閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國(guó).上海市民政第一精神衛(wèi)生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血miRNA的差異表達(dá)及臨床診斷價(jià)值

閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國(guó).上海市民政第一精神衛(wèi)生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

目的:研究非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血miRNA的差異表達(dá)及其診斷價(jià)值。方法:檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)篩選與非特異性精神發(fā)育遲滯相關(guān)的10種miRNA,按照病歷號(hào)隨機(jī)選取30例非特異性精神發(fā)育遲滯患者作為病例組,同時(shí)按照體檢號(hào)入組30例身心健康者作為對(duì)照組,入組后抽取靜脈血5ml,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病例組和對(duì)照成員10種miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果:①病例組與對(duì)照組比較年齡、性別、城鄉(xiāng)、獨(dú)生子女無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);②病例組與對(duì)照組比較miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);③ROC分析發(fā)現(xiàn),miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043)、miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)對(duì)特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價(jià)值。結(jié)論:miRNA-222和miRNA-223的異常表達(dá)對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷作用,可能與非特異性精神發(fā)育遲滯的發(fā)病機(jī)制有明顯關(guān)聯(lián)。

非特異性精神發(fā)育遲滯;微小RNA;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;外周血

精神發(fā)育遲滯按照臨床特征可分為非特異性精神發(fā)育遲滯(non—specific MR,NSMR)和智力低下伴有畸形(Specific MR,SMR)這兩大類(lèi)。SMR患者智力低下與畸形有明顯關(guān)聯(lián),NSMR只是智力低下,不伴有畸形,目前確切的病因不明。目前認(rèn)為,NSMR病因復(fù)雜,與環(huán)境和遺傳基因有明顯關(guān)聯(lián),其中遺傳是最主要的因素[1-2]。MiRNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA家族。約21～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,其基因轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物(pri-miRNA)在核內(nèi)被RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶切割成約70nt的發(fā)夾狀前體(pre-miRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)出核后。又被Droer酶切割成約22nt的miRNA,形成成熟miRNA。MiRNA具有較強(qiáng)的發(fā)育時(shí)序特異性[3]和組織特異性[4],在精神疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[5]。本研究選取30例非特異性精神發(fā)育遲滯患者和30例健康對(duì)照者進(jìn)行研究,分析miRNA在非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中的差異表達(dá),并進(jìn)一步分析差異表達(dá)的miRNA對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價(jià)值,以期為非特異性精神發(fā)育遲滯的研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 病例組 為2011年9月-2012年10月確診為非特異性精神發(fā)育遲滯的患者,符合以下入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn):由兩名精神學(xué)專(zhuān)家及心理學(xué)專(zhuān)家等組成的小組進(jìn)行病例討論,精神發(fā)育遲滯的診斷要求符合ICD-10診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)IQ小于60分。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在明確圍生期腦損傷史;②存在明確腦缺氧、缺血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及頭顱外傷等病史;③染色體核型存在異常;④經(jīng)體檢、生化代謝及頭顱影像學(xué)檢查等發(fā)現(xiàn)已知遺傳代謝性疾病及遺傳眭神經(jīng)變性疾病線索;⑤男性患兒存在脆性x綜合征的典型臨床表現(xiàn);⑥母孕期間存在明確酗酒、吸毒等不良嗜好病史;⑦合并其他精神疾病;⑧合并其他重大軀體疾病。按照上述入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)入組非特異性精神發(fā)育遲滯30例。

1.1.2 對(duì)照組 為當(dāng)?shù)蒯t(yī)院體檢證實(shí)為身心健康的人員。入組30例,均為漢族。

本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者或受試家屬(監(jiān)護(hù)人)均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 收集2 ml病人全血,放入抗凝管中。按照1:1比例,將血液緩慢加入Ficoll分離液中,2000rpm離心20min,收集單核細(xì)胞層。用PBS清洗單核細(xì)胞兩遍,加入1ml Trizol,用移液器吸打幾次。Trizol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù)。Trizol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。將勻漿樣品在室溫(15～30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置5分鐘。2～8℃13000×g離心15分鐘。樣品分為3層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用Trizol試劑的60%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相,進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1m L Trizol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。2～8℃13000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。用100%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 100%乙醇。2～8℃不超過(guò)7500×g離心5分鐘,棄上清。室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5～10分鐘即可,不要真空離心干燥,過(guò)于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無(wú)RNase的水或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,55～60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解, -70℃保存。取1μl RNA加入99μl dd H2O中,測(cè)定A260和A280處的吸光光度值,A260/A280必須介于1.9～2.0之間才可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證篩選的miRNA 使用TaqmanmiRNAPCRAssays進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè),具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,檢測(cè)儀器為ABI 7900 HT熒光定量PCR儀,熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95℃10 min,然后95℃15 S、60℃1 min,40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

