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(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

復(fù)合酶法提取云芝多糖及其抗氧化活性

楊佳琦,冮潔*,冀春陽(yáng),朱淑珍,王紹嘉,毛亞明,林杉

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

云芝多糖,酶解法,提取條件,響應(yīng)面法,抗氧化活性

云芝(Coriolusversicolor),隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱,是一種藥用真菌,又名彩絨革蓋菌、云芝蘑等。云芝具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、消炎保肝、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化以及抗衰老等作用[1-5],是我國(guó)滿族醫(yī)藥中的一種特色藥材。著名的滿藥“復(fù)方木雞顆?！笔且栽浦橹魉幍闹苿?具有治療肝炎、肝纖維化、肝癌的作用。近年來(lái)人們對(duì)云芝的開發(fā)研究日益活躍,云芝逐漸成為中藥開發(fā)的研究熱點(diǎn)之一。

云芝多糖是云芝菌中重要的活性成分之一,目前云芝多糖遠(yuǎn)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求,一個(gè)重要原因是其提取得率較低,存在成本高、效益低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜的問題[6]。云芝多糖的提取方法大多采用傳統(tǒng)的熱水浸提法[7],此方法因?yàn)橛胁僮骱?jiǎn)單、條件易滿足的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用,但是其最大的缺點(diǎn)就是云芝多糖得率相對(duì)較低。研究表明采用超聲波提取法[8]、酶超聲波聯(lián)用提取法[9]、熱水浸提醇沉結(jié)合納濾膜法[10]、微濾超濾新工藝[11]等提取方法,可以提高云芝多糖的提取率。然而上述超聲波和超濾等提取方法要求設(shè)備復(fù)雜,較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。采用酶解法輔助提取云芝多糖,不僅可以提高云芝多糖的得率,而且設(shè)備簡(jiǎn)單,比較容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。本文采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解法輔助提取云芝多糖,通過響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)酶法提取的云芝多糖抗氧化活性進(jìn)行了研究,為云芝多糖的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云芝 產(chǎn)自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū);木瓜蛋白酶 江蘇銳陽(yáng)生物技術(shù)有限公司,活力:80000 U/g;纖維素酶 江蘇銳陽(yáng)生物技術(shù)有限公司,活力:50000 U/g;果膠酶 江蘇銳陽(yáng)生物技術(shù)有限公司,活力:100000 U/g;苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、檸檬酸、無(wú)水乙酸鈉、Tris-HCL溶液、硫酸亞鐵銨溶液、鄰二氮菲、過氧化氫、鄰苯三酚、鹽酸 均為分析純或化學(xué)純。

PL20電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH-S水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;UV-2800紫外分光光度計(jì) 龍尼柯(上海)儀器有限公司;中藥粉碎機(jī) 寧波新芝有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水式真空泵 鞏義市華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 云芝多糖的傳統(tǒng)熱水浸提法 提取工藝流程為:云芝→烘干→磨粉→稱取粉末2 g→熱水浸提(提取溫度80 ℃，時(shí)間5 h,料液比1∶30)→多糖浸提液→去雜蛋白→乙醇沉淀→檢測(cè)多糖含量[12]。

1.2.2 云芝多糖的酶法提取 挑選優(yōu)質(zhì)干燥的云芝,放入粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎,粉碎后的云芝過60目篩,精確稱取5.0 g,按照料液比1∶30 (g/mL)加入150 mL的去離子水,按照設(shè)定的酶解條件(pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度)進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn),復(fù)合酶比例為:木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1,然后在85 ℃的水浴鍋中浸提100 min,得到多糖浸提液,多糖浸提液經(jīng)過濾得到多糖上清液,測(cè)定多糖含量。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定 多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[13]。

多糖得率(%)=提取的多糖量(g)/提取的物料量(g)×100

1.2.4 多糖提取單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取粉碎樣品5.0 g,置于三角瓶中,按照料液比1∶30 (g/mL),加入150 mL的去離子水,將復(fù)合酶[14]的條件定為纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶的比例為1∶1∶1,分別考察不同酶濃度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、不同酶解時(shí)間(10、20、30、40、50 min)和不同酶解溫度(25、35、45、55、65 ℃)對(duì)云芝多糖得率的影響[15-17],其中各因子固定水平為酶濃度2.0%、pH4.5、酶解時(shí)間30 min、酶解溫度45 ℃。

1.2.5 云芝多糖復(fù)合酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將酶濃度、pH、酶解時(shí)間和酶解溫度為自變量,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,將多糖得率作為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,響應(yīng)面設(shè)計(jì)的四因素三水平如表1所示。

表1 云芝多糖提取響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis for Coriolus versicolor polysaccharides extraction

