高鴻蒙

摘要：本研究采用堿性蛋白酶水解莜麥蛋白，制備分子量在5000D以下的莜麥多肽。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出堿性蛋白酶在溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度為3%的條件下，酶解2h，其水解度（DH）可達(dá)71.96%。

關(guān)鍵詞：莜麥；酶解；多肽

1.實(shí)驗(yàn)方法

將莜麥種子用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥2-4h。取干燥過(guò)的莜麥細(xì)粉50g，加100ml正己烷于50℃水浴鍋中抽提6-8h，離心，沉淀，60℃干燥，得脫脂莜麥粉。取50g脫脂莜麥粉，加100ml的70%乙醇密閉抽提1h，離心，沉淀經(jīng)60℃干燥脫乙醇得莜麥粗蛋白。用凱氏定氮法測(cè)定莜麥粗蛋白粉中蛋白的含量。

將準(zhǔn)備酶解的樣品100℃煮沸10min。用堿性蛋白酶水解莜麥蛋白制備莜麥多肽。酶解反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間時(shí)，立即放入100℃沸水中滅活10min。滅酶后取1ml酶解液測(cè)定酶解反應(yīng)的水解度。用檸檬酸調(diào)節(jié)酶解液的pH值到 4.3-4.5，冷藏室靜置20min，8000rpm離心15分鐘，去除非水解蛋白，得到的上清液即為莜麥多肽液。

用SDS-PAGE法，檢測(cè)分子量5000D以下的多肽，以胰島素為分子量參照物（5700D）。

用中空纖維超濾柱分離分子量小于5000D的多肽，將多肽液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（70℃—80℃，0.07Mpa）中濃縮，在60℃烘箱烘干得到莜麥多肽粉。

1.1 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.1.1莜麥中脂肪含量的測(cè)定：脫脂粉常壓烘干法。取一定量的莜麥粉用正己烷脫脂，將脫脂粉干燥，計(jì)算差值，可算出脂肪含量。

1.1.2莜麥蛋白含量測(cè)定：凱氏定氮法和雙縮脲法。

1.1.3水解度的測(cè)定：

1.1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取12 支試管分成兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的標(biāo)準(zhǔn)牛血清溶液，用水補(bǔ)足到1ml，然后各加入4ml雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫放置30min，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。取兩組測(cè)定的平均值，以牛血清白蛋白的含量為橫坐標(biāo)，光吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)。（見圖1）

1.1.3.2水解度的測(cè)定：取2ml加熱滅活的酶解液，加入等體積10%的三氯乙酸（TCA），振蕩5min，4000rpm/min離心15min，取1ml上清液，加入4ml雙縮脲試劑，靜置30min，在540nm測(cè)定光吸收值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得蛋白含量。以計(jì)算公式可得水解度（DH）。

計(jì)算公式：DH%=（N2-N1）/（N0-N1）×100%

其中：

N0——?jiǎng)P氏定氮所測(cè)莜麥粗蛋白粉中的蛋白含量（mg）

N1——反應(yīng)前蛋白液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

N2——反應(yīng)后酶解液中10%TCA可溶性蛋白（mg）

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 脂肪含量測(cè)定結(jié)果

脂肪平均含量為3.8%。

2.2 蛋白含量測(cè)定結(jié)果

未脫脂細(xì)粉中蛋白平均含量為11.2%，脫脂細(xì)粉中蛋白平均含量為15.68%。

2.3 單因素的確定

2.3.1 溫度的確定：酶反應(yīng)條件為：pH11，底物濃度3%，酶用量5‰，酶解時(shí)間2h，試驗(yàn)不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)溫度在45℃時(shí)，DH較大。

2.3.2 pH的確定：酶反應(yīng)條件為：溫度45℃，底物濃度3%，酶用量5‰，酶解時(shí)間2h，試驗(yàn)不同pH對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)pH在10時(shí)，DH較大。

2.3.3酶用量的確定：酶反應(yīng)條件為：溫度45℃，底物濃度3%，pH11，酶解時(shí)間2h，試驗(yàn)不同酶用量對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨著酶加量的增加，DH提高，當(dāng)酶加量達(dá)到3‰時(shí)再增加酶量，DH值增加不明顯。

2.3.4底物濃度的確定：反應(yīng)條件為：溫度45℃，pH11，酶用量5‰，酶解時(shí)間2h，試驗(yàn)不同底物濃度對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨著底物量的增加，DH值提高。

2.4 最佳酶解條件的確定

以溫度、pH值、酶用量、底物濃度為四因素各取三水平。以水解度為指標(biāo)，按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酶的反應(yīng)條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，水解時(shí)間2h，水解度達(dá)到最大值71.96%，即A3B1C3D2。各因素對(duì)水解度的影響依次為：D>B>A>C，其中底物濃度和溫度對(duì)水解度的影響較大。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行級(jí)差分析發(fā)現(xiàn)，最佳條件為A3B3C3D2。即溫度55℃，pH11，酶用量3‰，底物濃度3%。綜合分析，取最佳反應(yīng)條件：A3B1C3D2。即：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%。堿性蛋白酶水解莜麥蛋白水解度結(jié)果見表1。

2.5 酶解時(shí)間的確定

酶反應(yīng)條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，試驗(yàn)不同水解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DH值不斷增加，在水解達(dá)到2h以后，DH值增加不明顯，開始變緩。

3.結(jié)果分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明可用堿性蛋白酶對(duì)莜麥蛋白進(jìn)行有效水解，產(chǎn)生分子量小于5000D的多肽產(chǎn)品。通過(guò)正交試驗(yàn)可獲得減性蛋白酶水解莜麥蛋白制備莜麥多肽的最佳條件為：溫度55℃，pH9，酶用量5‰，底物濃度3%，酶解時(shí)間2h。在此條件下水解度為71.96%。endprint