全部數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0、MedCalc12.70統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。以miRNA與內(nèi)參U6之間閾值環(huán)(threshold cycle,Ct)之差計(jì)算ΔCT值,作為統(tǒng)計(jì)分析的指標(biāo)。對(duì)照和病例組一般情況除年齡采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)外,其它變量采用卡方檢驗(yàn);病例組和對(duì)照組miRNA表達(dá)水平的比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn),對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線,分析其對(duì)特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價(jià)值。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)顯著性檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對(duì)照組一般情況的描述和比較

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組年齡,結(jié)果表明,病例組和對(duì)照組的年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.279,P=0.782);運(yùn)用卡方分析比較病例組和對(duì)照組性別、城鄉(xiāng)、獨(dú)生子女的分布,結(jié)果表明,病例組和對(duì)照組的性別、城鄉(xiāng)、獨(dú)生子女分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 病例組和對(duì)照組一般情況比較(±s,n)

表1 病例組和對(duì)照組一般情況比較(±s,n)

項(xiàng) 目 病例組(n=30)對(duì)照組(n=30)t/χ2P年齡(歲) 31.49±10.86 30.61±11.32 0.279 0.782性別(女/男) 18/12 14/16 0.603 0.438城鄉(xiāng)(城市/農(nóng)村) 13/17 18/12 1.068 0.301獨(dú)生子女(是/非) 16/14 13/17 0.267 0.605

2.2 特異性精神發(fā)育遲滯患者與正常人的miRNA表達(dá)水平比較

對(duì)篩選出的10種miRNA,采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)分析其在病例組和對(duì)照組間的差異,表2表明,miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),miRNA-1、miRNA-1207-5p、miRNA-1228-5p、miRNA-3141、miRNA-4507的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 差異表達(dá)的miRNA對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯的預(yù)測(cè)價(jià)值

分別以非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中差異表達(dá)的miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363為檢測(cè)變量,試驗(yàn)分組為狀態(tài)變量(對(duì)照組為0,病例組為1),構(gòu)建ROC曲線,見(jiàn)表3和圖1。miRNA-222和miRNA-223對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價(jià)值(P＜0.05),miRNA-125b、miRNA-132和miRNA-363對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價(jià)值不明顯(P＞0.05)。

表2 病例組與對(duì)照組miRNA表達(dá)水平比較(±s)

表2 病例組與對(duì)照組miRNA表達(dá)水平比較(±s)

miRNA 病例組(n=30)對(duì)照組(n=30)Z P miRNA-1 4.023±1.587 5.573±3.786-0.767 0.443 miRNA-125b 5.410±1.380 7.962±3.747-2.043 0.041 miRNA-132 3.485±1.382 7.084±3.590-2.155 0.031 miRNA-222 2.344±1.400 6.038±3.060-3.915＜0.001 miRNA-223 -2.686±1.406 5.147±2.653-4.086＜0.001 miRNA-363 4.124±1.273 6.655±3.161-2.383 0.017 miRNA-1207-5p-0.218±0.116 1.240±0.247-1.873 0.061 miRNA-1228-5p-1.336±0.211-1.397±0.838 0.000 1.000 miRNA-3141 0.113±0.350 0.223±0.900 0.000 1.000 miRNA-4507 1.295±0.795 2.625±1.413-0.511 0.610

表3 差異表達(dá)的miRNA對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血差異表達(dá)miRNA的ROC曲線

3 討 論

精神發(fā)育遲滯(mental retardation,MR)是一組在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟(18歲)以前起病,依據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)生物、社會(huì)和心理因素是造成患者智力發(fā)育低于一般常人的主要因素,其中生物因素占79.2%[6]。MR是造成我國(guó)耳洞殘疾的首要影響因素,該疾病不僅對(duì)我國(guó)人口素質(zhì)提高不利,還給家庭、社會(huì)、國(guó)家?guī)?lái)沉重的負(fù)擔(dān)。非特異性精神發(fā)育遲滯(NSMR)又稱(chēng)非特異性弱質(zhì),是指不伴隨其它臨床體征的單純性智力低下。對(duì)NSM的患病程度進(jìn)行過(guò)分析發(fā)現(xiàn),NSMR存在著明顯的遺傳異質(zhì)性,遺傳占主要因素[7]。

