林久茂 李瓊瑜 嚴兆坤 賴子君 靳祎祎 彭 軍

(1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福州，350122； 2 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福州，350122)

中藥研究

白花蛇舌草對大腸癌耐藥細胞microRNAs表達的影響

林久茂1,2李瓊瑜1嚴兆坤1賴子君1靳祎祎1彭 軍1,2

(1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福州，350122； 2 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福州，350122)

目的：探討白花蛇舌草(Hedyotic Diffusa Wilid，HDW)對大腸癌5-FU耐藥細胞miRNAs表達的調控作用，進一步揭示其逆轉大腸癌多藥耐藥(Multidrug Resistance，MDR)作用機制。方法：通過體外培養(yǎng)HCT-8/5-FU細胞，經HDW處理，采用MTT檢測細胞活力、倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、microRNA(miRNA)表達譜芯片分析、QPCR驗證差異miRNA表達、GO及Pathway分析預測差異miRNA調控的信號通路。結果：HDW可顯著抑制大腸癌HCT-8/5-FU耐藥細胞的活力，降低細胞密度；HDW調控57個miRNA差異表達，其中上調23個，下調34個；QPCR驗證HDW上調miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p的表達，下調miR-4454、miR-4443、miR-483-5p的表達；信號通路預測顯示HDW可調控PI3K/Akt、TGF-β/Smad、MAPK、P53、Wnt、JAK-STAT等多條與細胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡有關的信號通路。結論：HDW對大腸癌5-FU耐藥細胞HCT-8/5-FU具有顯著的抑制作用，通過調控miRNAs表達是其逆轉大腸癌耐藥的作用機制之一。

白花蛇舌草；大腸癌；microRNA；耐藥

大腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，據美國癌癥協(xié)會調查研究報道，每年全球逾60萬人死于CRC，具有高發(fā)病率和死亡率，嚴重危害人類健康[1]?；熓侵委烠RC術后復發(fā)及失去手術機會或轉移性CRC的主要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是臨床上腸癌化療的基礎用藥，常導致CRC細胞產生5-FU耐藥性，進而產生繼發(fā)性多藥耐藥，是導致5-FU治療失敗的主要因素。腫瘤細胞MDR產生的機制非常復雜，與細胞內藥物的蓄積、藥物在細胞的分布及MDR基因過表達密切相關，越來越多的研究表明腫瘤耐藥與細胞相關蛋白及信號通路有關，并受到相關信號通路的調控。microRNA(miRNA)表觀遺傳學調控與腫瘤MDR密切相關[2]。miRNA是一類分布廣泛的由約19～24個核苷酸組成的一類內源性非編碼(Non-protein-coding)單鏈RNA[3]。miRNA在轉錄后水平通過結合和降解耐藥相關靶基因的mRNA抑制其翻譯，從而在腫瘤的耐藥中也扮演了重要的角色[4]。

白花蛇舌草(HedyotisDiffusaWilld，HDW)性寒，味甘苦，歸心、肝、大腸經，具有清熱解毒、消癰散結的功效[5]。白花蛇舌草廣泛應用于中醫(yī)臨床抗CRC的治療，具有顯著療效。研究表明白花蛇舌草對多種惡性腫瘤療效確切[6-8]，前期證實白花蛇舌草可通過多條途徑誘導CRC細胞凋亡[9]、抑制CRC細胞增殖[10-12]、抑制CRC血管新生[13]、逆轉CRC MDR的作用[14]。但白花蛇舌草逆轉腫瘤MDR的作用機制仍為闡明。為進一步揭示白花蛇舌草的作用機制，對其干預CRC 5-FU耐藥細胞后的miRNAs表達進行芯片篩選，并結合生物信息學方法分析歸納，以期為其調控miRNA抑制CRC耐藥細胞生長提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；HDW(福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院)。

1.1.2 試劑與儀器 無水乙醇(天津福晨化學工業(yè)有限公司生產)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司)；RNAiso Plus、SYBR PrimeScipt miRNA RT-PCR試劑盒(中國寶生物工程有限公司生產)；酶標儀(ELX800，美國BioTek公司)；超微量核酸分析儀(ND-2000C，美國Thermo公司)；實時熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國life公司)；倒置顯微鏡(DMI4000B，德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 HDW提取物的制備 HDW(0.1 kg)用85%乙醇1 L回流提取2次，合并后過濾，濃縮濾液，真空干燥成粉末。HDW提取物粉末用PBS配制成200 mg/mL溶液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｓ们安捎弥睆?.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2 細胞培養(yǎng) HCT-8/5-FU細胞用含5FU(15 μg/mL)的10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長匯合度達90%后，去除培養(yǎng)液加入0.25%含EDTA胰酶進行消化，細胞變圓脫落后加入5倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液終止消化，收集單細胞懸液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，HCT-8/5-FU細胞細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸后進行傳代或接種。

