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(重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,重慶 401331)

大孔吸附樹脂法分離純化紅景天中洛塞維

楊清林,葛靜秋

(重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,重慶 401331)

本文采用大孔吸附樹脂法對(duì)紅景天中洛塞維(Rosavin)分離純化進(jìn)行了研究,建立了如下工藝條件:Rosavin檢測(cè)的高效液相(High performance liquid chromatography,HPLC)最佳的流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v),最佳柱溫為30 ℃;選用非極性樹脂D312,最大吸附量上樣濃度為0.24 mg/mL,裝柱高度為30 cm,粗品最大上樣量為4 BV,上樣流速為1～2 BV/h,洗脫劑為50%乙醇溶液。大孔吸附樹脂分離純化目的物Rosavin的含量由3.00%提高到了68.76%。大孔吸附樹脂法分離純化洛塞維的工藝條件合理,節(jié)約成本、收率高,適合工業(yè)應(yīng)用。

紅景天,洛塞維,高效液相,大孔吸附樹脂,分離純化

紅景天也叫黃金根、玫瑰根、北極玫瑰,拉丁名Rhodiolasaera,為景天科多年生草本植物[1]。現(xiàn)代醫(yī)藥研究表明[2],玫瑰紅景天具有多種生物活性,包括抗菌、抗癌[3-4]、抗抑郁、抗焦慮[5-6]、抗炎、抗糖尿病[7-8]、抗疲勞[9]、抗氧化以及促進(jìn)肝的再生的功能,此外,還具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力。洛塞維(Rosavin)是紅景天中的獨(dú)特活性成分,并且只存在于紅景天科玫瑰紅景天(拉丁名RhodiolaRosea)中[10],具有增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)心血管等多種功能[11]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于紅景天中洛塞維的分離純化研究較少,Dubichev AG等[12]首先建立對(duì)Rosavin的HPLC檢測(cè),并證明了Rosavin在放置過程中容易被酵解。王曙等[13]建立的HPLC法分析了紅景天屬植物根莖中Rosavin的含量并進(jìn)行了相應(yīng)的含量測(cè)定,同時(shí)驗(yàn)證了Rosin和Rosarin的存在,崔晉龍等[14]HPLC法測(cè)定大花紅景天中Rosavin的含量。目前對(duì)Rosavin的分離純化主要采用溶劑萃取結(jié)合硅膠柱層析和大孔吸附樹脂分離這兩種方法。馬朝陽等[15]通過對(duì)HPD系列、AB-8、D101、LSA-10等幾種大孔吸附樹脂的篩選發(fā)現(xiàn),非極性樹脂更有利于Rosavin的分離純化。黃海松等[16]使用色譜樹脂來制備高純度的紅景天苷,Han等[17]使用高速逆流層析直接得到了高純度的紅景天苷和Rosavin。但這兩種方法對(duì)于原料和設(shè)備的質(zhì)量要求高,過程繁瑣,原料的消耗和產(chǎn)物的損耗很大,在工業(yè)應(yīng)用中受到限制。

大孔吸附樹脂作為一種新型的分離純化樹脂而具有節(jié)約成本、過程優(yōu)化以及高收率等特點(diǎn),本文旨在通過對(duì)Rosavin HPLC條件的建立、大孔吸附樹脂的篩選以及其層析過程條件優(yōu)化的研究,建立一條適用于應(yīng)用大孔吸附樹脂分離和純化Rosavin的工藝路線,為工業(yè)上分離純化Rosavin的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Rosavin對(duì)照品(純度≥95%) 購(gòu)自上海時(shí)代生物科技有限公司;Rosavin粗品(主要含Rosavin≥3%、Rosarin和Rosin>1%) 購(gòu)自西安普萊特生物工程有限公司;乙腈(HPLC純,500 mL/瓶)、磷酸(HPLC純,500 mL/瓶) 均購(gòu)自科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(HPLC純,500 mL/瓶) 購(gòu)自重慶川東化工集團(tuán)化學(xué)試劑廠;乙醇(工業(yè)級(jí)) 購(gòu)自重慶納漫生物科技有限公司。

