漆 沄，謝 君，遲 旭，蔡華鋒，李衛(wèi)星 , 劉 媛,羅阿麗

1.西安市胸科醫(yī)院內(nèi)3科(西安 710100),2.西安市胸科醫(yī)院檢驗科(西安 710100),3.西安市胸科醫(yī)院病理科(西安 710100)

兩種γ-干擾素釋放試驗方法對結(jié)核性胸膜炎診斷價值的探討

漆 沄1，謝 君1，遲 旭1，蔡華鋒1，李衛(wèi)星1, 劉 媛2,羅阿麗3

1.西安市胸科醫(yī)院內(nèi)3科(西安 710100),2.西安市胸科醫(yī)院檢驗科(西安 710100),3.西安市胸科醫(yī)院病理科(西安 710100)

目的：探討酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)和全血γ-干擾素釋放試驗(QFT-GIT)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的臨床價值。方法：對90例結(jié)核性胸膜炎患者與50例非結(jié)核性胸膜炎患者外周血分別用ELISPOT和QFT-GIT兩種γ-干擾素釋放試驗進(jìn)行檢測，分析兩種檢測方法對結(jié)核性胸膜炎的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、陽性預(yù)測值以及陰性預(yù)測值。結(jié)果：ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而ELISPOT檢測的準(zhǔn)確性明顯大于QFT-GIT檢測，比較有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：ELISPOT和QFT-GIT兩種γ-干擾素釋放試驗用于結(jié)核性胸膜炎均有較好的診斷結(jié)果，但ELISPOT的準(zhǔn)確性更高，且成本低。

全血γ-干擾素釋放試驗(QFT-GIT)和T細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是γ-干擾素釋放試驗(IGRA)中檢驗結(jié)核菌的發(fā)熱兩種較成熟方法，但國內(nèi)對QFT-GIT與ELISPOT間的診斷結(jié)果研究很少，我院應(yīng)用QFT-GIT和酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)分別檢測結(jié)核性胸膜炎與非結(jié)核性胸膜炎患者血中γ-干擾素的表達(dá)，以評價這兩種方法在結(jié)核性胸膜炎診斷中的臨床價值。

資料與方法

1 一般資料 結(jié)核組患者選自我院2016年1月1日至2017年5月1日入我院治療的結(jié)核性胸膜炎90例患者，排除其他因素造成的胸腔積液，經(jīng)胸腔鏡活檢、胸膜針刺活檢、胸膜組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)核病變，且接受抗結(jié)核治療<2周。其中男51例，女39例；平均年齡(39.9±7.1)歲。非結(jié)核組患者選自同期我院呼吸及腫瘤內(nèi)科治的非結(jié)核性胸膜炎患者50例，經(jīng)檢查PPD結(jié)果為陰性，其中腫瘤性胸腔積液36例，肺炎旁積液10例，原發(fā)胸膜惡性病變4 例。腫瘤病理均經(jīng)過病理細(xì)胞學(xué)證實，其他疾病經(jīng)常規(guī)檢驗、影像學(xué)及療效等證實；其中男28例，女22例；平均(42.1±11.6)歲；排除存在結(jié)核病及結(jié)核接觸史患者。兩組一般情怳無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

2 方 法

2.1 ELISPOT檢測：無菌方法下采集患者靜脈血，室溫下即刻離心，分離外周血單個核細(xì)胞，將分離出細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基AIM-V中并調(diào)整濃度為2.5×106個/ml的細(xì)胞懸液。操作嚴(yán)格按照T細(xì)胞ELISPOT診斷試劑盒(南通表源生物技術(shù)有限公司)說明書執(zhí)行，即：每一細(xì)胞懸液樣本取PVDF板3孔，每孔注入100 μl，陰性對照內(nèi)加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)液50 ml，陽性對照內(nèi)加入植物血凝素(PHA)50 ml，檢測孔加入ESAT-6/CFP-10特異性抗原融合蛋白50 ml,輕輕震蕩、混勻，在37C 5%CO2培育箱中孵育16～20 h。進(jìn)行孵育、清洗、加生物素標(biāo)記抗體IFN-γ-biotion反應(yīng)、避光顯色等步驟，直至肉眼可見斑點形成后洗板以終止反應(yīng)，于通風(fēng)處自然晾干，孔內(nèi)紫色斑點用肉眼或酶聯(lián)斑點分析儀計數(shù)。結(jié)果判定：①陰性對照孔紫色斑點為0-5個，檢測孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥5個時，則結(jié)果為陽性；②陰性對照孔紫色斑點≥6個，檢測孔斑點數(shù)≥2倍的陰性對照孔斑點數(shù)時，則結(jié)果為陽性。

2.2 QFT-GIT檢測：采用QFT-GIT試劑盒(Cellestis公司)檢測。QFT-GIT試劑盒提供陰性對照管(陰性管)、陽性對照管(陽性管)、結(jié)核抗原管(抗原管)3種采血管，操作步驟按說明書進(jìn)行，即：靜脈采血，在6 h內(nèi)將肝素抗凝血加入以上3種管中，1 ml/管，振搖、混勻，豎直置于37C培養(yǎng)箱中培育24 h，離心后取上清液，用ELISA檢測并用Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)定量分析IFN-γ水平。結(jié)果判定：①陰性：當(dāng)陽性管>0.5 IU/ml,抗原管-陰性管<0.35 IU/ml時，②陽性：當(dāng)抗原管-陰性管≥0.35 IU/ml時；③不定：當(dāng)陽性管<0.35 IU/ml, 抗原管-陰性管<0.35 IU/ml或陰性管≥8.0 IU/ml時。分析ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。