1.2.6 云芝多糖的抗氧化活性

1.2.6.1 清除羥自由基(·OH)活性實(shí)驗(yàn) 取十支10 mL刻度管,均依次加入1 mL的Tris-HCl溶液(pH8.20),0.3 mL硫酸亞鐵銨(5 mmol/L)和0.3 mL的鄰二氮菲溶液(7.5 mmol/L),1號(hào)和2號(hào)試管不加樣品,3～6號(hào)加入1 mL濃度分別0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,7～10號(hào)加入濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的VC溶液,1號(hào)試管不加入H2O2(7.5 mmol/L),2～10號(hào)試管加入H2O2。定容至刻度,在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h,用Tris-HCl溶液調(diào)零,在510 nm下測(cè)吸光度A,計(jì)算對(duì)·OH的清除率[18]。VC做陽(yáng)性對(duì)照,將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,求平均值。 ·OH清除率計(jì)算公式為:

·OH清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100

式中,A1為體系不加H2O2和多糖(抗氧化劑)的吸光值;A2為體系加H2O2而不加多糖(抗氧化劑)以后的吸光值;A3為體系加入H2O2和多糖(抗氧化劑)后的吸光值。

式中,Ao為體系未加多糖溶液(抗氧化劑)的吸光值;Ai為體系加入多糖溶液(抗氧化劑)的吸光值。

1.2.6.3 清除DPPH·效果的測(cè)定 取9個(gè)試管,1號(hào)為空白試管,加入2 mL無(wú)水乙醇和2 mL DPPH溶液。2～5號(hào)試管分別加入2 mL濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,四個(gè)試管都加入2 mL的DPPH,反應(yīng)0.5 h后在517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)i。6～9號(hào)試管分別加入2 mL濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,四個(gè)試管都加入2 mL的無(wú)水乙醇,反應(yīng)0.5 h后在517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)j。VC做陽(yáng)性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,求平均值。

DPPH自由基清除率[20]計(jì)算公式為:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/Ac×100

式中,Ai為體系加入DPPH和多糖溶液(抗氧化劑)的吸光值;Aj為體系加入多糖溶液而未加DPPH的吸光值;Ac為體系不加入多糖溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,所做實(shí)驗(yàn)均為三個(gè)平行樣品,取平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水浸提法對(duì)云芝多糖的提取

當(dāng)不加酶液,用傳統(tǒng)熱水浸提法提取云芝多糖時(shí),平均多糖得率為6.67%。

2.2 單因素對(duì)云芝多糖得率的影響

2.2.1 酶濃度對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知,當(dāng)酶濃度增加到2%時(shí),多糖得率達(dá)到8.73%,隨著酶濃度的進(jìn)一步增加,多糖的提取率并沒有增加,說明在該底物濃度下,酶濃度已經(jīng)趨于飽和,若繼續(xù)添加復(fù)合酶,對(duì)多糖的提取率沒有顯著的影響。因此,酶濃度初步選定為2%。

圖1 酶濃度對(duì)云芝多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 當(dāng)酶作用時(shí)間為40 min時(shí),酶與底物得到充分反應(yīng),此時(shí)云芝多糖的提取率最高。當(dāng)提取時(shí)間大于40 min后,多糖得率變化趨于平緩,酶解時(shí)間過長(zhǎng),酶的催化活性下降,進(jìn)而對(duì)多糖得率影響不大。因此,最佳酶解時(shí)間選定為40 min。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)云芝多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymlysis time on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.3 酶解pH對(duì)多糖得率的影響 如圖3所示,當(dāng)pH為3.5時(shí),云芝多糖的提取率最低,溶液的酸度過大抑制了酶的活性;當(dāng)pH為5.0時(shí),云芝多糖得率達(dá)到9.74%,之后,隨著pH增大,多糖的得率反而減小,這是因?yàn)閜H的升高影響了酶與底物的親和力,破壞了酶的活性,從而造成了多糖得率的下降。因此,pH為5.0時(shí)最佳。

圖3 pH對(duì)云芝多糖得率的影響Fig.3 Effect of pH on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

圖4 酶解溫度對(duì)云芝多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymlysis temperature on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 酶作用溫度對(duì)云芝多糖的提取影響如圖4所示,在 45 ℃之前,隨溫度的升高,多糖得率不斷增加,在45 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大,然后從 45～65 ℃提取率緩慢下降,可能是由于溫度過高,酶的活性降低,云芝多糖的提取率下降。因此,選擇復(fù)合酶作用溫度為45 ℃。

2.3 云芝多糖復(fù)合酶提取的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 采用響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖復(fù)合酶法提取條件 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以酶濃度、pH、酶解時(shí)間和酶解溫度4個(gè)因素為自變量,以云芝多糖得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共包括29組實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 云芝多糖提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface design for Coriolus versicolor polysaccharides extraction

表2中實(shí)驗(yàn)1～24為析因?qū)嶒?yàn),25～29為中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),其中析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。采用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析,方差分析結(jié)果見表3。

表3 云芝多糖提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design of Coriolus versicolor polysaccharides extraction

注:*:差異顯著(p<0.05);**:差異極顯著(p<0.01)。

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到云芝多糖得率對(duì)編碼自變量酶濃度、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=9.71-0.23A+0.50B+0.65C+0.61D-0.14AB-0.38AC+0.12AD+0.50BC+0.52BD+0.21CD-0.94A2-1.18B2-0.66C2-1.08D2

