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(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

血水比例對羊血豆腐凝膠特性和品質(zhì)的影響

陳琳,張新笑,卞歡,吳海虹,孫沖,鄒燁,諸永志*,王道營,徐為民

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

血水比例是調(diào)控血豆腐口感品質(zhì)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)以湖羊血液為原料,按照血水比(v/v)1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6稀釋后制作血豆腐凝膠,從血漿纖維蛋白原濃度、動(dòng)態(tài)流變特性、微觀結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)、保水性等指標(biāo)的角度,研究血水比例對血豆腐凝膠特性和品質(zhì)的影響。結(jié)果表明:隨著血濃度降低,血豆腐儲(chǔ)能模量、損能模量弱化,凝膠強(qiáng)度呈下降趨勢,同時(shí)血豆腐凝膠蒸煮損失和離心損失增大,不易流動(dòng)水比例下降,水分向慢弛豫方向移動(dòng)。當(dāng)血水比<1∶3時(shí),凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降,水分易滲出,且不具有動(dòng)態(tài)流變特性,凝膠強(qiáng)度極弱;除彈性外,血豆腐硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性以及黏性均顯著降低。血水比≥1∶3時(shí)能較好地保持羊血豆腐凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和持水力,是制作血豆腐的適宜比例范圍。

羊血,血水比例,血豆腐,凝膠特性

羊血營養(yǎng)豐富,蛋白含量高達(dá)17%～22%,富含谷物類食品的第一限制性氨基酸-賴氨酸,且鐵元素含量高[1-2],是一種天然補(bǔ)血?jiǎng)?。另?羊血還含有多種無機(jī)鹽和微量元素[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,羊血具有止血、祛瘀、排毒等功效[2]。通常情況下,羊血制成羊血凝膠(又稱血豆腐)食用,因地域和飲食習(xí)慣的差異,消費(fèi)者對血豆腐品質(zhì)的需求有所不同,例如:北方偏愛厚實(shí)且有韌性的口感,常用芥末、胡椒等調(diào)味炒制血豆腐[4];而南方更喜爽嫩細(xì)滑,多在湯煲、火鍋中食用[5],而血水比例是制作血豆腐嫩度、口感的關(guān)鍵[6-7]。但是目前血豆腐規(guī)?；庸て髽I(yè)較少,諸多核心工藝參數(shù)基本依賴經(jīng)驗(yàn),制作過程中血豆腐常出現(xiàn)碎血、產(chǎn)品不成形等質(zhì)量問題,限制了血豆腐企業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。

目前僅有少量關(guān)于血豆腐加工工藝對凝膠質(zhì)構(gòu)特性和營養(yǎng)價(jià)值影響的研究[8-11],且多集中于鴨血豆腐和豬血豆腐等,有關(guān)羊血豆腐凝膠特性及品質(zhì)的研究較少。本研究從血漿纖維蛋白原濃度、動(dòng)態(tài)流變特性、微觀結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)、保水性等指標(biāo)變化的角度,探討血水比例對羊血豆腐凝膠特性和品質(zhì)的影響,以期利于對不同口感的血豆腐凝膠產(chǎn)品進(jìn)行研發(fā)和質(zhì)量控制,滿足消費(fèi)者的多元需求,同時(shí)為血豆腐加工企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取6頭6月齡、活體重為(45±5) kg健康商品湖羊(Ovis aries) 湖羊均為公羊并在同一條件下飼養(yǎng),于太倉市金倉湖食品有限公司宰殺并收集血液;凝血酶凍干品(2000 U) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;檸檬酸鈉、硫酸鈣、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、尿素等 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TVT 300XP質(zhì)構(gòu)儀 瑞典泰沃公司;PQ001低場核磁分析儀 上海紐曼電子科技有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8 國華電器有限公司;MCR301流變儀 奧地利安東帕公司;TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)有限公司;UV 6100紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊血豆腐凝膠的制備 新鮮血液迅速加入0.5%檸檬酸鈉,攪拌均勻后,部分新鮮血液以3000×g離心5 min,分離紅細(xì)胞后留存上層血漿,剩余血液4 ℃冷藏用于制作羊血豆腐凝膠。取4 ℃冷藏的抗凝羊血,以紗布過濾后定量置于成型容器中,將0.90% NaCl溶液(用去離子水配制)按血水比(v/v)1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6添加到羊血中攪拌均勻。0.20%硫酸鈣凝固劑與稀釋血液混合(w/v)進(jìn)行凝血交聯(lián),凝膠經(jīng)80 ℃水浴20 min,熟化為羊血豆腐。

