房華++++++汪瑞忠++++++張曉雪++++++楊柳++++++汪海剛

[摘要] 目的 研究中西藥聯(lián)合對多重耐藥銅綠假單胞菌（MDR-PA）抗菌作用，為臨床中西藥聯(lián)合治療MDR-PA感染提供依據(jù)。 方法 赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草、小檗堿，煎煮法制備提取液，采用兩倍稀釋法觀察中藥對細菌的抑菌效果；采用棋盤格稀釋法測定中西藥的MIC，通過計算部分聯(lián)合抑菌指數(shù)（FIC）的分布評價中西藥聯(lián)合效果。 結果 五種中藥對MDR-PA有不同程度抑菌作用，五倍子對MDR-PA抑菌作用最強；亞胺培南與小檗堿、頭孢他啶與五倍子聯(lián)合有較好的協(xié)同相加作用，協(xié)同相加率超過80%。環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。 結論 赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草、小檗堿對MDR-PA有不同程度抑制作用；亞胺培南與小檗堿、頭孢他啶與五倍子聯(lián)合可以增加各自對MDR-PA抗菌作用的敏感性。

[關鍵詞] 中西藥聯(lián)合；多重耐藥銅綠假單胞菌；抗菌活性；協(xié)同作用

[中圖分類號] R969.4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）31-0107-04

[Abstract] Objective To study the antimicrobial effect of integrated Chinese and western medicine on multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）， and provide the clinical basis for the integrated Chinese and western medicine treatment of MDR-PA infection. Methods Extract liquid from Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine was prepared by decocting method. The antibacterial effect of traditional Chinese medicine on bacteria was observed by double dilution method. The MIC of Chinese and western medicine was determined by checkerboard dilution method. The effect of integrated Chinese and western medicine was evaluated by calculating the distribution of partial fractional inhibitory concentration （FIC）. Results Five types of traditional Chinese medicine had different degrees of antibacterial effect on MDR-PA， in which the antibacterial effect of Chinese Gall on MDR-PA was the strongest； imipenem had a favorable synergistic effect with berberine， ceftazidime and Chinese Gall， and the synergistic rate combined was over 80%. Ciprofloxacin combined with the five Chinese herbs showed no effect； three types of antibiotics combined with five types of Chinese herbs had no antagonistic effect. Conclusion Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine have different degrees of inhibitory effect on MDR-PA. The combination of imipenem with berberine， ceftazidime and Chinese Gall can increase their susceptibility to antibacterial effect against MDR-PA.

[Key words] Integrated Chinese and western medicine； Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）； Antimicrobial activity； Synergistic effect

銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，也是院內(nèi)感染重要致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染、傷口感染、敗血癥等。隨著廣譜抗菌藥在臨床的廣泛使用，近年來多重耐藥銅綠假單胞菌分離率不斷上升，已成為臨床感染治療的難題。我國中醫(yī)中藥治療疾病已有千年歷史，不少中藥具有抗菌、抑菌活性、逆轉細菌耐藥性。為了研究中西藥聯(lián)合對多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa MDR-PA，）抗菌作用，本文選取五種抗菌作用較好的中草藥分別與臨床常用抗生素進行聯(lián)合藥敏試驗，旨在為臨床中西藥聯(lián)合治療MDR-PA感染提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法endprint

1.1 菌株來源

2015年5月～2016年12月臨床分離鑒定的30株MDR-PA（剔除重復分離菌株），30株臨床菌株通過法國梅里埃VITEK2-Compact鑒定與藥敏檢測。標本構成：痰液17株、尿液6株、傷口分泌物4株、血液3株（MDR菌株參照相關文獻[1] 的判斷標準）。質(zhì)控菌株：ATCC27853，購自上海市臨床檢驗中心。

1.2 中藥水煎劑

赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草（購自養(yǎng)和堂藥房），小檗堿（粉劑，中國藥品生物檢定所），M-H肉湯（購自上海伊華公司）、常用抗生素均由本院藥劑科提供。

1.3 方法

1.3.1 中藥原液的制備 分別稱取上述中藥50 g，按5倍量加入蒸餾水浸泡，4℃冰箱內(nèi)放置24 h后，加熱100 ℃ 30 min，過濾，將濾渣再加5倍水加熱100 ℃ 30 min。將兩次濾液混合加熱濃縮至50 mL，生藥含量為1 g/mL，調(diào)節(jié)pH為7.6，離心后留取上清，進行高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，參考穆廷杰[2]的中藥原液制備方法。