對(duì)模型進(jìn)行方差分析(表3),可以看出:p模型=0.024<0.05,表明模型顯著;多糖得率失擬項(xiàng)p=0.4674,表明失擬不顯著,所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn),得到模型一次項(xiàng)A差異顯著(p<0.05),一次項(xiàng)B、C、D差異極顯著(p<0.01),表明酶濃度、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間對(duì)多糖得率均有顯著影響。由方差分析F值可知,4 個(gè)因素在實(shí)驗(yàn)過程對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響順序?yàn)?C>D>B>A,即pH>酶濃度>酶解溫度>酶解時(shí)間。

2.3.2 云芝多糖的響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖如圖5所示。圖5直觀地給出了各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等值線分析圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出,在所選的范圍內(nèi)存在極值,既是響應(yīng)面的最高點(diǎn),同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。圖5中表明,B、C 的交互作用較強(qiáng)。在編碼值5.0以上的C在B很大的范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值,因子B(溫度)對(duì)響應(yīng)值的影響很大,這與ANOVA分析相吻合。A(時(shí)間)和C(pH),C(pH)和D(酶濃度)等值線近似圓形,可以知道它們之間的相互作用對(duì)云芝多糖得率的影響很小。同時(shí),B(溫度)和A(時(shí)間)、B(溫度)和D(酶濃度)、D(酶濃度)和A(時(shí)間)等因素等值線相對(duì)扁平,說明兩兩之間的相互作用強(qiáng),對(duì)云芝多糖的提取率有顯著影響。

圖5 酶濃度、酶解時(shí)間、pH和酶解溫度對(duì)云芝多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of effects of enzyme concentration,enzymlysis time,pH and enzymlysis temperature on the extraction rate of Coriolus versicolor polysaccharides

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證計(jì)算機(jī)擬合出得到最佳條件的值,回歸方程求解,即當(dāng)云芝多糖得率達(dá)到最大值時(shí)的提取條件為:酶解時(shí)間為36.93 min,提取溫度為51.64 ℃,pH為5.50,酶濃度為2.50%。為方便實(shí)際操作將實(shí)驗(yàn)條件定為:酶解時(shí)間37 min,提取溫度52 ℃,pH5.50,酶濃度2.50%。在上述最佳提取工藝參數(shù)下,進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn),所得多糖得率的平均值為9.58%,與回歸方程所得的多糖得率9.87%,相對(duì)誤差為3.03%。說明回歸方程能較真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)云芝多糖得率的影響,證明用響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖得率回歸模型較可靠,響應(yīng)面法對(duì)云芝多糖浸提條件的優(yōu)化是可行的,得到的復(fù)合酶法輔助提取云芝多糖的提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4 云芝多糖的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 云芝多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 由圖6可知,云芝多糖對(duì)羥自由基均具有一定的清除作用。當(dāng)云芝多糖濃度在0.1～0.5 mg/mL時(shí),清除率趨于穩(wěn)定的上升,當(dāng)濃度接近0.7 mg/mL時(shí),云芝多糖對(duì)羥自由基的清除率就趨于平穩(wěn)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí),維生素 C 對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到 72.42%,而云芝多糖對(duì)羥基自由基清除率為43.80%;因此云芝多糖與VC相比清除能力較弱,云芝多糖清除(·OH)的IC50為0.80 mg/mL,VC的IC50為0.33 mg/mL,云芝多糖具有較好的清除(·OH)的能力[21-22]。

圖6 云芝多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharides on hydroxyl radical

圖7 云芝多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharide on superoxide anion

2.4.3 云芝多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 由圖8可知,隨著質(zhì)量濃度的增加,云芝多糖溶液和VC對(duì)DPPH自由基清除率不斷增大,云芝多糖質(zhì)量濃度0.7 mg/mL時(shí),樣品溶液多糖對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到47.3%,具有較強(qiáng)清除DPPH自由基的能力,而VC在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL,對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到了91.7%,清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于云芝多糖。云芝多糖清除50% DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為0.75 mg/mL,VC的IC50為0.38 mg/mL。

圖8 云芝多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharide on DPPH radical

3 結(jié)論

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[22]劉燕,林瑞超,李波.云芝多糖抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 中成藥,2001(10):755-757.

ResearchonextractionprocessofCoriolusversicolorpolysaccharidesbycompoundenzymatichydrolysisanditsantioxidantactivity

YANGJia-qi,GANGJie*,JIChun-yang,ZHUShu-zhen,WANGShao-jia,MAOYa-ming,LINShan

(College of Life Sciences,Dalian Minzu University,Dalian 116600,China)

Coriolusversicolorpolysaccharide;enzymatic hydrolysis;extraction conditions;response surface method;antioxidant activity

2017-06-20

楊佳琦(1996-),女,本科生,研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail:745458518@qq.com。

*通訊作者:冮潔(1965-),女,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:gangjie@dlnu.edu.cn。

大連民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(XA201603105,201712026099);財(cái)政專項(xiàng)-中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(DC201501020101,DC201501020301)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)23-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.033