1.2.2 血漿纖維蛋白原濃度含量測定 纖維蛋白原濃度測定參考Jocobsson法并稍作修改[12]。除鈣的抗凝血漿1.00 mL加入2.00 mL生理鹽水應(yīng)用緩沖液(1.50 mmol/L Na2HPO4·2H2O,6.50 mmol/L KH2PO4,pH6.35),與100 μL凝血酶(500 IU/mL)混合均勻后37 ℃溫育2 h。收集纖維蛋白凝塊,生理鹽水反復(fù)洗滌后用堿性尿素(400 g/L)溶解,于280 nm和315 nm波長處讀取吸光度。

1.2.3 動(dòng)態(tài)流變特性測定 測定方法參考Westphalen等[13]并做一定修改。羊血凝血激活后立即均勻涂布于測試平臺,平臺外蛋白與空氣接觸處用液態(tài)石蠟密封,測定頻率0.10 Hz,應(yīng)變2%,上下板狹縫1.00 mm,環(huán)境溫度25 ℃。升溫與保溫過程:10 ℃/min線性升溫至37 ℃,保溫20 min。繼續(xù)升溫至75 ℃,保溫20 min完成流變測定,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組測定6個(gè)重復(fù),3個(gè)平行。測定指標(biāo)為流變儲(chǔ)能模量G′,損能模量G″,相位角δ。

1.2.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察 通過掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)的方法觀察羊血生凝膠的微觀結(jié)構(gòu),方法參考徐舶[14]等將樣品切成約0.50 cm×0.50 cm×0.50 cm的薄塊,薄塊浸泡在2.5%戊二醛中(20.00 mmol/L磷酸緩沖液溶解,pH7.20)固定,經(jīng)磷酸緩沖液反復(fù)沖洗,梯度乙醇脫水,100%丙酮置換,超臨界CO2干燥儀干燥后附著于金箔,EVO-LS10掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.5 保水性測定

1.2.5.1 蒸煮損失的測定 參照陳振林等人[15]的方法,稍作修改。稀釋羊血與0.20%硫酸鈣凝固劑(w/v)混合后凝血交聯(lián),記錄羊血生凝膠重量M1。 凝膠塊中心插入溫度記錄儀,羊血凝膠經(jīng)80 ℃水浴熟化至中心溫度72 ℃,流水冷切后吸干凝塊表面水分,記錄血豆腐重量M2，蒸煮損失(%)=(M1-M2)/M2×100。

1.2.5.2 離心損失的測定 參考Trout等[16]方法,稱取10.00 g左右血豆腐凝膠裝填于離心管中,記錄離心前樣品重量M1,4 ℃下10000 g離心10 min。離心結(jié)束后,倒去上層水分后稱重,并記錄離心后重量M2，離心損失(%)=(M1-M2)/M2×100。

1.2.5.3 低場核磁共振弛豫時(shí)間T2測定 低場核磁共振(Low-Field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)測定參數(shù)參考Han[17]和Wang[18]的設(shè)定并作一定修改。準(zhǔn)確稱取2.00 g血豆腐,25 ℃穩(wěn)定30 min,每個(gè)處理測定6個(gè)重復(fù),每個(gè)樣品取5個(gè)平行。測定參數(shù)為:核磁共振主頻率22.6 MHz,回波時(shí)間τ值為250 s,重復(fù)掃描16次,重復(fù)采樣等待時(shí)間7.50 s得到12000個(gè)回波個(gè)數(shù)。利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列[19-20]測定自旋-自旋弛豫時(shí)間T2,測定結(jié)果采取多元模型軟件MultiExp Inv Analysis反演分析。

1.2.6 質(zhì)構(gòu)特性測定 質(zhì)構(gòu)測定方法參考Shiranita等[21]并針對血豆腐產(chǎn)品的特點(diǎn)稍加修改。將血豆腐切成直徑20.00 mm,高10.00 mm的圓柱體,每個(gè)處理組測定6個(gè)重復(fù),每個(gè)樣品取三個(gè)平行。測定時(shí)環(huán)境溫度為25 ℃,測試前速度為2.00 mm/s,測試速度1.00 mm/s,測試后速度1.00 mm/s,試樣變形壓縮比50%,兩次壓縮中間間歇5 s,測定結(jié)果經(jīng)TVT-300XP數(shù)據(jù)軟件分析得出硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性、彈性、黏性等5個(gè)主要指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.1軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,處理組間采用Duncan’s方差檢驗(yàn),每個(gè)處理組測定6個(gè)重復(fù),差異顯著水平為p<0.05,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血水比例對血漿纖維蛋白原濃度的影響

