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(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江蘇泰州 225300)

生物竹炭固定化漆酶對苯酚的吸附降解

夏文靜,周惠,沈瑩,李飛*

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江蘇泰州 225300)

為提高漆酶的利用效率,進(jìn)一步開發(fā)其在環(huán)境治理中的應(yīng)用,本實驗用生物竹炭固定化漆酶對苯酚進(jìn)行去除。探究生物竹炭固定化漆酶、吸附降解時間、苯酚濃度、生物炭粒徑、pH、固液比對苯酚的去除作用。結(jié)果表明,反應(yīng)時間72 h,苯酚初始濃度為100 mg/L,生物炭粒徑為10目,pH為4.5,固液比是1∶10 (g/mL)時,苯酚的去除率可以達(dá)到100%。本研究結(jié)果為苯酚廢水的處理提供了一種有效的方法。

生物竹炭,漆酶,固定化,苯酚,吸附降解

苯酚(Carbolic acid)又名石炭酸,是一種重要的化工原料,隨著工業(yè)的發(fā)展,一些以苯酚或者酚醛為原料的化工廠在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的苯酚廢水[1]。酚類是我國優(yōu)先控制的污染物之一,也是美國環(huán)保局列出的129種優(yōu)先控制的污染物之一[2-3]。酚類化合物種類繁多,其中以苯酚污染最為突出。2000年,我國苯酚產(chǎn)量僅24.9萬噸,2012年112.2萬噸,到2013年底已達(dá)到265.2萬噸,并且維持11.1%的年平均增長率[4]。苯酚可以通過呼吸道和皮膚進(jìn)入人體而引起中毒,苯酚是一種高毒性的細(xì)胞原漿毒物[5]。低濃度苯酚能與細(xì)胞原漿質(zhì)蛋白結(jié)合形成不溶物,使蛋白質(zhì)變性,細(xì)胞失去活力;高濃度苯酚使蛋白質(zhì)凝固,且還能繼續(xù)向深部滲透,對細(xì)胞產(chǎn)生直接損害,使粘膜、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到腐蝕,損害和抑制[4]。大量苯酚不經(jīng)過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化處理直接排放到環(huán)境中,會導(dǎo)致水體和土壤受到嚴(yán)重污染。水體中苯酚濃度>5 mg/L時,會引起魚類大量死亡[6-7]。農(nóng)田中的苯酚污染會影響土壤中微生物的數(shù)量和分布,并造成土壤污染,降低土壤有效氮、有效鉀及有機(jī)質(zhì)等土壤養(yǎng)分含量,抑制土壤中多酚氧化酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和蛋白酶活性[8-9]。

目前含酚廢水的處理主要有三種方法:物理法、化學(xué)法和生物法。生物法具有對環(huán)境友好,無二次污染的優(yōu)點,在治理酚類物質(zhì)污染環(huán)境的作用日益突顯。近年來,有人對苯酚的生物降解進(jìn)行了研究。一方面集中在對苯酚降解菌的篩選,唐偉[10]從石化廠的廢水中分離得到一株能高效降解苯酚的菌株;葛啟隆[11]從太原市焦化廠廢水活性污泥中分離、篩選出一株苯酚降解細(xì)菌。另一方面集中在對漆酶降解菌種的固定化,VeraL等[12]以海藻膠質(zhì)為載體固定化Trachosporonsp.降解苯酚,研究表明,苯酚在固定化微生物體系中的降解率遠(yuǎn)高于懸浮微生物體系。第三方面集中在漆酶的發(fā)酵制備及其對苯酚的降解。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,可催化多種酚類和非酚類化合物氧化,因其廣泛的底物特異性,在環(huán)境治理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,能顯著減少排放到環(huán)境中的有毒污染物[13]。但由于漆酶易溶于水,不容易回收反復(fù)使用,因此限制了它在實際中的應(yīng)用。固定化酶不僅保持酶高效催化的特點,提高酶的穩(wěn)定性,還可以對酶進(jìn)行多次重復(fù)使用,從而提高了酶的使用效率[14]。對漆酶的固定化,其中研究較多的是用海藻酸鈉對漆酶進(jìn)行固定化[15-17]。