1.3.2 菌懸液制備 MDR-PA菌株復蘇后，從18～24 h 35℃培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑選幾個菌落于生理鹽水中，調(diào)到0.5麥氏濃度（1.5×108 CFU/mL），稀釋30倍，向兩倍稀釋好的藥液的1～11支試管加100 μL菌懸液，最終接種量為5×105 CFU/mL。

1.3.3 藥液的倍比稀釋 中草藥抗菌實驗采用中草藥抗菌實驗試管法，參照相關文獻[3]進行。藥液采用2倍稀釋法，即取72支無菌試管，每組12支編號，每管加1 mL肉湯；取上述中藥原液，先在第一管加1 mL，混勻后加入第二管中，以此類推，至第10管吸出1 mL棄去，使1～10管含有倍比稀釋的藥液為1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512，1：1024。

1.3.4 加菌 MDR-PA菌株復蘇后，從18～24 h 35℃培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑選幾個菌落于生理鹽水中，調(diào)到0.5麥氏濃度（1.5×108 CFU/mL），稀釋30倍，向兩倍稀釋好的藥液的1～11支試管加100 μL菌懸液，最終接種量為5×105 CFU/mL，第11管為陽性對照管，第12管不加菌為陰性對照管。

1.3.5 中草藥抗菌實驗結果判讀 35℃孵育18～24 h后觀察，陽性對照管長菌需呈渾濁狀，而肉湯空白對照管不長菌呈透明清亮狀，在此前提下觀察實驗組的渾濁情況，MIC 是用肉眼在試管中所見能完全抑制細菌生長的最低抗菌藥物濃度。

1.3.6 中西藥聯(lián)合藥敏試驗 聯(lián)合藥敏試驗采用棋盤格微量稀釋法檢測藥物的聯(lián)合作用，采用9個稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的4倍，依次倍比稀釋為1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256倍濃度，兩種藥物分別在96孔培養(yǎng)板上按縱列和橫列進行聯(lián)合。接種菌量為5×105 CFU/mL，35℃孵育18～24 h后觀察結果。

1.3.7 聯(lián)合抑菌效應判斷 根據(jù)部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）分布判斷聯(lián)合用藥效果。FIC的計算：FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用，其中MIC為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。結果判斷：（1）FIC指數(shù)≤0.5判定甲乙兩藥為協(xié)同作用；（2）0.52判定甲乙兩藥為拮抗作用。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，中西藥聯(lián)合與單獨使用時MIC數(shù)據(jù)為呈正態(tài)分布的計量資料，采用（x±s）表示，比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 中藥單藥抗菌作用

五種中藥對MDR-PA均有不同程度抑菌作用，抑菌效價為五倍子512～1024，魚腥草32～64，野菊花8～16，赤芍4～8，小檗堿2～4，抑菌作用強弱順序為五倍子>魚腥草>野菊花>赤芍>小檗堿。

2.2 中西藥聯(lián)合用藥時FIC指數(shù)分布

通過計算FIC值評價聯(lián)合藥敏試驗效果，得出30株MDR-PA對不同中西藥物組合時FIC指數(shù)分布。亞胺培南與小檗堿聯(lián)合效果最佳，60%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，40%菌株呈現(xiàn)相加作用，頭孢他啶與五倍子聯(lián)合有30%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，50%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，協(xié)同相加率超過80%。環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。見表1。

2.3 不同中西藥組合單獨與聯(lián)合使用情況下MIC值比較

頭孢他啶與五倍子組、亞胺培南與小檗堿組單獨與聯(lián)合使用情況下MIC值的比較，中西藥聯(lián)合時用藥量低于單獨使用時用藥量。采用配對t檢驗，兩者存在顯著性差異（P<0.05）。見表2。