纖維蛋白原是形成羊血凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要蛋白之一。隨著血水比例降低,羊血漿纖維蛋白原濃度線性下降(圖1),血水比與血漿纖維蛋白原濃度呈正相關(guān)。當(dāng)血水比<1∶3時(shí),血漿纖維蛋白原濃度<0.8 g/L,形成的纖維蛋白凝塊水分極易滲出,較為稀軟、彈性弱。而纖維蛋白原濃度高的羊血漿由于加熱交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密,束縛水分能力更強(qiáng),形成的凝膠更加穩(wěn)定。

圖1 血水比例對羊血漿纖維蛋白原濃度的影響Fig.1 Effect of ratios of blood to water on fibrinogen content of sheep blood

2.2 血水比例對熱誘導(dǎo)凝膠動(dòng)態(tài)流變特性的影響

動(dòng)態(tài)流變測定中貯能模量(G′)和損能模量(G″)分別是蛋白膠體的彈性和粘性響應(yīng)。由圖2 可知,隨著加熱時(shí)間增加,37 ℃保溫期G′和G″逐漸增大且G′增加速率較快,體系以彈性響應(yīng)為主向凝膠轉(zhuǎn)化。血水比1∶0時(shí)G′和G″最大,血水比例下降能不斷弱化G′和G″,相對粘彈性tanδ呈上升趨勢。75 ℃升溫期,羊血流體結(jié)構(gòu)隨著溫度升高逐漸破壞,純粹的彈性不被維持,黏性性質(zhì)得以表現(xiàn),凝膠向著穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)化。不同血水比例G′和G″在75 ℃保溫后趨于穩(wěn)定,血水比1∶0時(shí)血豆腐凝膠強(qiáng)度大,具有最大黏性。隨著血水比例下降,血豆腐凝膠強(qiáng)度依次下降,而不同血水比例血液由流動(dòng)態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變的幅度變化不大,相位角(δ)最終值都小于10,血水比例對75 ℃保溫期δ無影響。當(dāng)血水比<1∶3時(shí),凝膠體系不具有特征動(dòng)態(tài)流體變化,所體現(xiàn)的凝膠強(qiáng)度極弱,因此圖2顯示血水比≥1∶3時(shí)的動(dòng)態(tài)流變結(jié)果。

圖2 血水比例對羊血熱誘導(dǎo)凝膠流變特性的影響Fig.2 Effect of ratios of blood to water on the rheology property of sheep blood gel注:圖A～C分別對應(yīng)羊血凝膠儲(chǔ)能模量、損能模量以及相位角的變化。

2.3 血水比例對凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

隨著血水比例下降,血凝膠出現(xiàn)白色蛋白溶出物,且視野下除紅細(xì)胞外白色蛋白溶出物逐漸增多。羊血紅細(xì)胞形變加劇,由細(xì)胞膜表面光滑的圓盤狀向類似于神經(jīng)-棘狀紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變,其特征為紅細(xì)胞膜表面有數(shù)量不等的鈍圓形棘狀突起或細(xì)胞邊緣出現(xiàn)鈍齒狀隆起,細(xì)胞學(xué)形態(tài)逐漸模糊。同時(shí)束縛于纖維蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中血細(xì)胞數(shù)量減少,經(jīng)熱誘導(dǎo)后蛋白變性,結(jié)構(gòu)展開并發(fā)生分子間交聯(lián)形成凝膠。血水比例下降使得凝膠內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密性下降,由緊致結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為疏松結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖3 血水比例對羊血凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響(5000×)Fig.3 Effect of ratios of blood to water on the ultrastructure of sheep blood gel(5000×)注:A～G分別對應(yīng)血水比1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6時(shí)微觀細(xì)胞學(xué)形態(tài)變化;標(biāo)尺表示2 μm。

表1 血水比例對羊血豆腐低場核磁共振特性的影響Table 1 Effect of ratios of blood to water on the water relaxation time and population of sheep blood tofu gel