竹材是一種多孔性材料,經(jīng)過熱解以后細(xì)胞壁炭化,可以形成類似六角形的孔隙[18],孔隙分布豐富,其比較面積大,吸附力強(qiáng),且因其獨有的多孔性能,使得其在水處理方面應(yīng)用較多。炭質(zhì)氣孔能有效地吸附苯、酚等有害化學(xué)物質(zhì)[19],也可以將菌體或者酶固定在生物竹炭上,去除水體中的污染物[20]。目前用生物竹炭對漆酶進(jìn)行固定化并降解苯酚的研究較少。本實驗利用生物竹炭對漆酶進(jìn)行固定化,并研究其對苯酚的去除效果,旨在為漆酶在處理含苯酚污染等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漆酶 雙孢菇菌株(Pleurotuseryngii)液態(tài)發(fā)酵法制備,其粗酶液的酶活力為3.5 U/mL;活性生物竹炭 由浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院陸扣萍老師饋贈;甲醇 色譜純;苯酚、檸檬酸、檸檬酸鈉 等試劑均為分析純。

5810型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;1260型液相色譜 美國安捷倫科技有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩器 上海天呈科技有限公司;PHS-25型數(shù)字pH計 上海大普儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物竹炭固定化漆酶的制備 將一定粒徑的活性生物竹炭和漆酶酶液(3.5 U/mL)按照1∶10 (g/mL)的比例混合均勻,于28 ℃,180 r/min條件下充分吸附24 h,抽濾制得固定化漆酶,貯存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 固定化漆酶對苯酚的吸附降解 對三種生物材料進(jìn)行比較,確定合適的吸附降解苯酚的生物材料。比較不同條件對固定化漆酶對苯酚吸附降解率的影響,包括反應(yīng)時間、苯酚濃度、生物炭粒徑、pH、固液比、固定化漆酶的可重復(fù)利用次數(shù)。

1.2.2.1 不同生物材料對苯酚去除率的影響 分別取相同質(zhì)量的生物竹炭、生物竹炭固定化漆酶(200 U漆酶/g生物竹炭)和相同活力的漆酶酶液,選擇苯酚的濃度為200 mg/L,反應(yīng)24 h取樣,對比分析三者對苯酚的去除率。

1.2.2.2 反應(yīng)時間對固定化漆酶的苯酚去除率的影響 在苯酚濃度為200 mg/L,pH5.0的條件下,按照固液比1∶40 (g/mL)加入固定化漆酶,于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩,分別在8、16、24、48、72、90、108 h取樣測定苯酚的濃度,研究時間對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。

1.2.2.3 苯酚濃度對固定化漆酶的苯酚去除率的影響 選擇苯酚濃度分別為25、50、100、200、400和800 mg/L,pH5.0的反應(yīng)體系中,按照固液比1∶40 (g/mL)加入固定化漆酶,于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩,在8、16、24、36、72、108 h取樣測定苯酚的濃度,研究苯酚濃度對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。

1.2.2.4 生物炭粒徑對固定化漆酶的苯酚去除率的影響 將過10、20、30、40、50目篩的生物竹炭,按照1∶10 (g/mL)的比例與漆酶酶液(3.5 U/mL)混合,于28 ℃,180 r/min條件下充分吸附24 h,抽濾制得不同粒徑的固定化漆酶。用不同粒徑的固定化漆酶,在苯酚濃度100 mg/L,pH5.0,固液比1∶40 (g/mL),28 ℃,150 r/min的條件下吸附降解72 h,利用高效液相色譜法測定苯酚含量,研究生物炭粒徑對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。

1.2.2.5 pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響 在苯酚濃度為100 mg/L,反應(yīng)體系的pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的條件下,按照固液比1∶40 (g/mL)加入固定化漆酶,于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩72 h取樣測定苯酚的濃度,研究pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。

1.2.2.6 固液比對固定化漆酶的苯酚去除率的影響 在苯酚濃度為100 mg/L,pH5.0的條件下,按照固液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50 (g/mL)加入固定化漆酶,于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩72 h取樣測定苯酚的濃度,研究pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。

國際市場：上周，國際尿素供給增加，但多地出現(xiàn)需求，供應(yīng)仍然偏緊，價格持續(xù)小幅上漲。上周，黑海小顆粒尿素離岸價低端價格下跌2美元/噸，高端價格持穩(wěn)，為250-260美元/噸；波羅的海小顆粒尿素離岸價低端價格上漲5美元/噸，高端價格持穩(wěn)，為260-265美元/噸；中國小顆粒尿素離岸價低端和高端價格均上漲5美元/噸，為280-285美元/噸。