結(jié) 果

ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而兩組在準(zhǔn)確性方面具有顯著性差異(P<0.05)，提示結(jié)核性胸膜炎診斷輔以ELISPOT檢測具有更高的臨床價值，見表1。

表1 兩組患者分別應(yīng)用ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測診斷結(jié)果比較

注：與ELISPOT組比，*P=0.019，?P=0.681，▲P=0.134，☆P=0.188，eP=0.505.

討 論

結(jié)核性胸膜炎是淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫疾病，感染者機體自身對結(jié)核菌有一定的抗性，有多種免疫細(xì)胞參與在機體免疫過程中，并能產(chǎn)生多種淋巴因子，如IL-2、γ-干擾素等[1]。γ-干擾素可促進(jìn)前體T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，提高Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力分泌多種細(xì)胞因子，并能活化機體單核細(xì)胞使其集聚至病灶，以防止感染的發(fā)展、散播，促進(jìn)肉芽腫的形成[2]。IGRA是近年來結(jié)核病診斷方面的一項重要突破，采用結(jié)核 菌抗原刺激PBMC產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞或病變部位免疫細(xì)胞分泌γ-干擾素，以評判是否有結(jié)核菌感染。T-SPOT.TB采用結(jié)核菌復(fù)合群差異區(qū)基因RDI(Rv3871-Rv3879c)中編碼的早期分泌的抗原靶(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)的多肽抗原，此外，QFT-GIT在以上基礎(chǔ)上還加用了RD11區(qū)TB7.7(Rv2654)的部分多肽，這些多肽抗原僅存于結(jié)核菌復(fù)合群中，特異性極高，但其合成成本高，限制了其在發(fā)展中國家及結(jié)核病流行國家中的應(yīng)用、推廣[3]。ELISPOT應(yīng)用的ESAT-6/CFP-10融合蛋白是通過基因工程合成而來，可大量生產(chǎn)，相對于多肽有明顯的價格優(yōu)勢，且與T-SPOT.TB的檢驗結(jié)果一致[4]，有好的檢驗效果。

本文結(jié)果顯示：兩種檢驗方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，而兩組在準(zhǔn)確性方面具有顯著性差異。此結(jié)果可能與兩者的檢測原理有關(guān)，ELISPOT檢測的是經(jīng)抗原刺激后可分泌γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞，而QFT-GIT檢測的是效應(yīng)T細(xì)胞分泌的γ-干擾素水平，但致病菌誘導(dǎo)的機體免疫應(yīng)答存在時效性，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子也存在時效性，因此ELISPOT輔助診斷具有更好的優(yōu)勢。無法尋找到細(xì)菌學(xué)依據(jù)已成為結(jié)核菌感染診斷的難題，而杜鳳嬌[5]等報道指出，機體只要有結(jié)核菌感染，就可通過測定機體細(xì)胞免疫功能評判結(jié)核菌的感染情況，避免了結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)因PPD與卡介苗交叉蛋白而造成的假陽性檢出。此外，本研究ELISPOT采用ESAT-6/CFP-10融合蛋白大大降低了臨床診斷費用，使結(jié)核菌感染的ELISPOT檢測在我國基層醫(yī)院普及成為可能。但I(xiàn)GRA也存在一定的缺陷，不能區(qū)分患者結(jié)核病是近期還是有既往感染史、活動性還是潛伏性，當(dāng)檢出為陰性時不能排除感染，又或是結(jié)核菌受機體免疫限制，但依然有可能發(fā)展成活動性結(jié)核病，因而IGRA常作為輔助檢測用于臨床診斷。

綜上，ELISPOT和QFT-GIT用于結(jié)核性胸膜炎均有較好的診斷結(jié)果，但ELISPOT的準(zhǔn)確性更高，且成本低，更適合臨床推廣。

[1] 劉紅艷，張 燕. 瀉肺逐飲方治療結(jié)核性胸膜炎療效觀察[J]. 陜西中醫(yī)，2014,35(10)：1286-1287.

[2] 王 君，李季春，陳瑞琳，等.內(nèi)科胸腔鏡檢查在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用價值[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014,43(7)：858-859.

[3] 張 娟，印 璞，孫炳奇，等. 對比研究ELISPOT與QFT-GIT對于結(jié)核病診斷的應(yīng)用價值[J]. 中國試驗診斷學(xué)，2013,17(10)：1839-1842.

[4] 王曉偉，程筱雯，張 焰，等. 結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達(dá)、純化及ELISPOT檢驗方法的建立與應(yīng)用[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,50(9)：1347-1350.

[5] 杜鳳嬌，傅 瑜，吳雪瓊，等. 結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼蛋白ELISPOT輔助診斷活動性結(jié)核病的應(yīng)用價值[J]. 臨床肺科雜志，2012,17(2)：264-266.

胸膜炎/診斷 @QFT-GIT @IGRA

R561.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.075

(收稿：2017-07-16)