注:同行平均值數(shù)據(jù)上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);T2b,T21對應(yīng)結(jié)合水、不易流動(dòng)水橫向弛豫時(shí)間;P2b、P21對應(yīng)結(jié)合水、不易流動(dòng)水相對含量。

表2 血水比例對羊血豆腐質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of ratios of blood to water on texture characteristics of sheep blood tofu gel

注:同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。2.4血水比例對羊血豆腐凝膠持水力的影響

2.4.1 血水比例對羊血豆腐凝膠蒸煮損失的影響 由圖4可知,隨著血水比例下降,血豆腐蒸煮損失顯著增加(p<0.05),至血水比1∶6時(shí)血豆腐蒸煮損失高達(dá)43.51%,相較于血水比1∶0血豆腐,蒸煮損失增加了4.70倍。

圖4 血水比例對羊血豆腐凝膠蒸煮損失的影響Fig.4 Effect of ratios of blood to water on cooking loss of sheep blood tofu gel

2.4.2 血水比例對羊血豆腐凝膠離心損失的影響 分析圖5可知,隨著血水比例下降,血豆腐離心損失不斷增加。血水比1∶6時(shí)血豆腐離心損失高達(dá)87.12%,相較于血水比1∶0羊血豆腐凝膠,離心損失增加了1.22倍。

圖5 血水比例對羊血豆腐凝膠離心損失的影響Fig.5 Effect of ratios of blood to water on centrifuging loss of sheep blood tofu gel

2.4.3 血水比例對羊血豆腐凝膠低場核磁共振性質(zhì)的影響 表1顯示,T2擬合后血豆腐呈現(xiàn)不易流動(dòng)水和結(jié)合水兩個(gè)峰,自由水低弛豫時(shí)間的峰不能被檢出。隨著血水比下降,血豆腐P21含量呈下降趨勢,T21和T2b顯著增加(p<0.05),水分逐漸朝慢弛豫方向移動(dòng),保水性呈下降趨勢。

2.5 血水比例對羊血豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表2可知,純血加入等比例水后,血豆腐硬度、咀嚼性以及黏性大幅下降,隨著水的繼續(xù)加入,使得血豆腐硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性以及黏性進(jìn)一步顯著下降(p<0.05),而彈性不受血水比影響(p>0.05)。相對于血水比1∶0血豆腐,血水比1∶6血豆腐硬度值下降89%,咀嚼性下降93%,內(nèi)聚性下降42%。血水比<1∶3時(shí)血豆腐會(huì)出現(xiàn)起孔、碎血、產(chǎn)品不成形等問題,不適于血豆腐產(chǎn)品制備。