HPLC色譜分析儀(P230II型色譜系統(tǒng)) 大連依利特分析儀器有限公司;D101、LX-11、LSA-21樹脂 西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司;HPD-100、HPD-300樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司;D312樹脂 山東魯抗生物制造有限公司;SHZ-A水浴恒溫振蕩器 海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;層析柱0×50 cm 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;BT100-1J蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制 對(duì)照品和供試品的配制:精密稱定10 mg Rosavin對(duì)照品,在10 mL容量瓶中用超純水定容,搖勻,放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?其濃度為1 mg/mL。稱取Rosavin粗品1 g,超純水溶解成1 mg/mL的溶液,搖勻后放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 流動(dòng)相的配制 配制六種不同種類的流動(dòng)相:分別將色譜純度的磷酸溶液配制成體積百分比為0.05%、0.06%、0.15%和0.2%的磷酸溶液,與色譜純度的甲醇按照88∶12、95∶5、90∶10、80∶20、14∶86和43∶65的體積比例進(jìn)行混合[18],過0.25 μm的微孔有機(jī)濾膜后超聲除氣15 min。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Hyper ODS2 C185 μm 4.6×200 mm,流速:1 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm,洗脫梯度:等度洗脫。

1.2.4 流動(dòng)相的篩選 分別用六種不同的流動(dòng)相對(duì)Rosavin標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),對(duì)照這六種流動(dòng)相下的峰面積、峰型以及出峰時(shí)間等,初步篩選出優(yōu)化的流動(dòng)相條件。將柱溫控制在30 ℃的平均水平,對(duì)于30 ℃上下的兩種溫度27 ℃和35 ℃進(jìn)行比較。在這些流動(dòng)相條件下對(duì)Rosavin粗品進(jìn)行檢測(cè)。分別對(duì)比Rosavin對(duì)照品和粗品的色譜圖結(jié)果,篩選出最佳流動(dòng)相條件。

1.3 樹脂的篩選

稱取Rosavin粗品33.0 g,用330 mL純凈水溶解配制成0.1 g/mL溶液后進(jìn)行10 min離心(5000 r/min),放入4 ℃冰箱中備用。根據(jù)Rosavin的性質(zhì)選取六種比較常見的非極性或者弱極性的大孔吸附樹脂。稱取活化后的樹脂5 g(干重)左右,放入50 mL有塞錐形瓶中,分別向其中加入50 mL左右的Rosavin粗品溶液,放置于水浴搖床進(jìn)行搖床靜態(tài)吸附,吸附2 h達(dá)到平衡后,過濾出得到吸附液。HPLC法測(cè)定每瓶吸附液吸附后Rosavin的濃度,計(jì)算每種樹脂不同初始濃度下的吸附量,比較各種樹脂對(duì)相同濃度的Rosavin吸附量大小,對(duì)這幾種樹脂進(jìn)行篩選。然后通過吸附模型-靜態(tài)吸附等溫曲線,得到最大吸附量值,篩選出最優(yōu)化樹脂D312。

1.4 層析方法的確定

1.4.1 樹脂裝柱高度的選擇 選擇相同型號(hào)的4根玻璃層析柱,用純凈水淘洗D312樹脂,裝柱高度分別為10 cm(20 mL)、20 cm(40 mL)、30 cm(60 mL)、35 cm(70 mL),將樹脂清洗干凈,用2倍柱體積(BV)的乙醇沖洗,將樣品配制成濃度為0.24 mg/mL的溶液,上樣量均為4 BV,以流速為1 mL/min進(jìn)行上樣,上樣后用HPLC檢測(cè)穿透液中Rosavin的濃度,計(jì)算出每種裝柱高度的吸附量。

1.4.2 上樣流速和上樣量的選擇 選擇三根相同規(guī)格的層析柱,用1.4.1的方法進(jìn)行裝柱,裝柱高度為篩選出的柱高。將Rosavin粗品配制成濃度為0.24 mg/mL的樣品溶液準(zhǔn)備,分別以上樣流速為1、2 BV/h和4 BV/h進(jìn)行上樣。上樣過程中在0.5 BV的節(jié)點(diǎn)時(shí)檢測(cè)穿透液中Rosavin的濃度,并繪制流速-Rosavin濃度曲線。