1.2.3 細胞活力分析 取對數生長期HCT-8/5-FU消化計數，按1.0×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。細胞生長至50%～60%時加入終濃度為0.5～2.0 mg/mL HDW，對照組加等體積的PBS。HDW干預24 h后，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄MTT，每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩混勻后，ELX800酶標儀(波長570 nm)測定各孔吸光度值(即A值)，細胞活力(%)=(HDW干預組A值/對照組A值)×100%；細胞抑制率(%)=對照組細胞活力-藥物組細胞活力。

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察 取對數期生長的HCT-8/5Fu消化計數，按5×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞生長至50%～60%時加入終濃度為0.5～2.0 mg/mL HDW。以不加藥細胞作為對照組(加等體積的PBS)，用DMI4000B倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)的觀察并拍照。

1.2.5 miRNA芯片分析 取對數生長期HCT-8/5Fu細胞，按照1.0×106/孔的密度接種于6孔板中。分為對照組和HDW干預組(1.0 mg/mL)，細胞經藥物干預24 h后，棄上清，用PBS清洗，每孔加RNAiso Plus 1 mL提取總小RNA，ND-2000 C超微量核酸分析儀測定RNA濃度和純度并芯片分析。本文選取上海欣景公司的miRNA表達譜芯片進行實驗。芯片探針版本為HmiOA 4.1，Human miRNA探針有1 087條，共涵蓋人源相關miRNA基因1090個。

1.2.6 定量PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction，QPCR)驗證 取對數生長期的HCT-8/5-FU細胞，以5×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，2 mL/孔，培養(yǎng)過夜后加入終濃度0.5 mg/mL HDW干預24 h。按上述方法進行miRNA提取。取500 ng RNA進行Poly(A)加尾反應?；靹蚝?，37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。向反應液中添加無RNA酶的去離子水至100 μL。QPCR反應體系20 μL，即：cDNA溶液2 μL，SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μL，Uni-miR qPCR Primer(10 μM)0.8 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，6 μL dH2O。引物:miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p、miR-4454、miR-4443、miR-483-5p、U6由引物由中國寶生物工程(大連)有限公司提供?；靹蚝螅?500Fast QPCR儀進行miRNA表達分析。

1.2.7 Gene Ontology(GO)及pathway分析 采用Cytoscape及其插件BINGO(http://www.Cytoscape.Org/)對miRNA靶基因進行GO分析。GO分析包括了基因參與的生物過程(Biological Process)、發(fā)揮的分子功能(Molecular Function)、所處的細胞位置(Cellular Component)等3個方面的功能信息，并用BiNGO進行GO顯著性分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將靶基因向KEGG pathway數據庫映射，使用分析軟件DAVID進行分析并根據統(tǒng)計檢驗方法(P-value)選顯著富集的分類。通過Fisher Exact Test計算分析表達差異miRNAs調控的信號轉導通路。

2 結果

2.1 HDW對CRC耐藥細胞HCT-8/5FU生長的影響 HDW對人結腸癌5-FU耐藥細胞HCT-8/5-FU生長具有顯著的抑制作用。隨HDW濃度的增加，HCT-8/5-FU細胞的活力逐漸降低，細胞的生長受到抑制，呈劑量依賴效應。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 HDW對HCT-8/5-FU細胞生長的影響

注：與HDW-0 mg/mL組比較，*P<0.05

2.2 HDW對CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU形態(tài)的影響 HCT-8/5-FU細胞經不同濃度HDW干預后，與對照組比較，HCT-8/5-FU細胞密度具有不同程度減少。當EEHDW濃度達到1 mg/mL時，HCT-8/5-FU細胞密度明顯減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)一些漂浮的脫落細胞；當EEHDW濃度達到2 mg/mL時，細胞密度進一步減少，細胞變圓、變小，大部分細胞脫落死亡。該結果進一步表明了HDW可顯著抑制CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU的生長，呈明顯的劑量效應。見圖1。

2.3 HDW對CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU miRNA表達的影響 miRNAs表達譜芯片分析，結果發(fā)現(xiàn)HDW對CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU的miRNA表達具有調控作用，共有57個miRNA發(fā)生了顯著的表達變化，HDW上調23個miRNA表達，下調34個miRNA表達。進一步采用QPCR驗證，結果證實HDW上調miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p等表達，下調miR-4454、miR-4443、miR-483-5p等表達，與芯片結果相符。見圖2。

