔣湘蓮)