韓 波 黃 維 謝 欣 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

有毒烏頭類中藥的毒效網(wǎng)絡整合分析:思路與方法

韓 波 黃 維 謝 欣 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

中藥的有效性和安全性不僅是中醫(yī)藥傳承和發(fā)展的堅實基礎,也是中醫(yī)藥服務于世界人民健康事業(yè)的根本前提。因此多學科交叉融合、整合分析中藥毒效的物質基礎、作用原理、毒效關系,揭示“有故無殞、中病即止”的科學內涵,是中藥進入國際醫(yī)藥市場亟待解決的關鍵問題。利用復雜生物網(wǎng)絡研究中藥系統(tǒng)藥理學和系統(tǒng)毒理學,構建可靠的中藥藥效物質作用靶標相關的分子效應和毒理學性質網(wǎng)絡,反映特定疾病狀態(tài)的相關生物實體的分子網(wǎng)絡及毒性機制,整合效應物質作用靶標網(wǎng)絡與疾病生物網(wǎng)絡,通過網(wǎng)絡拓撲學和動力學等方法分析“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡和“藥物-靶點-活性/毒性”網(wǎng)絡中有效物質與疾病、成分與毒性的相互作用關系,檢識出復雜網(wǎng)絡模型中的靶點組合、通路組合、子網(wǎng)組合、藥物組合等,大大提高了中藥復雜藥效物質的研究效率。作者主要基于其研究團隊近年來開展的烏頭類中藥研究工作,重點介紹開展有毒中藥的毒效網(wǎng)絡整合分析研究的思路和方法。

有毒中藥;烏頭類中藥;毒效網(wǎng)絡;系統(tǒng)毒理學;網(wǎng)絡藥理學

安全性和有效性是藥物必備的核心要素,換言之即藥品的“毒”與“效”是藥品發(fā)現(xiàn)、研發(fā)和應用的根本。中醫(yī)藥對中藥“毒”與“效”的認識源遠流長,是中華民族在長期與疾病作斗爭的醫(yī)療實踐和現(xiàn)代藥理毒理研究過程中,逐漸形成的知識和技術體系。繼《吳普本草》最早于藥品下標注“毒性”后,歷代本草著作在其各藥物條目下,通常有“有毒”或“無毒”的記載,或按大毒、有毒、小毒或微毒以標注其毒性的大小,以保證用藥安全。目前,有毒中藥是指藥性峻猛,對機體有毒性或不良反應,安全劑量小,用之不當或藥量稍超,即可對機體產生危害的一類中藥。雖然中醫(yī)藥對有毒中藥的安全應用有獨到的認識,中醫(yī)古籍和中藥主流本草中記載了許多“毒藥”“毒性”、有毒中藥毒性分級、藥材品種、藥材品質、炮制制劑、劑量大小、給藥途徑、服藥方法、對證用藥、合理配伍、患者個體差異等方面的理論知識和臨床應用實踐,已形成中藥毒性理論和有效控制有毒中藥毒性的方法體系。但繼比利時中藥減肥事件、新加坡黃連事件、日本柴胡事件、英國千柏鼻炎片和復方蘆薈膠囊事件、馬兜鈴酸事件、魚腥草注射液事件、何首烏事件之后,中藥材熏硫、漢森制藥“檳榔入藥”、云南白藥與“烏頭堿”、同仁堂多種中成藥含重金屬等成為國內外公眾關注的熱點,中藥的安全性和有效性備受質疑[1]。

自古有云:“藥以治病,因毒為能”,“藥未有不偏者也,以偏救偏,故名曰藥”。砒霜、附子毒藥救人,人參雖補也能傷身。由此可見效與毒是辨證統(tǒng)一。有毒中藥在治療某些疑難疾病方面,效力強,取效甚捷,為歷代醫(yī)家所習用?，F(xiàn)代中醫(yī)師也常將其用于腫瘤、風濕病等疑難重癥及雜癥的治療,療效奇特。隨著精準醫(yī)學時代的到來,以及基礎生命科學新技術在中藥學科中不斷滲透融合,基于系統(tǒng)毒理學和網(wǎng)絡藥理學的研究思路及手段,融合組學技術,從而系統(tǒng)闡釋中藥的毒效關系,科學總結有毒中藥的作用規(guī)律,整合分析有毒中藥的物質基礎和作用機制,闡明有毒性中藥治療疑難重癥的毒效機制,對于實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

1 基于系統(tǒng)毒理學和網(wǎng)絡藥理學開展烏頭類中藥毒效網(wǎng)絡的整合分析的思路

系統(tǒng)毒理學是伴隨著系統(tǒng)生物學和高通量分子檢測技術而發(fā)展起來的學科,是通過整合分子、細胞、組織等不同研究層次的高通量信息,系統(tǒng)研究外源性化學物和環(huán)境應激等與機體相互作用的科學[2]。系統(tǒng)毒理學主要包括毒理組學技術及計算系統(tǒng)毒理學兩部分,而計算系統(tǒng)毒理學旨在整合毒理組學實驗數(shù)據(jù),構建多水平、多尺度的預測模型,定量評估化合物的安全性。計算系統(tǒng)毒理學雖然起步不久,但建立的靜態(tài)網(wǎng)絡分析預測、動態(tài)網(wǎng)絡模擬和有害結局路徑等研究方法,在全面解析毒理學機制、發(fā)現(xiàn)新的生物標志物及化合物安全性綜合評估等方面已表現(xiàn)出良好的應用前景[3]。其研究思路與方法,特別適合“毒性物質基礎多樣-毒作用機制復雜-增效減毒方法多種”的有毒性中藥的系統(tǒng)研究。

網(wǎng)絡藥理學是以藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性為出發(fā)點,利用復雜網(wǎng)絡模型表達和分析研究藥物-靶點-疾病的網(wǎng)絡關系。網(wǎng)絡藥理學在方法學上整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的原則不謀而合,且能夠從分子水平和系統(tǒng)層次解析中藥藥效的科學內涵。中藥網(wǎng)絡藥理學主要是評價中藥的多個靶點的協(xié)同作用對疾病相關分子網(wǎng)絡的綜合影響?；谏锓肿泳W(wǎng)絡的中藥藥理學研究路線通常包括:1)探索活性成分的作用靶標;2)明確中藥所治療疾病的相關基因,并構建疾病網(wǎng)絡;3)整合并完善藥物-靶點-疾病,闡釋中藥多成分、多靶點、多途徑、多層次的協(xié)同作用規(guī)律。

通過構建的藥物“成分-靶點-活性”網(wǎng)絡和“成分-靶點-毒性”網(wǎng)絡的整合分析,系統(tǒng)闡述有毒烏頭類中藥在臨床上“治療心力衰竭與心臟毒性”“治療風濕痹痛與神經(jīng)毒性”“治療妊娠疾病與胚胎毒性”3個層面上的系統(tǒng)作用規(guī)律,揭示毒效整合作用的科學內涵。

2 毒效網(wǎng)絡的整合分析的研究方法及關鍵技術

利用復雜生物網(wǎng)絡研究中藥系統(tǒng)藥理學和系統(tǒng)毒理學,構建可靠的中藥藥效物質作用靶標相關的分子效應和毒理學性質網(wǎng)絡,反映特定疾病狀態(tài)的相關生物實體的分子網(wǎng)絡及毒性機制,整合效應物質作用靶標網(wǎng)絡與疾病生物網(wǎng)絡,通過網(wǎng)絡拓撲學和動力學等方法分析“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡和“藥物-靶點-活性/毒性”網(wǎng)絡中有效物質與疾病、成分與毒性的相互作用關系,檢識出復雜網(wǎng)絡模型中的靶點組合、通路組合、子網(wǎng)組合、藥物組合等,最終對預測的結果進行實驗驗證。其基礎技術包括網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫檢索、藥效物質的研究、計算機虛擬計算及高通量組學數(shù)據(jù)分析等。