1.2.2.7 苯酚去除率驗證實驗 在苯酚濃度為100 mg/L,pH4.5的條件下,按照固液比1∶10 (g/mL)加入過10目篩的固定化漆酶,于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩72 h測定苯酚的濃度,計算苯酚的去除率。

1.2.2.8 固定化漆酶的可重復(fù)利用次數(shù) 在苯酚濃度為100 mg/L,pH4.5的條件下,按照固液比為1∶10 (g/mL)加入固定化漆酶(過10目篩生物竹炭),于28 ℃,150 r/min恒溫振蕩72 h取樣測定苯酚的濃度。將該固定化漆酶抽濾,用50 mmol/L pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌三次,將固定化漆酶重復(fù)使用兩次,比較固定化漆酶的重復(fù)利用次數(shù)對苯酚去除率的影響。

1.2.3 苯酚含量的測定及計算 取樣2 mL,12000 r/min離心10 min,上清用0.22 μm微孔濾膜過濾,采用安捷倫1260型液相色譜儀測定苯酚含量。液相色譜儀條件:色譜柱 Agilent HC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫35 ℃,流動相甲醇∶水=80∶20 (v/v),流速為1 mL/min,檢測器波長為280 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

苯酚去除率(%)=(ρ0-ρ1)/ρ0×100

殘留率(%)=ρ1/ρ0×100

式中,ρ0為反應(yīng)前苯酚質(zhì)量濃度(mg/L);ρ1為反應(yīng)后苯酚質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,采用 SPASS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,不同處理間差異顯著性用單因素方差分析進(jìn)行比較(p<0.05),并采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物材料對苯酚去除率的影響

圖1 不同生物材料對苯酚去除率的影響Fig.1 Effect of different biological materials on removal of phenol注:不同字母表示差異性顯著(p<0.05)；圖2、圖4～圖7同。

2.2 反應(yīng)時間對固定化漆酶的苯酚去除率的影響

如圖2所示,在72 h內(nèi),固定化漆酶對苯酚的去除率隨著反應(yīng)時間的延長顯著增加。反應(yīng)8、16、24、48、72 h苯酚的去除率分別為4.1%、25.1%、32.2%、56.4%和61.8%,各組之間差異顯著(p<0.05)。反應(yīng)超過72 h后,對苯酚的去除效果增加趨勢變緩,反應(yīng)72 h和90 h苯酚的去除率無顯著性差異(p>0.05)。底物濃度是決定酶催化反應(yīng)的主要因素,在反應(yīng)初期,苯酚濃度較高,固定化漆酶迅速去除反應(yīng)體系中的苯酚,隨著酶促反應(yīng)時間的延長,苯酚濃度降低,酶促反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡,苯酚的去除率趨于平穩(wěn)。本實驗確定最佳去除時間為72 h,在此條件下苯酚的去除率為61.8%。

圖2 反應(yīng)時間對固定化漆酶的苯酚去除率的影響Fig.2 Effect of reaction time on removal of phenol by immobilized laccase

2.3 苯酚濃度對固定化漆酶的苯酚去除率的影響

如圖3所示,隨著苯酚初始濃度的增加,固定化漆酶對苯酚的去除率顯著下降,當(dāng)苯酚初始濃度在25～100 mg/L時,固定化漆酶對苯酚具有較好的去除效果,在反應(yīng)90 h后,去除率都超過80%。當(dāng)苯酚初始濃度為200、400 mg/L時,去除率分別達(dá)到66.4%、62.9%。而當(dāng)苯酚初始濃度為800 mg/L時,去除率僅為44.3%。在反應(yīng)36 h內(nèi),固定化漆酶對較高濃度的苯酚(50～100 mg/L)表現(xiàn)出較強(qiáng)的去除效果,可能是苯酚濃度過低,導(dǎo)致生物炭表面漆酶與苯酚的接觸量較低,使得漆酶不能對苯酚進(jìn)行有效降解;而當(dāng)苯酚濃度過高時,對固定化漆酶產(chǎn)生一定的毒害作用,大部分漆酶在失活之前沒有參與催化反應(yīng),導(dǎo)致對苯酚的去除率下降?？紤]催化降解效率,本實驗確定最佳苯酚初始濃度為100 mg/L。