3 討論

銅綠假單胞菌是革蘭陰性非發(fā)酵菌，是一種條件致病菌。隨著廣譜抗生素碳青霉烯類藥物在臨床廣泛及不合理應用，多重耐藥菌不斷增加甚至出現(xiàn)泛耐藥菌株[4]，MDR-PA存在金屬酶、外排泵、膜孔蛋白改變等復雜的耐藥機制，單一抗菌藥物治療往往失敗，尤其是泛耐藥銅綠假單胞菌需要多種藥物聯(lián)合治療[5，6]。新藥的研發(fā)速度遠跟不上細菌耐藥的速度，加之很多抗生素有很大的毒副作用，給臨床抗感染治療帶來極大困難[7]。中藥抗菌作用有著悠久的歷史，近年來的研究已經(jīng)表明，中藥的確有抗菌、延緩、消除細菌耐藥性的作用[8-10]。中藥的抗菌機制可以分為兩類，一類是通過各種途徑直接對細菌進行抑制；第二類是通過提高人體的免疫力來抗菌。對中藥提高人體免疫力抗菌的這種間接方式研究較少；目前專注于中藥藥物直接抗菌作用研究較多，也取得了許多成果。許多抗菌抑菌的中藥材，一種藥材中可能含有多種抑菌抗菌的活性成分，有多種抑菌抗菌的作用靶點，細菌不易對這樣的單一中藥材產(chǎn)生抗藥性突變[11]。某些中藥的抑菌成分，可能通過多條抑菌殺菌途徑起作用，也具有多種作用靶點，如金建玲等[12]發(fā)現(xiàn)小檗堿能與細菌核酸結合而具有抑制細菌DNA復制、RNA轉錄、蛋白質(zhì)翻譯等多項功能，能與細菌蛋白質(zhì)結合并因此干擾多種酶的活性[13]，還能增加細菌細胞膜的通透性[14]。近幾年，中藥逆轉耐藥機制作為中藥抗菌研究的一個新的鄰域悄然興起，也有了一定的成果，這就給醫(yī)療帶來巨大的想象空間，中藥聯(lián)合可否改變即將面臨無藥可用的尷尬局面？為了發(fā)揮中西藥在抗菌治療方面的各自優(yōu)勢，本課題從中西藥聯(lián)合使用角度來探索治療多重耐藥銅綠假單胞菌方法。

從本研究結果上看，五種中藥提取物對多重耐藥銅綠假單胞菌具有一定抗菌作用，與相關文獻[15]報道一致，五倍子抗菌效果最好，抑菌效價達到215～1024，抑菌作用由強至弱為：五倍子>魚腥草>野菊花>赤芍>小檗堿。對30株MDR-PA的中西藥聯(lián)合藥敏試驗，亞胺培南與小檗堿聯(lián)合效果最佳，協(xié)同相加率為100%，亞胺培南的藥物濃度平均降低至原來2/3，小檗堿的藥物濃度從275 mg/mL降至20.80 mg/mL（P<0.01）；頭孢他啶與五倍子聯(lián)合協(xié)同相加率為80%，頭孢他啶與五倍子藥物濃度平均降低至原來濃度1/2（P<0.05）；環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。中草藥蒸煮提取物成分復雜，使用劑量也比較大[16]，恰當?shù)闹形魉幝?lián)合將大幅提高中藥與西藥的抗菌抑菌能力。隨著科學技術的進步，中藥活性成分的提取物也得到迅速發(fā)展。提高中草藥活性成分的抗菌效價，必將使中藥在抗菌治療方面得到長足發(fā)展。發(fā)揮中西藥聯(lián)合使用在對抗細菌抗藥性方面的優(yōu)勢是目前抗菌治療的新的方向，中西藥配伍對臨床常見菌株有良好的體外抗菌作用[17]。中藥的水煎液與含藥血清與抗生素聯(lián)合使用均有較好的效果，石慶新等[18]發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)用可以大大提高亞胺培南對耐藥菌的抑菌和殺菌作用，這與本研究結果基本一致。中藥的成分復雜，在體內(nèi)可能通過各種代謝途徑發(fā)揮其抗菌作用，如促進細胞的抗原遞呈作用，增強吞噬細胞對細菌的吞噬能力；或發(fā)揮中藥的免疫調(diào)理作用，影響機體的健康狀態(tài)，進而對機體微生態(tài)造成影響。雖然本文利用中西藥對細菌的體外聯(lián)合藥敏試驗，反映中西藥對細菌的直接抗菌作用，但也可說明中藥的某些成分與西藥有協(xié)同抗菌作用。臨床實踐中，中西藥聯(lián)合治療疾病的例子有許多，如腸炎[19]、胃炎[20]、腎盂腎炎[21]、盆腔炎[22]等的治療。這也間接證明本研究中西藥聯(lián)合治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的可行性。

總之，中藥研究已經(jīng)成為人們關注的熱點，中藥的現(xiàn)代化也已列入國家中長期發(fā)展規(guī)劃。中西藥聯(lián)合使用成為緩解和控制細菌耐藥性難題的一條可行途徑。中西藥聯(lián)合在治療多重耐藥菌或泛耐藥菌感染方面也應該得到發(fā)展，這方面的研究應該得到關注。

[參考文獻]

[1] 李春輝.MDR、XDR、PDR多重耐藥菌暫行標準定義——國際專家建議[J].中國感染控制雜志，2014，13（1）：62-64.