2.1 烏頭類中藥的藥效物質基礎研究 毛茛科(Ranuculaceae)烏頭屬(Aconitum L.)植物全世界約有300余種。烏頭屬植物雖然具有很強地毒性,但由于其顯著的藥理作用,越來越受到國內外的廣泛關注?！吨腥A人民共和國藥典》所收錄的烏頭屬中藥主要有川烏、草烏及附子,具有止痛、抗炎、局部麻醉、強心、退熱等作用,臨床上可用于治療風濕性關節(jié)炎、跌打損傷、神經(jīng)性疼痛、休克等[4-6]。

圖2 烏頭類生物堿

烏頭屬藥材中含有多種化學成分,主要成分為二萜生物堿,是烏頭屬藥材的有效成分,又是最主要的毒性成分,包括C18型二萜生物堿、C19型二萜生物堿、C20型二萜生物堿及雙二萜生物堿(圖2)。在C19二萜類生物堿中的烏頭堿-牛扁堿型研究較多,其母核按C3、C8及C14位取代基結構的不同,又分為三酯型生物堿、雙酯型生物堿、單酯型生物堿和醇胺型生物堿。目前,對于烏頭屬構效關系的研究主要集中在C18及C19型二萜生物堿。

2.1.1 烏頭屬有效成分與鎮(zhèn)痛活性的構效關系 自1981年起,就有學者開始研究烏頭屬植物的C18及C19二萜型生物堿的鎮(zhèn)痛活性。在所研究的化合物中,3-乙酰烏頭堿(3-acetylaconitine)、拉普烏頭堿(Lappaconitine)、粗頸烏頭堿 A(CrassicaulineA)、草烏甲素 A(Bulleyaconitine A)已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛活性,并且以應用于臨床[7-11]。二萜類生物堿的鎮(zhèn)痛機制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞膜Na+通道有關。根據(jù)對電壓依賴Na+通道的作用方式不同,具鎮(zhèn)痛作用的二萜生物堿分為3類:雙酯型(如烏頭堿、中烏頭堿、3-乙酰烏頭堿)對Na+通道結合位點2具有高親和力,激活電壓依賴性Na+通道導致去極化最終抑制疼痛傳導;單酯型(如高烏甲素,N-去乙酰高烏甲素)能抑制Na+通道,具有鎮(zhèn)痛和抗癲癇作用;胺醇類由于失去了與Na+通道結合位點的苯甲酰酯基,鎮(zhèn)痛作用較弱。唐希燦等[12]通過對烏頭堿、3-乙酰烏頭堿和草烏甲素的鎮(zhèn)痛活性和毒性比較發(fā)現(xiàn),3位羥基的引入使鎮(zhèn)痛活性增大,毒性也增大;而羥基乙?；山档投拘院玩?zhèn)痛活性,但后者的下降幅度較小而加大了治療指數(shù)。同時發(fā)現(xiàn),8位、14位酯基的改變對活性和毒性的影響也很大,具有8、14位雙酯的烏頭堿毒性最大,而水解掉一個酯基變成單酯基化合物則毒性大大降低而鎮(zhèn)痛活性下降較小。Jutta Friese等[13]通過對一些高親和性生物堿和低親和性生物堿鎮(zhèn)痛活性以及毒性比較發(fā)現(xiàn),雙酯型二萜生物堿使神經(jīng)突觸鈉離子流以及鈣離子流增加(EC50,3 μM),鎮(zhèn)痛活性較強(ED50,25 μM),并可導致心率失常,有較大毒性(LD50,70 μg/kg)。單酯型和醇胺型二萜生物堿則減少鈣離子流,使心率降低且鎮(zhèn)痛活性較低(ED50,20 mg/kg),毒性也較低(LD50,30 mg/kg)。這也表明C-8位的乙氧基取代及C14位的芳香酯基取代對于鎮(zhèn)痛作用是重要的。Angélica M.Bello-Ramírez等[14]運用了QSAR分析了烏頭屬植物根中已證明具有鎮(zhèn)痛活性的生物堿的結構與活性之間的構效關系。認為在C-14位連接芳酯基或芳酰基的鎮(zhèn)痛活性強于在C-4位連接芳酯基的活性。其次,在芳香環(huán)上的C-5位的反應活性系數(shù)對于鎮(zhèn)痛活性來說是一個最重要的因子。通過對3種二萜類烏頭屬生物堿高烏甲素(Lappaconitine)、滇烏頭堿(Yunaconitine)和粗頸烏頭堿(Crassicauline)的鎮(zhèn)痛活性進行比較,Jianli Wang等認為A環(huán)三價氮離子、8位碳連接的乙酰氧基或羥乙基、14位碳的芳香酯基以及D環(huán)的飽和度為影響該類生物堿鎮(zhèn)痛活性的重要因素[15]。

2.1.2 烏頭屬中藥成分與抗炎活性的構效關系 目前,關于烏頭屬中藥成分的抗炎構效關系的研究很少,只能通過已證明有明顯抗炎活性的化合物的結構來推測與療效相對應的必須結構。由于煎煮,使得烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿含量降低。然而,它們的水解產物,如苯甲酰烏頭堿、苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿含量相對較高,且實驗表明具有顯著的抗炎活性[16-20],說明水解產物的抗炎活性強于原形烏頭型生物堿,即烏頭屬有效成分的抗炎活性可能與C-8位的乙酰氧基以及酯基的碳鏈長度以及不飽和度有關。

2.1.3 烏頭屬中藥成分與局部麻醉活性的構效關系 Angélica M.Bello-Ramírez等[21]應用QSAR探討了烏頭型生物堿與局部麻醉之間的關系。研究認為,烏頭型生物堿的局部麻醉作用的構效不同于鎮(zhèn)痛作用的結構特征,在C-14位上連接芳酯基最具有局部麻醉活性,而C-4位連接此基團則活性相對較弱。此外,烏頭型生物堿的局部麻醉活性的ED50與分子量、核-核之間的排斥能量、空間的能量等具有顯著的聯(lián)系。其中,分子量是最重要的結構參數(shù),與其正相關;其次是芳香環(huán)上C-5′及C-2′的反應活性指數(shù),與其負相關。

2.1.4 烏頭屬中藥成分與毒性的構效關系 研究表明,雙酯型烏頭堿類成分經(jīng)水解轉變?yōu)閱熙バ蜑躅^堿類,毒性減為雙酯型烏頭堿的1/200,繼續(xù)水解為胺醇類堿,毒性為雙酯型烏頭堿的1/2 000,毒性與其結構關系極為密切,且療效也存在巨大差異,與其結構密切相關也密切相關,故研究效應與結構的關系對減毒增效具有十分重要的價值[22]。Angélica M等[23]對烏頭型生物堿的結構特征及毒性(LD50)之間的關系進行了QSAR分析,他們把這些生物堿分成2組(圖3),組一為在C-14為連接芳?；蚍减セ?如滇烏頭堿(Yunaconitine)、烏頭堿(Aconitine)、3-乙?；鶠躅^堿(3-acetyl aconitine)等;組二為在C-4位連有芳酯基,如高烏甲素(Lappaconitine)、N-去乙酰高烏頭堿(N-deacetyllappaconitine)等。發(fā)現(xiàn)組一的LD50顯著低于組二,即在C-14位連有芳酰基或芳酯基毒性強于在C-4位連有芳酯基的烏頭型生物堿(表1)。表明C-14上連有的芳酰基或芳酯基對毒性來說是很重要的。