1.4.3 洗脫梯度的選擇 按照1.4.1的裝柱方法,用D312樹脂進(jìn)行裝柱,裝柱高度、上樣量和上樣流速由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,用0.24 mg/mL的Rosavin粗品上樣,上樣結(jié)束后,依次用30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫流速為1 BV/h,洗脫體積均為最大上樣量。依次收集洗脫液,用HPLC檢測(cè)Rosavin的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1 流動(dòng)相的確定

2.1.1.1 流動(dòng)相的初步篩選 六種流動(dòng)相下對(duì)Rosavin對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)圖譜分別如下:

圖1 不同流動(dòng)相下對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Rosavin control article under different mobile phases

如圖1a～c所示,甲醇-0.06%磷酸體系下色譜峰面積很小,主峰之前有很明顯的溶劑峰和雜峰,出峰的時(shí)間在5～8 min,出峰的時(shí)間較早;如圖1d～f所示,乙腈-磷酸體系下色譜溶劑峰小并且很穩(wěn)定,出峰時(shí)間在20～30 min之間,更容易進(jìn)行控制,但是乙腈-0.15%磷酸(14/86,v/v)流動(dòng)相條件下的峰太小,理論塔板數(shù)不高。通過以上六個(gè)色譜圖的比較,初步選定乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)這兩種流動(dòng)作為優(yōu)選流動(dòng)相。

這六種色譜圖組分中的主峰面積和面積百分比如表1所示。

表1 六種流動(dòng)相的主峰面積及面積百分比Table 1 Six flow peak area and area percentage

從表中可以看到六種圖譜的主峰面積以及其相應(yīng)的面積百分比,實(shí)驗(yàn)表明,乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)這兩種流動(dòng)相下的主峰面積更大,面積百分比分別約為98%和99%,基本上符合Rosavin對(duì)照品的含量。

2.1.1.2 最佳流動(dòng)相的選擇 在乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)這兩個(gè)流動(dòng)相下Rosavin對(duì)照品和Rosavin供試品檢測(cè)圖譜結(jié)果如下:

圖2 Rosavin對(duì)照品和供試品 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Rosavin control article and sample

如圖2a所示,Rosavin對(duì)照品在31 min左右出峰,但是供試品的峰型卻很雜亂,峰面積小;如圖2b所示,在流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)時(shí),對(duì)照品和供試品都表現(xiàn)出了比較好的檢測(cè)結(jié)果,rosavin出峰的時(shí)間為21 min左右,供試品中主要有三種不同的成分,與結(jié)果相符合。因此乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)是最優(yōu)化流動(dòng)相條件。

表2 濃度與平均峰面積關(guān)系Table 2 Relationship between concentration and peak area

2.1.2 柱溫的選擇 柱溫為27、30、35 ℃時(shí),Rosavin對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果如下:

圖3 Rosavin對(duì)照品不同柱溫的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC Chromatogram of Rosavin control article in different column temperature

如圖3a所示,柱溫為27 ℃時(shí)Rosavin有明顯的出峰情況,但溶劑峰雜亂;如圖3c所示,柱溫為35 ℃時(shí)Rosavin出峰不明顯。這兩個(gè)柱溫條件下的出峰面積都比在30 ℃條件下小,出峰的時(shí)間很短,主峰面積百分比也不高,如圖3b所示。因此,判定30 ℃為檢測(cè)Rosavin的最佳柱溫條件。

2.1.3 線性回歸方程 用5種不同濃度的Rosavin用以上HPLC條件檢測(cè)其平均峰面積,建立線性回歸曲線圖4所示:

以濃度和平均峰面積做回歸曲線,得到以下線性方程:

y=17.129x-51.619,R2=0.9996,符合線性回歸的要求,證明建立的HPLC條件可以用來檢測(cè)Rosavin。

圖4 線性回歸曲線Fig.4 Linear regression curve

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

2.2.1 樹脂的初選 HPLC檢測(cè)法檢測(cè)出每種樹脂吸附后Rosavin吸附液中Rosavin的峰面積S,計(jì)算出其吸附后濃度Ce和吸附量qe,做出qe的對(duì)比圖,結(jié)果如下所示:

表3 六種樹脂吸附后參數(shù)Table 3 Six kinds of resin adsorption parameters

如圖5所示,六種樹脂吸附量的大小是LX-11>D312>LSA-21>HPD 300>D101>HPD 100,LX-11和D312這兩種樹脂的吸附量比其他四種樹脂要大,這兩種樹脂均為非極性樹脂,說明樹脂的極性越小,更有利于目的物的吸附。靜態(tài)吸附過程初步選定LX-11和D312這兩種樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的選擇實(shí)驗(yàn)。

圖5 六種樹脂的吸附量對(duì)比圖Fig.5 Comparison of adsorption capacity of six resins

2.2.2 最優(yōu)樹脂的選擇 兩種樹脂的吸附量結(jié)果計(jì)算分別如表4、表5所示。

表4 不同濃度原液下D312樹脂吸附量結(jié)果Table 4 The adsorption of D312 resin under different concentrations

表5 不同原液濃度下LX-11樹脂吸附量結(jié)果Table 5 The adsorption of LX-11 resin under different concentrations

表6 柱體積與穿透液中Rosavin的濃度關(guān)系Table 6 The relationship between the column volume and the concentration of Rosavin in the penetrating fluid

根據(jù)表4和表5計(jì)算結(jié)果,分別以D312樹脂和LX-11樹脂吸附量qe為縱坐標(biāo),吸附后濃度Ce為橫坐標(biāo),繪制靜態(tài)吸附等溫曲線:

如圖6所示,D312樹脂和LX-11樹脂的等溫曲線符合II型等溫曲線--S型曲線模型。隨著原液濃度的增加,樹脂吸附量也會(huì)相應(yīng)增加,但是吸附量會(huì)逐漸趨于一個(gè)平衡值,也就是達(dá)到一個(gè)最大的吸附量值。到達(dá)最大吸附量后,吸附量大小將與原液濃度無關(guān)。靜態(tài)吸附等溫曲線表明,D312的最大吸附量值大于LX-11,因此判定 D312樹脂為最優(yōu)化的吸附樹脂,其對(duì)應(yīng)的吸附原液濃度為0.24 mg/mL。

圖6 25 ℃下靜態(tài)吸附等溫曲線Fig.6 Static adsorption isotherm at 25 ℃

2.3 層析條件的建立

2.3.1 柱體積的影響 檢測(cè)結(jié)果和柱高-吸附量曲線如圖7所示。

圖7 柱體積與吸附量關(guān)系曲線Fig.7 The curve between column volume and adsorption concentration

如圖7所示,隨著柱體積的增加,樹脂的吸附量也會(huì)相應(yīng)的增加,但是當(dāng)柱體積達(dá)到60 mL以后,吸附量將會(huì)趨于平衡,也就是到達(dá)了最大的吸附量值,在最大吸附量下的柱體積就是最佳的裝柱體積,柱高30 cm,柱體積約為60 mL。

2.3.2 上樣流速以及上樣量的影響 上樣檢測(cè)結(jié)果與流速-Rosavin濃度關(guān)系曲線如下所示:

表7 流速與Rosavin吸附量關(guān)系Table 7 Relationship between flow velocity and Rosavin adsorption

如圖8所示,隨著上樣量的增加,穿透液中Rosavin的濃度也會(huì)相應(yīng)的增加,即吸附量相應(yīng)的減少。在上樣量為3 BV之前,目的物基本上被全部吸附;上樣量大于3 BV之后,4 BV/h上樣流速下穿透液中Rosavin的濃度急速增加,大大的超過了樹脂的最大吸附量,因此4BV/h的流速不能用作上樣流速;上樣量在3 BV～4.5 BV時(shí),1 BV/h和2 BV/h的流速下穿透液中Rosavin的濃度呈現(xiàn)一種穩(wěn)定值,在樹脂的吸附量范圍之類;當(dāng)超過了4.5 BV上樣量之后,穿透液中Rosavin的濃度也開始快速增加,超過樹脂的吸附量范圍。

圖8 上樣流速與Rosavin濃度關(guān)系曲線Fig.8 The curve between sample flow rate and Rosavin

由圖8曲線可知,D312樹脂裝柱高度為30 cm時(shí),Rosavin粗品的上樣量是4 BV,上樣的流速是1～2 BV/h。

2.3.3 洗脫梯度的影響 乙醇梯度洗脫下的Rosavin檢測(cè)圖譜如下:

HPLC檢測(cè)圖譜中Rosavin的出峰時(shí)間約為21 min左右,如圖9a所示,30%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)只有少量的雜質(zhì)被洗脫出來,目的物Rosavin基本上不能解吸附;如圖9b所示,隨著洗脫劑中乙醇濃度的增加,用40%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí),色譜圖呈現(xiàn)出雜質(zhì)和目的物交叉出樣的現(xiàn)象,有大量的雜質(zhì)被洗脫下來,但是目的物Rosavin以及與其結(jié)構(gòu)相似的Rosin和rosarin也會(huì)被少量的洗脫下來;如圖9c所示,在50%乙醇洗脫梯度下,目的物Rosavin會(huì)被大量的洗脫下來,但是相應(yīng)的Rosin洗脫出來的含量也會(huì)增加,另外也會(huì)有其他少量雜質(zhì)被洗脫出來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在洗脫梯度的選擇中,對(duì)于應(yīng)用D312大孔吸附樹脂初步分離純化Rosavin,30%乙醇可作為層析柱過程的流動(dòng)相,50%乙醇可作為目的物洗脫劑。

圖9 Rosavin不同乙醇濃度洗脫過程HPLC圖譜Fig.9 HPLC spectra of Rosavin elution process in different ethanol concentration

2.4 洛塞維的分離純化

分三次取Rosavin粗品(Rosavin含量為3%),按上述討論結(jié)果,在柱高為30 cm、上樣濃度為0.24 mg/mL、最大上樣量為4 BV、上樣量為1～2 BV/h的條件下,用50%乙醇作為洗脫劑洗脫出來的溶液進(jìn)行HPLC含量測(cè)定,檢測(cè)得到Rosavin的含量平均為68.76%。

表8 分離純后Rosavin的含量Table 8 The rosavin content of separation and purification

3 結(jié)論

采用大孔吸附樹脂法對(duì)紅景天中洛塞維分離純化進(jìn)行研究,建立一條適用于應(yīng)用大孔吸附樹脂分離和純化Rosavin的工藝路線,該工藝為柱高30 cm、上樣濃度0.24 mg/mL、最大上樣量4 BV、上樣量1～2 BV/h,洗脫劑50%乙醇,此條件下分離純化所得到的目的物Rosavin含量由3.00%提高到了68.76%,回收率達(dá)85.44%,得到了Rosavin純度和回收率比較高,從樹脂吸附角度看,本實(shí)驗(yàn)采用的大孔樹脂純化方法明顯優(yōu)于其他文獻(xiàn)報(bào)道的方法。

就工藝而言,雖然應(yīng)用溶劑萃取結(jié)合硅膠層析可以得到更高純度的Rosavin,但是過程繁瑣,原料的消耗和產(chǎn)物的損耗很大,大孔吸附樹脂作為一種新型的分離純化樹脂,通過物理吸附溶液中有機(jī)物,并不會(huì)改變物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),而具有節(jié)約成本、過程優(yōu)化以及高收率等特點(diǎn),為在工業(yè)應(yīng)用中分離純化Rosavin提供了可能。

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TheisolationandpurificationofRosavinbythemacroporousadsorptionresin

YANGQing-lin,GEJing-qiu

(Chemistry and Chemical of Engineering College,Chongqing University of Science & Technology,Chongqing 401331,China)

To establish a method for the Rosavin of isolation and purification,the result of process conditions were as follows:the conditions of HPLC test is acetonitrile-0.2% phosphoric acid(65/43,v/v)of mobile phase,and column temperature condition 30 ℃;on the comparison of six resin’s adsorption and the establishment of the resin were preliminary isothermal static adsorption curve,we can determined the optimal resin was D312 resin,and the largest loading concentration was 0.24 mg/mL;column height 30 cm,sample size 4 BV,flow rate 1～2 BV/h. The results showed that the Rosavin content had increased from 3.00% to 68.76%,based on the consideration of four factors in column chromatography process. The macroporous adsorption resin of isolation and purification of Rosavin is reasonable,it is suitable for industrial applications.

rhodiola rose;Rosavin;HPLC;the macroporous adsorption resin;isolation and purification

2017-03-22

楊清林(1974-)，男，碩士，研究方向：生化檢測(cè)和儀器分析，E-mail:qlyangcqu@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0079-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.017