圖3 苯酚濃度對固定化漆酶的苯酚去除率的影響Fig.3 Effect of phenol concentration on removal of phenol by immobilized laccase

2.4 生物竹炭粒徑對固定化漆酶的苯酚去除率的影響

由圖4可知,生物竹炭在10～40目的范圍內(nèi),隨著生物竹炭粒徑的減小,固定化漆酶對苯酚去除率的影響無顯著性差異(p>0.05)。當(dāng)生物竹炭粒徑繼續(xù)減小,雖然其比表面積增大,相同質(zhì)量生物竹炭的吸附能力增強(qiáng),但是酶分子之間產(chǎn)生凝結(jié)作用的機(jī)會增多,易形成多層包被或皺褶結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)形成的空間位阻,阻礙了苯酚與酶的接觸,同時也阻礙了反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散,使得去除率下降,因此選擇最佳的生物竹炭粒徑為過10目篩,此時苯酚的去除率為78.1%。

圖4 生物竹炭粒徑對固定化漆酶的苯酚去除率的影響Fig.4 Effect of bamboo biochar particle size on removal of phenol by immobilized laccase

2.5 pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響

對雙孢菇漆酶的最適pH及pH穩(wěn)定性研究表明,該漆酶在偏酸性條件下(pH3.0～5.0)具有較好的酶活力及穩(wěn)定性(酶學(xué)性質(zhì)將另有報道)。此外,工業(yè)含酚廢水通常呈偏酸性,因此在pH3～5范圍內(nèi),研究pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響。如圖5所示,在pH3～5范圍內(nèi),固定化酶對苯酚的去除率隨著pH的增加而增加。當(dāng)pH為3.0、3.5、4.0、4.5時,固定化漆酶對苯酚的去除率有顯著性差異(p<0.05)。當(dāng)反應(yīng)pH為4.5時,對苯酚的去除率是79.1%,與pH5.0時苯酚的去除率81.5%無顯著性差異(p>0.05)。本實驗確定最佳pH為4.5,該條件下苯酚的去除率為79.1%。

圖5 pH對固定化漆酶的苯酚去除率的影響Fig.5 Effect of pH on removal of phenol by immobilized laccase

2.6 固液比對固定化漆酶的苯酚去除率的影響

如圖6所示,當(dāng)固液比為1∶5和1∶10時,已檢測不出苯酚的殘留,此時固定化漆酶對苯酚的去除率為100%。固液比為1∶20、1∶40和1∶80時,苯酚的去除率下降,各條件下的苯酚的去除率有顯著性差異(p<0.05)。固液比大,單位體積內(nèi)固定化生物炭含量高,有利于縮短有效吸附降解時間,提高固定化漆酶對苯酚的去除,但投入生產(chǎn)成本會顯著提高;固液比小,苯酚的去除率低,但是相同質(zhì)量的固定化漆酶可以處理更多的苯酚。綜合考慮,本實驗確定最佳固液比為1∶10,此時苯酚的去除率為100%。

圖6 固液比對固定化漆酶的苯酚去除率的影響Fig.6 Effect of solid/solution ratio on removal of phenol by immobilized laccase

2.7 苯酚去除率驗證實驗

在確定的最佳條件下進(jìn)行苯酚去除率驗證實驗,重復(fù)三次,苯酚的去除率都為100%。表明此優(yōu)化的苯酚去除條件有利于苯酚的高效去除。

2.8 固定化漆酶的可重復(fù)利用性

由圖7可知,經(jīng)過生物竹炭固定化的漆酶第一次對苯酚的去除率為100%,第二次利用時,對苯酚的去除率為82.4%,第三次利用時,苯酚的去除率僅為43.7%。表明固定化漆酶經(jīng)多次重復(fù)利用后,穩(wěn)定性下降?？赡苁窃诜磸?fù)利用過程中,漆酶部分失活;此外,部分漆酶從生物竹炭中脫落,導(dǎo)致對苯酚的去除率下降。

圖7 固定化漆酶的重復(fù)利用次數(shù)對苯酚去除率的影響Fig.7 Effect of reutilization cycles on removal of phenol by immobilized laccase