圖3 Angélica M研究中被分為兩類的烏頭類生物堿

周遠鵬的研究顯示,不含14位芳酯基的Pseudaconine和Pentaacetylaconine不會引起心律失常,且苯甲酰烏頭堿(benzoylaconine)毒性低于烏頭堿(aconitine)200倍[24]。進一步說明了14位碳的芳酯基為烏頭類生物堿的重要毒性基團。唐希燦等對烏頭堿、3-乙酰烏頭堿和草烏甲素的毒性進行比較,發(fā)現(xiàn)引入3位羥基可增加毒性,而對此羥基進行乙?；山档投拘?且下降幅度較鎮(zhèn)痛活性下降大,因而增加了治療指數(shù)[25]。8位、14位酯基的改變對活性和毒性的影響也很大,具有8、14位雙酯的烏頭堿毒性最大,而水解掉一個酯基變成單酯基化合物則毒性大大降低而鎮(zhèn)痛活性下降較小[26]。

Malakhat A.Turabekova等[27]運用GA-MLRA技術對19種烏頭屬和翠雀屬生物堿進行了QSAR分析,結果顯示,化合物特征結構中羰基的數(shù)量在生物堿活性中起著決定性的作用,同時決定著氫鍵形成能力。毒性的增加由參與氫鍵的原子數(shù)量決定,而不是大型基團的增加。這一研究表明分子量越大、疏水性越強、氮原子形成分子內氫鍵能力越強,該烏頭類生物堿毒性越低,同時也進一步證實了烏頭類生物堿是在Na+通道與受體結合,氫鍵在結合過程中發(fā)揮著重要作用。洪波等[28]采用密度泛函理論B3LYP/6-31G方法,對附子中的9種生物堿類成分進行了量子化學理論研究,討論了該類生物堿的結構和毒的關系。研究認為,C-8位及C-14位上的酯基,特別是C-14上的Ph COO-在水解的過程中所發(fā)生的變化,影響了分子的構型、電荷分布、前線分子軌道等性質,使分子與受體的作用減弱,從而使毒性降低。

表1 兩類烏頭類生物堿的毒性及其特征結構的關系

本課題組采用微量熱法,研究3種烏頭類雙酯型生物堿對嗜熱四膜蟲生長的毒性效應。在不同給藥條件下,以表達功率-時間曲線(熱譜曲線)的特征參數(shù)生長速率常數(shù)(k)、半數(shù)抑制濃度(IC50)、最大輸出功率(Pmax)及達峰時間(tp)和總產熱量(Qt)為指標,對嗜熱四膜蟲生長代謝程度進行客觀地量化評價。由半抑制濃度IC50得到3種烏頭類雙酯型生物堿毒性的大小順序:烏頭堿>新烏頭堿>次烏頭堿。構效關系研究表明,在烏頭類雙酯型生物堿C(3)上引入羥基(OH)以及N原子上引入乙基(CH2CH3)更有助于增加雙酯型生物堿的毒性作用[29]。

2.2 基于系統(tǒng)毒理學研究中藥的毒性作用網(wǎng)絡 系統(tǒng)毒理學旨在采用人源細胞系、細胞組分進行體外高通量篩選實驗,整合計算預測模型,直接測試和模擬人體環(huán)境。其中主要的研究方法:通過生物信息學和計算毒理學技術,結合傳統(tǒng)毒理學的研究參數(shù),建立“藥物-靶點-毒性”網(wǎng)絡模型推測各要素之間相互關系,并對預測的結果進行實驗驗證,從而研究中藥的毒理學性質及致毒機制等,為藥物的安全性評價提供理論依據(jù)。

2.2.1 利用系統(tǒng)毒理學開展中藥的毒性作用網(wǎng)絡的技術 構建毒性作用網(wǎng)絡的現(xiàn)有網(wǎng)絡工具主要包含數(shù)據(jù)庫、毒性預測工具和網(wǎng)絡可視化及分析軟件。

目前,可用于毒性作用網(wǎng)絡研究的相關數(shù)據(jù)庫主要有CTD,TOXNET,NTP,RTECS等。CTD(comparativetoxicogenomics database)[30]提供了環(huán)境化合物影響人類健康的數(shù)據(jù)信息,首次為全世界研究人員提供了多種毒理學信息,包括不同類型分子的毒理學數(shù)據(jù)以及來自各種生物體的毒理學數(shù)據(jù)等。TOXNET提供了一組毒性有關的數(shù)據(jù)庫,包括HSDB,IRIS,GENE-TOX,CCRIS等。其中,HSDB(hazardoussubstances data bank)主要提供人和動物相關的毒性方面的數(shù)據(jù)等;IRIS(integrated risk information system)主要提供人類健康風險評估相關數(shù)據(jù),如危害辯識、藥物劑量反應評估等;GENE-TOX主要提供生化誘變測試相關數(shù)據(jù);CCRIS(chemical carcinogenesis research information system)主要提供化合物致癌性、誘變性等數(shù)據(jù)信息。NTP(national toxicology program)是由美國DHHS(Department of Health and HumanServices)于1978年創(chuàng)建,已為諸多化學品或藥物提供了系統(tǒng)的短期毒性、器官毒和三致等基礎科學數(shù)據(jù)。RTECS(theregistry of toxic effects of chemical substances)是一個大型數(shù)據(jù)庫,涵蓋了大量(超過130 000種)化合物的毒性信息,包括急性毒性、多劑量毒性、遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、皮膚和眼睛刺激等[31]。

可用于毒性預測的工具主要有TOPKAT,HazardExpert,DEREK,M-CASE,ToxSYS等。TOPKAT(www.accelrys.com)由Accelrys公司開發(fā),主要預測外源物質的致突變性、致癌性、敏感性、刺激性等。HazardExpert(www.compudrug.com)由Compudrug公司開發(fā),主要預測外源物質的致突變性、致癌性、致畸性、皮膚敏感性、刺激性、免疫毒性、神經(jīng)毒性等。DEREK(www.chem.leeds.ac.uk)由Lhasa Limited公司開發(fā),主要預測外源物質的致突變性、致癌性、致畸性、刺激性、神經(jīng)毒性、甲狀腺毒性、呼吸敏感性和皮膚敏感性等。M-CASE(www.multicase.com)由Multicase公司開發(fā),主要預測外源物質的致癌性、致畸性、刺激性、短期毒性等。ToxSYS(www.scivision.com)由SciVision公司開發(fā),主要預測外源物質的致突變性、急性毒性等。

網(wǎng)絡可視化工具可以把難以理解的關系表變得容易觀察和分析的網(wǎng)絡圖,網(wǎng)絡分析工具則用于對已建成的網(wǎng)絡進行拓撲學等分析,以挖掘出隱含的知識、規(guī)律和新的知識。一般而言,網(wǎng)絡可視化和網(wǎng)絡分析工具大多集成在同一軟件中,以方便研究。該技術是指應用可視化工具,將聯(lián)系表反映成一張相互聯(lián)系的可視網(wǎng)絡的過程。一般分為2個階段:①豐富網(wǎng)絡屬性,通過增添網(wǎng)絡本身、節(jié)點及連接的屬性,使節(jié)點聯(lián)系表擴展為包含豐富信息的網(wǎng)絡;②網(wǎng)絡描述,通過豐富的特征描述手段,使網(wǎng)絡表現(xiàn)更加直觀。目前,應用較為廣泛的網(wǎng)絡可視化及分析軟件有Cytoscape,GUESS,Pajek等[32]。