[2] 穆廷杰，楊芬蘭，金海紅，等.連翹等中草藥對肺炎克雷伯菌抑菌作用的實驗研究及臨床應用[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（5）：19-21.

[3] 李建志，劉文麗，王亞賢.9種中草藥抗菌作用實驗研究[J].中醫(yī)藥學報，2012，40（1）：45-46.

[4] 張婧，孫恒彪，潘祖漢，等.1123株銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2015，（20）：3009-3011.

[5] 楊?；郏n立中，劉怡菁，等.亞胺培南聯(lián)合多粘菌素B對不同表型銅綠假單胞菌體外活性的研究[J].檢驗醫(yī)學，2013，28（1）：1-6.

[6] 許磊，季京淑，張慧川，等.銅綠假單胞菌多黏菌素異質(zhì)性耐藥及聯(lián)合藥敏研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2015，35（12）：869-874.

[7] 袁莉莉，丁百興，沈震，等.碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌感染的臨床研究[J].中國感染與化療雜志，2017，17（2）：121-126.

[8] Zhang GB，Gong SY，Yu DH，et al. Propolis and herba epimedii extracts enhance the non-specific immune response and disease resistance of Chinese sucker，myxocyprinus asiaticus[J]. Fish Shellfish Immunol，2009， 26（3）：467-472.

[9] 王潔，朱俊豪，張斌，等.能逆轉細菌耐藥性的中藥的篩選[J].中國藥學雜志，2014，49（21）：1892-1896.

[10] 潘杰，苗霞，劉啟波，等.12種中藥配方顆粒體外逆轉臨床常見細菌耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學，2016，31（6）：503-508.

[11] 崔煦然，趙京霞，郭玉紅，等.細菌耐藥背景下中藥抗菌作用研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（10）：1940-1944，

[12] 金建玲，徐軻，高培基.中西藥聯(lián)合使用在應對細菌抗藥性方面的優(yōu)勢[J].中醫(yī)藥學報，2011，39（4）：95-98.

[13] Kapp E，Whiteley C.Protein ligand interactions：Isoqui- noline alkaloids as inhibitors for lactate and malate dehydrogenase[J]. J Enzyme Inhib，1991，4：233-243.

[14] 彭齊，謝麗玲，謝俊.中藥抑菌機制的研究方法[J].生物技術進展，2015，5（1）：66-69.

[15] 左國營，韓峻，余巍，等.47種中草藥提取物的體外抗菌活性篩選研究[J].中國藥房，2005，16（10）：798-799.

[16] Tegos G，Stermitz FR，Lomovskaya O，et al. Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant antimicrobials[J]. Antimicrob Agents Chemother，2002， 46（10）：3133-3141.

[17] 張曉玲，于翠香.鹽酸小檗堿、黃岑苷與抗菌藥物聯(lián)用對多重耐藥鮑曼不動桿菌作用研究[J].中南藥學，2014，1（5）：411-414.

[18] 石慶新，呂小萍，於青峰，等.鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的體外藥敏實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（1）：114-117.

[19] 孫顯軍.芍藥湯加減聯(lián)合西藥治療潰瘍性結腸炎療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2017，26（4）：436-438.

[20] 張陽陽，郝微微，史佳寧，等.中西醫(yī)結合治療幽門螺旋桿菌相關性慢性胃炎研究進展[J].陜西中醫(yī)，2017，38（4）：543-544.

[21] 李宇鵬.中西醫(yī)結合治療腎盂腎炎臨床觀察[J].臨床研究，2017，25（2）：4-5.

[22] 徐麗華，李天洋.中西醫(yī)結合治療慢性盆腔炎的療效觀察[J].醫(yī)藥前沿，2015，15（18）：141-142.

（收稿日期：2017-08-12）endprint