3 結(jié)論與討論

漆酶對逆境因素、變性等具有高度的敏感性,從而限制了漆酶的有效應(yīng)用和重復(fù)利用。固定化處理保持了酶的催化活性,增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性,實現(xiàn)了酶的重復(fù)連續(xù)使用。對漆酶進(jìn)行固定化拓寬了漆酶在廢水處理中的應(yīng)用[21]。馮俊[16]用海藻酸鈉固定化菌體JY04,該固定化菌體降解苯酚的最適合pH為7.0,在該條件下固定化菌體培養(yǎng)42 h對苯酚的去除率為97.3%。本文的最適pH4.5與其有所不同,原因可能是菌體JY04可能是細(xì)菌,而本文所用的漆酶是由白腐菌雙孢菇發(fā)酵產(chǎn)生的,不同菌所產(chǎn)的漆酶的酶學(xué)性質(zhì)不同。張陳成[22]采用活性炭纖維(ACF)固定化漆酶處理模擬廢水中的苯酚,該固定化漆酶在pH4～7范圍內(nèi)對苯酚具有較好的去除效果,其最適pH為 4.0,本文的最適合pH與其研究結(jié)果基本一致,在該pH條件下對苯酚的去除率為100%。尹艷娥[23]用竹炭對活菌體(紅球菌ad049)進(jìn)行吸附固定化,第三次使用時對苯酚的去除率為93.35%,重復(fù)利用20次以后,對苯酚的去除率在98%以上,而本文用生物竹炭固定化的漆酶第三次使用對苯酚的去除率只有53.7%。這是由于尹艷娥是對微生物進(jìn)行固定化,利用微生物在生長代謝過程中對苯酚去除,微生物在生長過程中會不斷的產(chǎn)漆酶,并且經(jīng)過20次的培養(yǎng),微生物經(jīng)過不斷的馴化,對苯酚的耐受性提高,因此重復(fù)利用20次能保持較高的苯酚去除率,而本實驗是對漆酶進(jìn)行固定化,漆酶量是固定的,在使用過程中會有失活也會從活性炭上脫落,因此固定化漆酶的重復(fù)利用次數(shù)不如固定化菌體的重復(fù)利用次數(shù)。

本實驗研究了生物竹炭固定化漆酶對苯酚的吸附降解作用結(jié)果表明:經(jīng)生物竹炭固定化的漆酶對苯酚的吸附降解效果比游離的漆酶以及單獨活使用性炭效果要好。苯酚初始濃度為100 mg/L,生物炭粒徑為10目,pH=4.5,固液比是1∶10 (g/mL)時,反應(yīng)72 h,對苯酚的去除率可以達(dá)到100%。本研究結(jié)果為含苯酚廢水的處理提供了一種有效的方法。但生物竹炭固定化的漆酶回收之后,在相同條件下,第二次和第三次使用對苯酚的去除率下降,去除率分別為84.1%和53.7%,可能的原因是生物竹炭對漆酶的固定效果不是很好,需要通過進(jìn)一步的研究來改善固定效果以提高其重復(fù)利用次數(shù)。

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Phenolremovalusingimmobilizedbiologicallaccasewithbamboocharcoal

XIAWen-jing,ZHOUHui,SHENYing,LIFei*

(School of Chemistry and Biological Engineering,Nanjing Normal University Taizhou College,Taizhou 225300,China)

In order to improve the efficiency of laccase utilization and further develop its application of environmental governance,biological immobilization of laccase on bamboo charcoal for phenol removal was performed in this experiment. The effects of laccase immobilization,treatment time,concentration of phenol,carbon particle size,pH and solid/liquid ratio on the degradation of phenol were evaluated. The reaction time of 72 h,initial phenol concentration of 100 mg/L,biological carbon particle size of 10 mesh,pH of 4.5 and solid/liquid ratio of 1∶10 g/mL were optimal,which exhibited degradation ratio of phenol up to 100%.This study indicated an effective method for the treatment of phenol-containing pollution.

biochar;laccase;immobilization;phenol;removal

2017-06-20

夏文靜(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：酶的發(fā)酵、純化以及改性研究，E-mail：xiawenjing1234@163.com。

*通訊作者:李飛(1986-)，男，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物的開發(fā)、酶工程、基因工程，E-mail：kasber-lee@163.com。

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目(15KJB220004)；泰州市社會發(fā)展項目(TS201516)；南京師范大學(xué)泰州學(xué)院第二批精品課程《酶工程》。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.012