2.2.1.1 基于CTD的藥-靶-毒性網(wǎng)絡的構建 美國比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)(http://ctdbase.org/)是一個由環(huán)境科學家和毒理學家手工創(chuàng)建的與毒理基因組學密切相關的數(shù)據(jù)庫,目前數(shù)據(jù)庫中包含超過百萬條化合物基因疾病關聯(lián)性數(shù)據(jù),包括文獻報道的試驗數(shù)據(jù)和計算推理的數(shù)據(jù)。CTD中收集了目前成熟的3個2部網(wǎng)絡數(shù)據(jù),包括化合物-基因相互作用(Chemical-Gene Interactions,CGI)、化合物-疾病關聯(lián)性(Chemical-Disease Associations,CDA)和基因-疾病關聯(lián)性(Gene-Disease Associations,GDA)用于計算系統(tǒng)毒理學方法的發(fā)展和模型構建。Davis等[33]運用CTD的導出和批量處理工具下載砷類化合物和基因的交互作用,分析基因序列以獲得分子間相互作用,KEGG通路注釋,并推斷疾病關系。CTD從文獻中得到了21個不同砷類化合物和1456個基因和蛋白的2738種治療關系,揭示了暴露在砷類化合物下時受影響的生理學功能和分子網(wǎng)絡,包括應激反應、細胞凋亡、細胞周期和具體的蛋白信號通路。整合砷類化合物-基因數(shù)據(jù)和基因疾病數(shù)據(jù)得到了可能與砷暴露相關的疾病清單和可能解釋這種關聯(lián)的基因。結果表明CTD數(shù)據(jù)整合和管理策略能夠揭示了環(huán)境化合物的作用機制,并為發(fā)展環(huán)境性疾病致病原下的分子機制假說奠定基礎。針對有關砷類化合物分子響應的文獻報道,CTD將其與能夠幫助建立“化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡的附加策劃數(shù)據(jù)集相整合,為考察砷相關疾病和毒性的分子基礎提供證據(jù)。

此外,CTD通過收集化合物和基因,基因和疾病,疾病和化合物之間相互關系的數(shù)據(jù),建立起化合物-基因-疾病的網(wǎng)絡系統(tǒng)。研究者不僅可以在數(shù)據(jù)庫中找到數(shù)據(jù),而且還可以從中推導出新的信息[34]。Allan等[35]還繼續(xù)開發(fā)了新的工具來幫助研究者更好地使用CTD數(shù)據(jù)庫。不僅如此,如果從細胞信號通路的角度入手,撇開單個基因的表達變化差異,而關注與信號通路的整體變化的比較分析,在某些研究中取得了更好的效果。這些成果使得毒理基因組學的研究向系統(tǒng)化前進了一大步。此類分析適用于任何環(huán)境性化合物或治療性藥物的毒性網(wǎng)絡研究,中藥毒性成分也不例外。

2.2.1.2 基于MetaADEDB的藥-靶-毒性網(wǎng)絡的構建 藥物不良反應的預測和識別在發(fā)展個性化診療中十分重要。許多不良反應在臨床試用階段并未被發(fā)現(xiàn),導致被批準進入臨床應用時產生的不良發(fā)病率和死亡率在全世界都很常見。因此綜合性計算可得的藥物不良反應數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Computer-available ADEs Database,MetaADEDB)應運而生。MetaADEDB是由整合CTD、SIDER和OFFSIDES而得到的,能夠將3 060個化合物(其中包含超過1 300個FDA批準的藥物和試驗藥物)和13 256種藥物不良反應聯(lián)系起來。MetaADEDB中的所有藥物和疾病都由醫(yī)學主標題和統(tǒng)一醫(yī)學語言系統(tǒng)詞匯進行標注。目前已有527 216個藥物-藥物不良反應關聯(lián)運用MetaADEDB建立,研究者可運用藥物名稱、藥物不良反應名稱、醫(yī)學主題詞以及統(tǒng)一醫(yī)學語言系統(tǒng)標識符和相似性搜索在MetaADEDB搜索特定的藥物-藥物不良反應相關性。Tang等[36]以MetaADEDB為基礎,發(fā)展了預測能力可與結構相似性推斷(Structural Similarity Inference,DSSI)方法和藥物治療作用相似性推斷(Drug Therapeutic Similarity Inference,DTSI)方法比較肩的藥物不良反應相似性推斷(Drug Side Effect Similarity Inference,DSESI)方法,在由621個批準藥物和893個靶蛋白連接而成的已知“藥物-靶點”相互作用(Drug Target Interaction,DTI)網(wǎng)絡對7個批準藥物進行藥物-靶點的預測。發(fā)現(xiàn)了關于多巴酚丁胺、菲洛特羅、酮替芬、洛沙平、曲馬多、匹莫齊特、舍曲林7種藥物的共44對新預測的DTI組合,其中7組DTI組合在已報道的實驗中得到了證實。

此外,“藥物-靶點”和“靶點-不良反應”關聯(lián)的網(wǎng)絡可視化可以為市售藥物提供新的作用機制(Mechanism-of-action,MOA)。在個案研究中,“藥物-靶點”關聯(lián)的網(wǎng)絡可視化和脫靶的不良反應關聯(lián)為3種抗精神病藥物(菲洛特羅、匹莫齊特、洛沙平)提供了新的作用機制。