3 討論

動(dòng)物血漿蛋白中,可溶性纖維蛋白原在凝血酶催化下變?yōu)椴蝗苄缘鞍?纖維蛋白單體之間以共價(jià)鍵形成膠體骨架,網(wǎng)羅血細(xì)胞和水分形成膠凍狀的血塊[22],對血凝膠形成起主要作用[23-25]。血塊的強(qiáng)度和持水力不僅反映纖維蛋白的凝固狀態(tài),也是體現(xiàn)血豆腐產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。Ockerman認(rèn)為[26]血漿蛋白凝膠的蛋白質(zhì)最少濃度約4%～5%,本實(shí)驗(yàn)中隨著血水比例下降,纖維蛋白濃度降低,當(dāng)血水比<1∶3時(shí),血漿纖維蛋白原濃度<0.8 g/L,是膠凝能力較弱的低濃度纖維蛋白原[27],形成的纖維蛋白凝塊水分極易滲出,較為稀軟、彈性弱。結(jié)合SEM圖推測,血液不斷稀釋使得血凝膠網(wǎng)絡(luò)中致密性下降,內(nèi)部膠凝能力逐漸弱化,粘附性不斷減小。當(dāng)血水比<1∶3時(shí),纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)極易被破裂,此時(shí)凝膠已不具流體動(dòng)態(tài)特性,水分在凝膠網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)性變大,在遭受離心力時(shí),離心損失顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)中隨著血水比例降低,不易流動(dòng)水含量下降,不易流動(dòng)水和結(jié)合水橫向弛豫時(shí)間增加。一方面,血濃度下降使得弛豫時(shí)間對應(yīng)的質(zhì)子密度降低,自由水向不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)化的比例下降;另一方面,凝膠結(jié)構(gòu)能夠阻礙水的空間移動(dòng),對應(yīng)水組分的弛豫時(shí)間延長[28-29]。凝膠水分狀態(tài)的變化與羊血豆腐保水性密切相關(guān),血水比例降低使得羊血豆腐保水性降低。此外,血豆腐的質(zhì)構(gòu)直接影響產(chǎn)品嫩度、口感以及出品率等[30-31]。血水比例變化引起血豆腐結(jié)構(gòu)變化,羊血豆腐質(zhì)構(gòu)特性不同。隨著血水比例下降,由離心損失、蒸煮損失以及LF-NMR反映的血豆腐保水性降低,表現(xiàn)在質(zhì)構(gòu)上即血豆腐硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性以及黏性下降。張佳敏等人[7]研究發(fā)現(xiàn),凝膠的硬度、咀嚼性和持水力隨著豬血濃度降低顯著下降,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。楊芳[32]發(fā)現(xiàn)大豆豆腐凝膠網(wǎng)格含水處于飽和狀態(tài)時(shí)其硬度和彈性較低,含水較多的大豆豆腐并未處于最佳品質(zhì)狀態(tài)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)構(gòu)和保水性結(jié)果可推測,在評價(jià)羊血豆腐品質(zhì)時(shí)也存在類似情況,即適當(dāng)血水比例可改善血豆腐品質(zhì)狀態(tài)。此外,水分過量添加會(huì)有效促進(jìn)紅細(xì)胞破裂溶出血紅蛋白。本實(shí)驗(yàn)表明血漿纖維蛋白原確有參與膠凝過程,且隨著血水比例下降膠凝能力逐漸弱化,而血紅蛋白參與血豆腐凝膠生成的途徑以及對品質(zhì)的影響仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

血水比例下降能夠降低參與凝膠形成的纖維蛋白原濃度,弱化羊血豆腐凝膠強(qiáng)度,羊血豆腐保水性變差;同時(shí)羊血豆腐凝膠結(jié)構(gòu)變化其質(zhì)構(gòu)特性不同,血水比例過低時(shí)形成的羊血豆腐較為稀軟,易碎。因此,合理的血水比例是決定羊血豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)和保水性的關(guān)鍵。血水比≥1∶3時(shí)羊血豆腐具有較好的凝膠特性,對此范圍內(nèi)的血水比進(jìn)行調(diào)控可制作出不同嫩度、口感豐富的羊血豆腐產(chǎn)品,有利于滿足消費(fèi)者的多元需求。

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Effectofratiosofbloodtowaterongelpropertiesandqualityofsheepbloodtofugel

CHENLin,ZHANGXin-xiao,BIANHuan,WUHai-hong,SUNChong,ZOUYe,ZHUYong-zhi*,WANGDao-ying,XUWei-min

(Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China)

Ratios of blood to water is the key factor influencing the texture quality of blood tofu gel. Hu sheep blood was mixed with saline to make blood tofu gel in ratios of 1∶0,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5 and 1∶6. Then plasma fibrinogen levels,dynamic rheological properties,ultrastructural changes were measured to reveal the ratios of blood to water on gel properties and quality changes of sheep blood tofu gel. The results showed that with the fall of blood concentration,the storage moduli and loss moduli of blood tofu gel decreased and its strength tend to be weak,meanwhile the cooking loss,centrifuging loss and relaxation time increased and immobilized water decreased. When the ratio of blood to water was great than or equal to 1∶3,fibrin gel showed fragile and soft structure and blood tofu gel was not with typical dynamic fluid characteristics leading to more water exudate,the texture characteristics of blood tofu gel showed a remarkable falling of hardness,chewiness,cohesiveness,but elasticity was not affected. When the ratio of blood to water was more than 1∶3,it was conducive for maintaining the texture characteristics and water holding capacity,which was more suitable to make sheep blood tofu gel.

sheep blood;ratios of blood to water;blood tofu gel;gel properties

2017-07-06

陳琳(1992-)，女，碩士，研究方向：畜禽產(chǎn)品加工，E-mail：njauchenlin@163.com。

*通訊作者:諸永志(1975-)，男，碩士，研究員，研究方向：畜禽產(chǎn)品加工，E-mail：yongzhizhu@163.com。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金(CX(15)1007)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31601405)。

TS251

A

1002-0306(2017)23-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.002