miRNA在生物的各種生命過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能,如調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的時(shí)序調(diào)控過(guò)程,參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡,同時(shí)在造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的模式形成等過(guò)程中也扮演著重要的角色。miRNA在腦皮層發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,大腦皮層發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖、傳導(dǎo)通路的建立以及區(qū)域性分化均有miRNA參與并調(diào)控[8-9]。由此可見(jiàn),miRNA在大腦發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。miRNA與神經(jīng)細(xì)胞的分化也有著密切相關(guān),miRNA可以從細(xì)胞分化的起始就調(diào)控祖細(xì)胞分化為特定的神經(jīng)細(xì)胞,還能維持該神經(jīng)細(xì)胞的特征。有研究表明,miRNA不僅參與多種神經(jīng)功能調(diào)節(jié)[10],還與突觸可塑性有關(guān)[11]。由于MiRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分化以及神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)和突觸可塑性方面起著重要作用,因此MiRNA表達(dá)和調(diào)控的異?？赡芘c精神發(fā)育遲滯的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。脆性x綜合征與脆性X智力低下蛋白(FMXP, Fragile X MentalRetardation Protein)的缺失有明顯關(guān)聯(lián),外周血淋巴細(xì)胞FMRP免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)是兒童脆性X綜合征的一種可靠診斷和篩查方法[12]。研究發(fā)現(xiàn),FMRP可以通過(guò)某些特殊的m RNAS來(lái)調(diào)節(jié)miRNA[13],如miRNA-1和miRNA -281。唐氏綜合征即21三體綜合征,對(duì)唐氏綜合征的研究發(fā)現(xiàn),與21號(hào)染色體來(lái)源有明顯關(guān)聯(lián)的miRNAs可能引起患者腦部神經(jīng)生化的異常,21號(hào)染色體來(lái)源的miRNA失活可能是導(dǎo)致唐氏綜合癥的主要原因[14]。

本研究發(fā)現(xiàn),非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363顯著上調(diào)。這5種miRNA與非特異性精神發(fā)育遲滯的發(fā)生和發(fā)展可能有明顯關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn),脆性X智力低下蛋白(FMRP)可以通過(guò)miRNA-125b、miRNA-132調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)與精神發(fā)育遲滯的發(fā)生有明顯關(guān)聯(lián)[15]。Chen等人選取464名非特異性X連鎖精神發(fā)育遲滯患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照者比較x染色體相關(guān)聯(lián)miRNAs(miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363)的核苷酸序列有明顯改變,這些改變可能與患者智力低下有關(guān)[16]。趙林[17]等人,通過(guò)miRNA芯片掃描和選取部分差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-664a-5p,miRNA-1207-5p,miRNA-3141,miRNA-1228-5p,miRNA-4505顯著上調(diào)。本研究與正常對(duì)照者比較,非特異性精神發(fā)育遲滯患者外周血中miRNA-1207-5p,miRNA-3141和miRNA -1228-5p沒(méi)有明顯改變,可能與本研究選取的樣本是成人,而上述研究選取的是兒童有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

為了探究差異表達(dá)的miRNA對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯的診斷價(jià)值,本研究進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn):miRNA-222和miRNA-223對(duì)非特異性精神發(fā)育遲滯有一定的診斷價(jià)值,當(dāng)miRNA-222≤2.788CT時(shí),約登指數(shù)的最大值0.583,此時(shí)的敏感度為58.3%,特異度為100.0%;當(dāng)miRNA-223≤-2.275CT時(shí),約登指數(shù)的最大值0.667,此時(shí)的為敏感度66.7%,特異度為100.0%。該研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了,miRNA-222和miRNA-223在非特異性精神發(fā)育遲滯中可能扮演著重要的角色,具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The Differential Expression of MiRNA in Peripheral Blood of Patients with Non-specific Mental Retardation and Its Clinical Diagnostic Value

YAN Yan,GAO Hui,LV Zhensu,et al
First Mental Health Center of Shanghai Civil Ddministration,Shanghai 201105,China

Objective:To research the differential expression of miRNA in the peripheral blood of the non-specific mental retardation patients and analyze its diagnostic value for non-specific mental retardation.Methods:30 nonspecific mental retardation patients and 30 healthy controls were selected to measure the 10 miRNAs chosen from the domestic and international literature by real-time fluorescence quantitative PCR.Results:①There were no significant differences in age,gender,urban and rural between the control group and the case group(P＞0.05).②Compared with contrals,the expression levels of miRNA-125b,miRNA-132,miRNA-222,miRNA-223 and miRNA -363 were significant different in patients with non-specific mental retardation(P＜0.05);③ROC analysis showed that miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043),miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)could be used to distinguish non-specific mental retardation patients from healthy controls.Conclusion:The abnormal expression of miRNA-222 and miRNA-223 may have some diagnostic value to non-specific mental retardation,which may be related to the pathogenesis of non-specific mental retardation.

Non-specific mental retardation;MiRNA;Real-time fluorescence quantitative PCR;Peripheral blood

R749.05

A

1005-1252(2017)01-0004-04

10.13342/j.cnki.cjhp.2017.01.002

2016-08-06)