圖4 7種批準藥物的DTI組合

圖5 利用Cytoscape軟件包制作的3種藥物脫靶不良反應網(wǎng)絡

2.2.1.3 毒性作用網(wǎng)絡技術在中藥研究中的應用 毒性作用網(wǎng)絡通過基因、蛋白、化合物和毒性反應之間的網(wǎng)絡構建,可在復雜體系中尋找毒性物質、預測已知化合物的不良反應,為解釋其致毒機制提供有價值的信息。毒性作用網(wǎng)絡在中藥研究中可以有以下幾方面的應用[37]。1)尋找單味中藥或方劑中的潛在致毒成分:隨著中藥臨床應用的增加,其不良反應報道亦逐年增多。然而,受限于中藥化學組成的復雜性,目前仍缺乏有效辨識其致毒組分或成分的方法。網(wǎng)絡毒理學的提出為該問題的解決提供了新的思路。例如,根據(jù)某些毒性反應(或不良反應)相關的毒性化合物結構的相似性可構建化合物-化合物網(wǎng)絡,再在所建網(wǎng)絡中加入結構明確的中藥成分,進行網(wǎng)絡分析,與已知毒性化合物處于同一子簇的中藥成分可能就是該藥材的潛在毒性成分。對經(jīng)體外及動物實驗證實的毒性成分,應當在中藥制劑中嚴格控制這些化合物的含量,并在臨床上謹慎使用含有這些成分的中藥。2)闡述有毒中藥或方劑的致毒機制:古人對有毒中藥的安全應用已有獨特的見解,中醫(yī)古籍中也記載了許多有關有毒中藥(按其毒性強弱分為大毒、有毒以及小毒中藥)方面的理論知識和臨床應用經(jīng)驗,逐漸形成了中藥毒性理論和有效控制有毒中藥毒性相關的方法體系,但關于有毒中藥的致毒機制尚未進行詮釋。因此,揭示有毒中藥的致毒機制可為合理使用有毒中藥提供科學數(shù)據(jù)。有研究表明,中藥的毒性作用很可能也是通過多途徑、多靶點起作用,而解釋這種復雜毒性機制正是網(wǎng)絡毒理學的優(yōu)勢所在。如,可針對重要的毒性靶器官,從相關數(shù)據(jù)庫和文獻中抽取整理中藥、蛋白、基因、毒性反應等相關信息,采用前述軟件構建有毒中藥-靶點網(wǎng)絡,進而對所建網(wǎng)絡進行系統(tǒng)分析,闡明有毒中藥的可能致毒機制。3)詮釋中藥配伍禁忌理論科學內涵:“十八反”“十九畏”等配伍禁忌理論是中藥臨床使用的重要指導原則,但其科學內涵尚未得到完全詮釋。如“甘草反甘遂”的研究實例表明[38],當甘草、甘遂2種藥合用時,毒性的大小主要取決于甘草與甘遂的用量比例:當甘草的用量相等或大于甘遂的用量時,所產生的毒性相對2味藥單用時所產生的毒性作用大;而“烏頭反貝母與半夏”的研究實例表明,烏頭配伍半夏、貝母后毒性增加并不大[39]。顯然,“十八反”和“十九畏”的現(xiàn)象,還有待進一步深入研究,探討相畏和相反現(xiàn)象產生的機制和規(guī)律。網(wǎng)絡毒理學為“十八反”和“十九畏”等傳統(tǒng)中醫(yī)配伍禁忌理論現(xiàn)代研究提供了新的思路。以“甘草反甘遂”為例,可通過文獻整理、數(shù)據(jù)庫查找、實驗研究甚至計算預測等方法收集由甘草或甘遂引起的毒性反應的相關蛋白、基因等,構建蛋白-蛋白網(wǎng)絡、基因-基因網(wǎng)絡或基因-蛋白網(wǎng)絡;其次,收集2味中藥(甘草和甘遂)所包含的盡可能全的成分;再者,通過網(wǎng)絡的方法構建這2味中藥相關成分的化合物-蛋白網(wǎng)絡、化合物-基因網(wǎng)絡或化合物-蛋白-基因網(wǎng)絡;最后,通過網(wǎng)絡分析推測2味中藥“相反”的作用的致毒機制。4)解釋中西藥相互作用:目前,中西藥結合治療復雜疾病的現(xiàn)象越來越普遍。合理的配伍有益于疾病的治療,而不合理的配伍,則會帶來許多不良反應與配伍禁忌。有些中西藥均具有較強的藥理作用,合用后藥理作用相互加強產生不良反應。如強心苷有較強的藥理效應,過量會引起中毒。因此,蟾酥、夾竹桃等含強心苷成分的中藥及其制劑不宜與強心苷類西藥合用[40]。與前述中藥配伍禁忌研究類似,同樣可以使用毒性作用網(wǎng)絡的研究方法,通過構建化合物-蛋白網(wǎng)絡、化合物-基因網(wǎng)絡或化合物-蛋白-基因網(wǎng)絡,通過系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析對聯(lián)合用藥產生不良反應的原因進行科學的解釋。

2.3 基于網(wǎng)絡藥理學研究中藥的活性作用網(wǎng)絡 中藥網(wǎng)絡藥理學主要是評價中藥的多個靶點的協(xié)同作用對疾病相關分子網(wǎng)絡的綜合影響問題。網(wǎng)絡藥理學的研究方法包括:1)憑借公共的開放數(shù)據(jù)庫,模擬研究目標成分的分子網(wǎng)絡模型,用于闡釋和預測成分-靶標的相互作用規(guī)律;2)借助蛋白組學、基因組學及高內涵/高通量篩選手段,獲得海量數(shù)據(jù)后運用生物信息學進行分析,構建擬研究目標成分-靶標-疾病的分子網(wǎng)絡,進而解析目標藥效物質的網(wǎng)絡機制。基于生物分子網(wǎng)絡的中藥藥理學研究路線通常包括:1)探索活性成分的作用靶標;2)明確中藥所治療疾病的相關基因,并構建疾病網(wǎng)絡;3)整合并完善藥物-靶點-疾病,闡釋中藥多成分、多靶點、多途徑、多層次的協(xié)同作用規(guī)律。常用的分子網(wǎng)絡歸為3大類:1)藥物組(drugome)網(wǎng)絡,可用于預測脫靶效應、藥物不良反應及藥物作用機制的闡釋等;2)疾病組(diseaseome)網(wǎng)絡,用于預測疾病相關的基因和闡釋疾病發(fā)病機制;3)相互作用組(interactome)網(wǎng)絡,分析疾病相關基因和藥物相關靶標在相互作用組中的關系,闡釋疾病發(fā)病機制和評估藥物的藥效及不良反應,指導設計高療效低毒性的新藥物。三者的關系如圖6所示。

2.3.1 利用網(wǎng)絡藥理學研究中藥的活性作用機制的思路 1)探索活性成分的作用靶標:當前計算預測方法主要有反向分子對接(Inverse Docking)、化學相似性搜索(Chemical Similarity Searching)等。反向分子對接以小分子化合物為探針,在已知結構的候選靶點數(shù)據(jù)庫內,搜尋可能與之結合的生物大分子,通過空間和能量匹配,識別可能形成的分子復合物,進而預測藥物潛在的作用靶點。2013年《Nature》報道,紐約大學朗格醫(yī)學中心的藥理學家Timothy Cardozo開展了史上最大規(guī)模的藥物對接計算機模擬工作[41]:從PubChem數(shù)據(jù)庫和ChEMBL數(shù)據(jù)庫中選擇了大約60萬種化合物分子,評價了這些分子與570種人類蛋白質的7 000多個結構“口袋”的結合能力的強弱,創(chuàng)建了名為Drugable的網(wǎng)站并對公眾開放。對于靶標未知的化合物,通過搜索與其結構相似而靶標已知的化合物,來預測該化合物的靶標。Lin Na課題組[42]在研究烏頭湯對類風濕關節(jié)炎的作用機制時,首先通過查詢TCMDatabase@Taiwan數(shù)據(jù)庫,獲得烏頭湯中化合物的化學結構,然后使用TTD(Therapeutic Targets Database)數(shù)據(jù)庫所提供的藥物相似性搜索工具,搜索到烏頭湯中的化合物與153種藥物有相似結構,預測了潛在作用靶點。李梢課題組[43]提出的靶標預測算法drugCIPHER將藥物的化學相似性、治療相似性相結合,預測了清絡飲中235種活性成分對應的靶標。2)構建疾病網(wǎng)絡:對于疾病網(wǎng)絡的構建,相關研究小組設計了很多算法,在已知疾病基因的基礎上預測更多的疾病相關基因。其中,基于蛋白網(wǎng)絡的算法可用于疾病網(wǎng)絡構建:從背景網(wǎng)絡中將已知疾病基因、預測的疾病基因,以及這些基因間的相互作用全部提取出來,構建成疾病網(wǎng)絡。近年來的算法主要包括隨機漫步法、Page Rank法、k步馬爾科夫法(k-step Markov method)、網(wǎng)絡傳播法、Katz-中心性法等。李梢課題組[44]提出的疾病基因預測算法CIPHER,將疾病間的相關性與網(wǎng)絡結點的鄰近性相結合,利用此算法,他們以OMIM中類風濕關節(jié)炎基因為種子,預測了更多類風濕關節(jié)炎相關的基因,從而構建了該疾病的網(wǎng)絡。3)研究協(xié)同作用:復方中藥中不同成分間通過多靶標協(xié)同作用發(fā)揮療效,如何確定這種協(xié)同作用、量化評價藥物作用于多靶標所達成的終極治療效應,仍是中藥藥理學研究中的難題。李梢課題組[45]提出的基于網(wǎng)絡靶標的多成分協(xié)同作用識別法NIMS,將不同成分的靶標在疾病網(wǎng)絡上的位置關系、與靶標對應的疾病譜的關系結合起來,確定存在協(xié)同作用的成分組合。趙靜和張衛(wèi)東課題組[46]在研究黃連解毒湯抗類風濕作用機制時,應用隨機漫步算法,分別計算了類風濕關節(jié)炎的疾病基因和黃連解毒湯的靶標蛋白對全基因組網(wǎng)絡中各蛋白的影響分,獲得疾病影響向量和藥物影響向量。