2.4 通路分析預測結果 采用miRNA靶標基因數據庫進行miRNA靶基因預測，結果顯示，預測的靶基因有1 775個(略)。針對以上1775個靶基因，將其分別投射至GO的3個功能上，結果顯示預測的靶基因分別富集于腫瘤細胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡有關的信號通路。在此基礎上，進一步對基因進行細胞信號通路富集分析。HCT-8/5-FU細胞經HDW處理前后結果顯示，在經典通路數據庫KEGG中miRNA顯著富集于PI3K/Akt通路、TGF-β/Smad通路、MAPK通路、P53通路、Wnt通路、JAK-STAT通路等許多重要的生物途徑包括細胞耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡等，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 HDW對HCT-8/5Fu細胞形態(tài)的影響

注：A.HDW-0 mg/mL組；B.HDW-0.5 mg/mL組；C.HDW-1.0 mg/mL組；D.HDW-2.0 mg/mL組

圖2 QPCR驗證HDW對HCT-8/5FU細胞miRNA表達的影響

注：與HDW-0 mg/mL組比較，*P<0.05

表2 miRNA預測靶基因的通路富集分析

3 討論

腫瘤細胞MDR產生涉及到多條信號通路的異常激活，以及下游耐藥基因、藥物代謝酶以及凋亡調控因子的表達異常。近年來的研究表明miRNA等表觀遺傳學調控機制在MDR相關信號通路活化及相關基因表達的調控中發(fā)揮了重要作用[15-16]。前期實驗中，也發(fā)現(xiàn)HDW可以增加CRC HCT-8/5-FU細胞對5FU的敏感性，通過下調ABC轉運蛋白家族成員ABCG2，從而增加5-FU的蓄積[14]，然而具體的機制尚未完全闡明。為了進一步揭示HDW抑制耐藥CRC細胞生長的機制，首先通過MTT實驗觀察HDW對HCT-8/5-FU耐藥細胞活力的影響，結果表明HDW對HCT-8/5-FU細胞具有顯著抑制作用；并從miRNA表觀遺傳學調控進一步探討HDW抑制CRC耐藥細胞的作用機制，采用miRNA表達譜芯片分析，結果發(fā)現(xiàn)HDW對HCT-8/5-FU細胞的miRNA表達具有顯著的調控作用。為進一步驗證miRNA表達譜芯片結果的正確性和可靠性，對部分差異表達的miRNAs(miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p、miR-4454、miR-4443、miR-483-5p)進行Q-PCR驗證，結果表明HDW對miRNAs表達的調控與芯片結果相一致。通過生物信息學的方法，利用靶基因預測軟件對miRNA靶基因進行分析，并進一步結合GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)HDW對HCT-8/5FU細胞包括PI3K/Akt、TGF-β/Smad、MAPK、p53、Wnt和JAK-STAT等許多重要的細胞信號轉導通路均有調控作用，涉及細胞的耐藥、遷移、侵襲、增殖、凋亡等多個方面，提示HDW可通過多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮其抑制CRC作用及逆轉CRC耐藥作用。

總之，本文證實了HDW能通過抑制CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU的活力發(fā)揮抑制細胞增殖的作用；HDW對CRC耐藥細胞HCT-8/5-FU的miRNAs表達具有顯著的調控作用，提示HDW通過調控miRNA表達對其相關信號通路發(fā)揮調控作用，進一步為臨床應用HDW治療CRC提供依據。但本研究涉及HDW調控耐藥細胞的miRNAs為首次報道，其與藥物敏感性的相關性還有待進一步深入探討。

[1]Siegel R，Miller K，Ahmedin Jemal DVM.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66(1):7-30.

[2]Magee P，Shi L，Garofalo M.Role of microRNAs in chemoresistance[J].Ann Transl Med，2015，3(21):332.

[3]Dehghanzadeh R，Jadidi-Niaragh F，Gharibi T，et al.MicroRNA-induced drug resistance in gastric cancer[J].Biomed Pharmacother，2015，74(8):191-199.

[4]Acunzo M，Romano G，Wernicke D，et al.MicroRNA and cancer-a brief overview[J].Adv Biol Regul，2015，57(1):1-9.

[5]Chen R，He J，Tong X，et al.The hedyotis diffusa willd.(Rubiaceae):a review on phytochemistry，pharmacology，quality control and pharmacokinetics[J].Molecules，2016，21(6):710.

[6]Li YL，Zhang J，Min D，et al.Anticancer effects of 1,3-Dihydroxy-2-methylanthraquinone and the ethyl acetate fraction of hedyotis diffusa willd against HepG2 carcinoma cells mediated via apoptosis[J].Plos One，2016，11(4):e0151502.