2.3.2 利用網(wǎng)絡藥理學開展中藥的活性作用網(wǎng)絡的技術

2.3.2.1 數(shù)據(jù)的獲取和驗證 網(wǎng)絡藥理學研究中與實驗相關的環(huán)節(jié)有2個:一是基于實驗結果構建網(wǎng)絡所需基本數(shù)據(jù)的獲取,二是對所建立的網(wǎng)絡預測模型進行實驗驗證,這2個環(huán)節(jié)涉及的技術均應具有高通量、可定量、靈敏、快速、簡便、可靠地獲取大量數(shù)據(jù)的特點。目前,網(wǎng)絡藥理學研究所涉及的相關技術除了組學(基因組、蛋白質組、代謝組和元基因組等)技術外,主要包括高通量和高內涵技術、雙高通量基因表達檢測技術和分子相互作用技術[47]。高通量/高內涵技術是指在保持細胞、組織或整體動物結構和功能完整性的前提下,一次性檢測成百上千個處理且同時檢測被篩樣品對活細胞、組織或整體動物多個表型的作用,具有均質、多維表型檢測、實時動態(tài)監(jiān)測和可視化的特點。雙高通量基因表達檢測技術是指應用具有檢測樣品高通量、檢測目標基因高通量的雙高通量技術,具有對所需基礎數(shù)據(jù)和網(wǎng)絡模型進行驗證的作用。Fakhari等[48]在2002年提出的聚合酶鏈式反應(PCR)芯片技術,具有操作流程簡單、定量結果無需后期驗證、特異性強、靈敏度高及重復性好等特點。分子相互作用技術是指從網(wǎng)絡藥理學角度揭示藥物作用原理,或對所構建的藥物作用網(wǎng)絡或預測模型進行驗證,用來揭示藥物分子與機體生物大分子之間的相互作用關系。主要包括3種技術:基于表面等離子共振的檢測技術、基于生物膜層干涉的檢測技術、納米液相層析一質譜分析技術。這3種技術均具有高通量、高精度、無標記且實時檢測的特點[49-51]。

圖6 網(wǎng)絡藥理學中的分子網(wǎng)絡

2.3.2.2 網(wǎng)絡可視化技術 同2.2.1項下利用系統(tǒng)毒理學開展中藥的毒性作用網(wǎng)絡的技術中的網(wǎng)絡可視化技術。

2.3.2.3 網(wǎng)絡分析技術 該技術是指采用相應技術對構建得到的網(wǎng)絡進行分析,從中提取出有用信息。主要分為3類:1)網(wǎng)絡拓撲學信息計算,可以得到網(wǎng)絡本身的統(tǒng)計屬性,反映網(wǎng)絡中的隱藏信息;2)隨機網(wǎng)絡生成和比較,用來對現(xiàn)有網(wǎng)絡進行可靠性驗證;3)網(wǎng)絡分層和聚類,簡化網(wǎng)絡復雜度的重要算法,也是尋找網(wǎng)絡潛在信息的方法[52-54]。

2.3.2.4 網(wǎng)絡藥理學技術在中藥研究中的應用 中醫(yī)藥的特色體現(xiàn)在中藥復方對復雜疾病整體上的辨證論治。強調從整體把握病因、病機的傳變規(guī)律及疾病的發(fā)展變化,同時方劑的配伍組方注重“君、臣、佐、使”,通過多味中藥的協(xié)調配合實現(xiàn)對機體失衡紊亂狀態(tài)的調節(jié),這些理念充分體現(xiàn)了多成分、多靶點及系統(tǒng)調控的思想。借鑒并應用網(wǎng)絡藥理學技術和方法,通過挖掘網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點和功能模塊研發(fā)多分子、多靶點的復方制劑,有助于中醫(yī)藥整體和多途徑系統(tǒng)調控的作用及其機制的研究。1)中藥數(shù)據(jù)庫的構建和應用:建立中藥數(shù)據(jù)庫是開展中藥網(wǎng)絡藥理學研究的前提。Ye H等[55]通過文本挖掘技術結合嚴格的人工審核與注釋,并從PubMed等海量文獻中獲取中草藥有效成分蛋白靶點信息,建立了首個中草藥有效成分蛋白靶點數(shù)據(jù)庫(Herbal Ingredients′targets Database,HIT),該數(shù)據(jù)庫提供了中草藥一活性成分一蛋白靶點一站式綜合信息,并且,提供了化合物結構式及蛋白序列相似性的分析平臺。運用HIT發(fā)現(xiàn)中藥成分經(jīng)常作用于多個已知的西藥靶點,而其藥靶蛋白又具有明顯的網(wǎng)絡特征,如87%藥靶參與的pathway不超過4條[56]。

LiS等[57]整合中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫與基因芯片數(shù)據(jù)庫,構建了具有全球網(wǎng)絡特性的文獻和基因芯片數(shù)據(jù)整合系統(tǒng)(LMMA),并運用LMMA重建血管生成網(wǎng)絡。另外,疾病一藥物數(shù)據(jù)庫DrugBank和Therapeutic Target Database(TTD)等,也為我們研究中藥成分的藥物靶標等提供了研究工具[58-59]。2)中藥靶點預測:中藥靶點預測是通過網(wǎng)絡藥理學技術,虛擬篩選中藥有效物質并發(fā)現(xiàn)其作用靶點,為發(fā)現(xiàn)中藥及復方新的藥理作用提供實驗理論依據(jù)。吳氏等[60]根據(jù)1 401個美國FDA批準上市藥物的分子結構及其相應靶點數(shù)據(jù),采用隨機森林法建立靶點預測模型,進而依據(jù)附子所含化學成分預測其作用靶點,并據(jù)此構建附子多成分一多靶點網(wǎng)絡,研究發(fā)現(xiàn)附子的22個化學成分預測出多個作用靶點,預測結果得到文獻數(shù)據(jù)印證,反映出中藥“多成分、多靶點、多效應”的特點。朱氏等[61]對小柴胡湯中甘草酸、黃芩苷、柴胡皂苷A、人參皂苷Re等38種化學成分進行靶標預測和分析。研究表明,38種化學成分中有21種被發(fā)現(xiàn)有預測靶標,提示了小柴胡湯多效應的分子機制。張氏等[62]采用基因芯片檢測的高通量組學數(shù)據(jù),通過連通圖(C Map)對扶正化瘀膠囊療效的新藥理作用進行了預測,發(fā)現(xiàn)扶正化瘀膠囊具有降血糖、降血脂和降血壓的作用。3)中藥網(wǎng)絡藥理學分析:為了分析中藥及其復方復雜且多向的藥理作用,朱氏等[63]運用分子對接和復雜網(wǎng)絡分析技術研究調脾護心方所含化學成分和靶標之間的相互作用,結果發(fā)現(xiàn),調脾護心方所含化學成分一靶標相互作用網(wǎng)絡屬于無尺度網(wǎng)絡模型,網(wǎng)絡的無尺度特性和網(wǎng)絡節(jié)點的性質可以較好地闡釋各化學成分的藥理作用。鄭氏等[64]利用生物網(wǎng)絡特征參數(shù),對透骨消痛膠囊中分子配體一靶作用網(wǎng)絡和藥物庫中藥物分子配體一靶作用網(wǎng)絡對照研究透骨消痛膠囊的藥理學機制,研究發(fā)現(xiàn)透骨消痛膠囊和藥物分子配體一靶作用網(wǎng)絡中存在“一對多、多對一”復雜的非線性調控模式,揭示了透骨消痛膠囊的多向藥理學行為。4)中藥文本挖掘的網(wǎng)絡可視化:為了發(fā)掘文獻信息,實現(xiàn)數(shù)據(jù)整合,發(fā)現(xiàn)中藥新的功效,吳氏等運用網(wǎng)絡藥理學方法理念構建中藥飲片網(wǎng)絡,研究和詮釋飲片的主治、功能與歸經(jīng)等屬性間相互關系,以2010年版《中華人民共和國藥典》所載646種中藥飲片的相關信息,采用文本挖掘法將飲片主治信息梳理歸類,以主治來關聯(lián)各味飲片,建立飲片網(wǎng)絡模型,再對網(wǎng)絡進行分析和詮釋。結果梳理歸納出3 016對飲片一主治關聯(lián),據(jù)此建立飲片網(wǎng)絡[65]。5)中藥多成分相互作用的網(wǎng)絡藥理學研究:為了發(fā)現(xiàn)中藥多成分相互作用的方式和潛在藥理作用,Yue QX等[66]研究發(fā)現(xiàn),中藥多成分協(xié)同機制主要以藥效動力學為主,中藥多成分同時作用于生物網(wǎng)絡上的相同或不同靶點后,可以通過互補增強或拮抗抵消,網(wǎng)絡交叉相互協(xié)調來產生整體增強效果。Li S等[67]將篩選具有協(xié)同作用復方制劑的網(wǎng)絡靶標技術應用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥,并提出了以網(wǎng)絡靶標為基礎鑒別多成分協(xié)同作用(NlidS)的算法,運用NIMS算法發(fā)現(xiàn)中藥成分漢防己堿能與木樨草素、槲皮素、厚樸酚、苦參堿和芍藥苷5種成分產生增效協(xié)同作用。此外,Wu Z等[68]基于藥物相互作用分子網(wǎng)絡建立的多種藥物作用預測方法也可以用于中藥多成分相互作用的療效預測研究。6)基于中醫(yī)“病—證一效”結合的網(wǎng)絡藥理學研究:辨證論治是中醫(yī)的特色所在,強調病證結合、方證合一。網(wǎng)絡藥理學整合了“疾病-表型-基因-藥物”信息,建立了“疾病表型-生物分子”網(wǎng)絡,能為具有中醫(yī)特色的“病-證-效”結合治療模式服務[69]。牛氏等[70]以熱證類風濕性關節(jié)炎(RA)為切入點,通過構建、分析其對應的分子網(wǎng)絡及藥物靶標網(wǎng)絡,運用定向文本挖掘等技術探討“藥-證對應”的機制,結果發(fā)現(xiàn),RA熱證的分子網(wǎng)絡和對證中藥靶點的分子網(wǎng)絡所涉及的共同的生物學通路可能就是對證中藥治療RA熱證“藥-證對應”的分子生物學機制之一。

2.4 基于復雜網(wǎng)絡系統(tǒng)研究烏頭類中藥毒-效整體作用規(guī)律 通過構建的“成分-靶點-活性”網(wǎng)絡和“成分-靶點-毒性”網(wǎng)絡的整合分析,系統(tǒng)闡述烏頭類中藥在臨床上“治療心力衰竭與心臟毒性”“治療風濕痹痛與神經(jīng)毒性”“治療妊娠疾病與胚胎毒性”3個層面上的系統(tǒng)作用規(guī)律,揭示烏頭類中藥毒效整合作用的科學內涵。

3 開展有毒中藥毒效網(wǎng)絡整合分析的問題和展望

有毒中藥的毒效網(wǎng)絡研究已在方法與技術上取得了較大進展,這類研究正逐步圍繞更多的有毒中藥開展,并對中藥的安全合理應用提供堅實的理論依據(jù)。在此基礎上,進一步開展方法學研究,讓基于有毒中藥的毒效網(wǎng)絡研究從“探索”走向“規(guī)范化”。此外,圍繞有毒中藥的有效性和安全性研究,應重視以下幾個方面,以取得更大的研究進展。

3.1 重視有毒中藥毒/藥效物質基礎和毒效相關性的研究 首先,毒性物質基礎及其機制研究是有毒中藥毒性研究的首要環(huán)節(jié),也是基于有毒中藥毒性成分開展中藥創(chuàng)新藥物研究的基礎。有毒中藥所含毒性成分的類型和含量決定毒性的大小,其使用劑量是決定有毒中藥是否毒害人體的重要因素。每一種中藥都有合理的使用劑量,有毒中藥也是如此,所以要客觀評價有毒中藥毒性成分的毒性作用與治療作用,充分認識有毒中藥的毒性物質基礎和藥效物質基礎,正確認識和充分了解含毒中藥毒性成分的毒性作用機制,才能以此為依據(jù)采用化學、生物手段進行中藥毒性成分的“存效減毒”或“增效減毒”。其次,中藥及其復方在臨床治療中有著“多成分、多靶標”的優(yōu)勢,能多通路對疾病狀態(tài)進行網(wǎng)絡調控,而在有毒中藥的運用中,也可能存在“多成分、多靶點”產生毒性反應的情況。因此,利用現(xiàn)代化學的提取、分離、純化技術,分離出有毒中藥的毒性成分,確定其化學結構,分別研究其毒/效作用機制,對于毒性成分和藥效成分可通過分離手段一分為二的毒性中藥,可以采取精簡成分的方法達到“存效減毒”的目的;對于毒效同時存在的成分,可以此作為先導化合物進行結構修飾及構效關系研究,尋找創(chuàng)新藥物,提高安全性和可控性。對于機制明確、靶點清楚的毒性成分,還可以借助現(xiàn)代計算機輔助藥物設計手段進行創(chuàng)新藥物設計,再結合不同的藥理、毒理模型評價其有效性和安全性。最后,由于中藥安全性事件的頻發(fā),當下對有毒中藥的研究多集中在其毒性成分上,但之所以要對有毒中藥進行研究,是因為其有良好藥效。因此,只開展毒性物質基礎及作用機制研究,一則容易讓人誤認為有毒中藥只有毒性或毒性被放大而不敢應用,二則在應用中容易讓人缺乏對其活性的認識和指導,用藥安全性提高了反而活性得不到應有的保證。而在毒性/藥效物質基礎的研究基礎上,開展毒效相關性研究,有利于確定毒性成分與活性成分的差異,為確定減毒保留藥效的工藝或制定安全有效劑量范圍的研究奠定基礎。