[7]Zhang Y，Xie RF，Xiao QG，et al.Hedyotis diffusa willd extract inhibits the growth of human glioblastoma cells by inducing mitochondrial apoptosis via AKT/ERK pathways[J].J Ethnopharmacol，2014，158(12):404-411.

[8]Wang N，Li DY，Niu HY，et al.2-hydroxy-3-methylanthraquinone from hedyotis diffusa willd induces apoptosis in human leukemic U937 cells through modulation of MAPK pathways[J].Arch Pharm Res，2013，36(6):752-758.

[9]Lin JM，Chen YQ，Wei LH，et al.Hedyotis difFusa willd extract induces apoptosis via activation of the mitochondrion-dependent pathway in human colon carcinoma cells[J].Int J Oncol，2010，37(5):1331-1338.

[10]Cai QY，Lin JM，Wei LH，et al.Hedyotis difFusa willd inhibits colorectal cancer growth in Vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway[J].Int J Mol Sci，2012，13(5):6117-6128.

[11]Lin MH，Lin JM，Wei LH，et al.Hedyotis difFusa willd extract inhibits HT29 cell proliferation via cell cycle arrest[J].Exp Ther Med，2012，4(2):307-310.

[12]Lin JM，Wei LH，Xu W，et al.Effect of hedyotis difFusa willd extract on tumor angiogenesis[J].Mol Med Rep，2011，4(6):1283-1288.

[13]Lin JM，Wei LH，Shen AL，et al.Hedyotis difFusa willd extract suppresses sonic hedgehog signaling leading to the inhibition of colorectal cancer angiogenesis[J].Int J Oncol，2013，42(2):651-656.

[14]Li Q，Wang X，Shen A，et al.Hedyotis diffusa willd overcomes 5-fluorouracil resistance in human colorectal cancer HCT-8/5-FU cells by downregulating the expression of P-glycoprotein and ATP-binding casette subfamily G member 2[J].Exp Ther Med，2015，10(5):1845-1850.

[15]Li Q，Liang X，Wang Y，et al.miR-139-5p inhibits the epithelial-mesenchymal transition and enhances the chemotherapeutic sensitivity of colorectal cancer cells by downregulating BCL2[J].Sci Rep，2016，6(5):27157.

[16]Luo W，Lin Y，Meng S，et al.miRNA-296-3p modulates chemosensitivity of lung cancer cells by targeting CX3CR1[J].Am J Transl Res，2016，8(4):1848-1856.

EffectsofHerbaHedyotisDiffusaeonExpressionofmicroRNAsinColorectalCancerDrugResistantCells

Lin Jiumao1,2，Li Qiongyu1，Yan Zhaokun1，Lai Zijun1，Jin Yiyi1，Peng Jun1,2

(1AcademyofIntegrativeMedicine，F(xiàn)ujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou350122，China;2FujianKeyLaboratoryofIntegrativeMedicineonGeriatrics，F(xiàn)uzhou350122，China)

Objective:To study the regulatory effect of Herba Hedyotis Diffusae on multidrug-resistance (MDR)-related microRNAs (miRNAs) in colorectal cancer，and further explore the underlying mechanisms of its MDR reversion.MethodsThe signal pathway regulated by miRNA was forecasted by MTT assays，morphology observation，miRNA array analysis，QPCR validation，GO and Pathway analysis through treatment of HDW in HCT-8/5-FU cells.ResultsHDW significantly inhibited colorectal cell viability and decreased density of HCT-8/5-FU cells.There were 23 up-regulated and 34 down-regulated in 57 miRNA differential expression after HDW treatment; and QPCR verification confirmed that HDW increased expression of miR-92b-5p，miR-1247-3p and miR-4800-5p and decreased expression of miR-4454，miR-4443，miR-483-5p; and the signal pathway prediction showed that HDW could control PI3K/Akt，TGF-β/Smad，MAPK，P53，Wnt and JAK-STAT signaling pathways regulating MDR，migration，invasion，proliferation and apoptosis.ConclusionHDW can remarkably suppress proliferation in HCT-8/5-FU cells，and it is one of the mechanisms to reverse the drug resistance of colorectal cancer by regulating miRNAs expression.

Herba Hedyotis Diffusae; Colorectal cancer; microRNA; Drug resistance

教育部博士點基金博導類項目(20133519110003);陳可冀中西醫(yī)結合發(fā)展基金項目(CKJ2015007，CKJ2014013)

林久茂(1975.02—)，男，博士，副研究員，研究方向：中西醫(yī)結合抗腫瘤的機制研究，E-mail：jiumaolin@hotmail.com

彭軍(1969.11—)，男，博士，研究員，研究方向：生化與分子生物學，E-mail：pjunlab@hotmail.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.052

(2016-08-10收稿 責任編輯：張文婷)