3.2 重視中醫(yī)藥“整體觀”科學理論對有毒中藥研究的科學指導 隨著生命科學的發(fā)展,很多疾病的分子機制得以闡明,基于這些機制的體外篩選方法或細胞系得以建立,特別是高通量篩選技術的推廣應用,大大提高了圍繞中藥活性成結構修飾得到的新藥先導化合物的篩選速度,但隨之而來產生了過分重視或局限于體外篩選和計算機虛擬篩選的趨勢,沒有再從整體水平進一步證實其藥理作用,所得到的研究結果難以保證其有效性[71]?；谥嗅t(yī)“整體觀”對于有毒中藥藥效物質代謝產物的研究有助于闡明中藥活性成分的毒性機制和藥理機制,如對烏頭堿的代謝產物分析有利于認識其毒性發(fā)生機制及更好地利用其毒性與活性的雙刃劍作用。一些在中藥藥效物質基礎研究中具有很好臨床療效的中藥活性成分,在科研工作中經(jīng)常會出現(xiàn)提純的化合物單體沒有生物活性的問題,這說明這種單體可能需要體內轉化激活才能具有生物活性;有些則是體外效果很好,但在被吸收之前就已被胃酸等破壞而失去作用。因此,在進行該活性成分衍生物的研究中,也應采用相應的生物轉化過程進一步研究其藥理活性和成藥性。否則,基于中藥的單體成分結構改造和構效關系研究的中藥新藥,與中藥比沒有特色,與化學藥比更沒有治療優(yōu)勢,容易形成“中藥單體成分開發(fā)熱”的誤區(qū)。對于普通中藥成分來說,存在著有/無活性成分在進入體內代謝后的相互轉化,而對于有毒中藥毒效成分來說,也存在著藥、毒效物質角色轉換機制:毒效成分/藥效成分進入體內代謝后可進行相互轉化,如苦杏仁苷口服給藥后在體內分解,產生為一種強烈的細胞毒性物質氫氰酸,可導致死亡。因此,在基于有毒中藥毒效成分的新藥研究時,也應該通過對有毒中藥毒效成分衍生物在病理模型體內代謝的研究,清楚藥物轉化過程,分析代謝機制,全面、客觀地進行臨床前安全性評價,為臨床上合理安全用藥提供足夠的理論依據(jù),減少不必要的不良反應。

3.3 重視生理、病理模型在有毒中藥研究中的應用 有毒中藥藥效與毒效成分之間存在著復雜的辨證關系,主要體現(xiàn)在以下幾方面:1)生、病理狀態(tài)對中藥“毒性”反應存在差異:健康機體對藥物的反應,在質或量上,往往與病理狀態(tài)機體的反應不同;2)不同病理狀態(tài)下藥、毒效物質基礎不同:有毒中藥在臨床上可治療不同的病證,也可導致不同的中毒表現(xiàn),其所含成分復雜是其原因之一,即在不同的病理狀態(tài)下發(fā)揮藥效(毒效)的成分可能不同;3)不同病理狀態(tài)下藥、毒效物質能發(fā)生角色轉變:有毒中藥的大多數(shù)成分并不是起單一作用的,藥、毒效物質也會根據(jù)應用的狀態(tài)不同而發(fā)生角色轉換,應用于不同生理病理狀態(tài)動物,特別是寒與熱、虛與實之類互相對立的病理模型,可能顯示完全不同的藥物反應,如中藥附子在用于寒證時發(fā)揮治療作用,然而應用于熱證時,則產生毒性作用;4)毒效成分成為藥效成分發(fā)揮效應的輔佐:有毒中藥的藥效成分在發(fā)揮治療作用時,一定毒效成分的存在可使其藥用發(fā)揮更佳。基于有毒中藥藥效成分和毒性成分的辨證統(tǒng)一關系,提示在有毒中藥研究的過程中也應該重視生理、病理以及不同病理狀態(tài)下的藥/毒理模型對毒效成分及其衍生物的反應。由于中藥毒性成分具有毒效雙重性的特點,其發(fā)揮效、毒作用存在生、病理狀態(tài)的差異性,對毒性成分的評價也應建立起符合中醫(yī)藥特色的有毒中藥的多項評價標準,這一評價體系既應體現(xiàn)對中藥毒效成分的毒性控制,亦應注意到毒效成分藥效的正常發(fā)揮。

4 結語

中藥的毒性是客觀存在的,但根據(jù)藥物的毒性、機體的生理病理狀態(tài)在臨床上加以合理應用則能獲得顯著的療效。如何通過有毒利用復雜生物網(wǎng)絡研究中藥網(wǎng)絡藥理學和系統(tǒng)毒理學,構建可靠的中藥藥效物質作用靶標相關的分子效應和毒性網(wǎng)絡,反映特定疾病狀態(tài)的相關生物實體的分子網(wǎng)絡及毒性機制,整合效應物質作用靶標網(wǎng)絡與疾病生物網(wǎng)絡,通過網(wǎng)絡拓撲學和動力學等方法分析“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡和“藥物-靶點-活性/毒性”網(wǎng)絡中有效物質與疾病、成分與毒性的相互作用關系,檢識出復雜網(wǎng)絡模型中的靶點組合、通路組合、子網(wǎng)組合、藥物組合等,并對預測的結果進行實驗驗證,是具有挑戰(zhàn)性和原創(chuàng)性的基礎研究工作,同時也為建立符合國際規(guī)范的有毒中藥的安全評價模式開拓了新思路。

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ThoughtandMethodologyofToxicity-efficacyNetworkIntegratedAnalysisofToxicAconitum

Han Bo, Huang Wei, Xie Xin, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Efficacy and safety are not only the solid foundation of traditional Chinese medicine (TCM)′s heritage and development, but also the fundamental premise of TCM serving the health of people in the world. Therefore, integrated analyzing the material basis, action mechanism and toxicity-efficacy relationship of Chinese materia medica′s efficacy and safety through multidisciplinary, in addition to revealing the scientific connotation “There is no death, drugs should be removed after recover.”, are the key problems to be solved in the process Chinese materia medica becoming one of the most important industries in the international market. Studying systems pharmacology and systems toxicology by utilizing complex biological networks, constructing reliable molecular effect and toxicological property networks related to Chinese materia medica targets, reflecting molecular network and toxic mechanism of related biological entity under specific disease state, integrating effect material active target networks and disease biological networks, analyzing relationships between active substance and disease, components and toxicity in “drug-target-disease” networks and “drug-target-activity/toxicity” networks using network topology and dynamics methodology, identifying target combination, pathway combination, subnet combination, drug combination, have highly improved the researching efficiency of Chinese materia medica complex pharmacodynamic substances. Mainly based on studies of Aconitum by the author′s group, this article illustrated approach to and methodology of toxicity-activity networks integrated analysis research on toxic Chinese materia medica.

Toxic Chinese materia medica; Aconitum; Toxicity-efficacy networks; Systems toxicology; Network pharmacology

國家自然科學基金重點項目(81630101);國家發(fā)改委標準化項目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學基金國家基礎科學人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產道地藥材綜合開發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項目(2016ZY008)

韓波(1981.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥及活性先導化合物的篩選、制備與構效關系研究,E-mail:hanbo@cdutcm.edu.cn

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評價與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.007

(2017-10-09收稿 責任編輯：王明)