徐陽，趙賀新，宋義前，于慶帆，劉雪峰

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 伊寧市 835000； 2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

樟子松赤枯病拮抗真菌的篩選

徐陽1，趙賀新1，宋義前1，于慶帆1，劉雪峰2

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 伊寧市 835000； 2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

在健康的樟子松針葉上分離得到25種真菌，從中選出具有生防潛能的11種用于控制樟子松赤枯病的病原菌拮抗菌株的篩選。拮抗真菌與病原菌的平板對峙試驗(yàn)結(jié)果表明：長枝木霉Trichodermalongibrachiatum、血紅毛殼Chaetomiumcruentum和印度毛殼C.indicum能有效抑制該病原菌，其中長枝木霉對病原菌菌絲的抑制效果最強(qiáng)，抑制率為72.81%，后2種的抑制率分別為49.16%和42.36%。

樟子松赤枯??；病原菌；拮抗真菌；抑制率

樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica赤枯病在世界廣泛分布，主要危害杉、柏苗木及多種松樹的針葉，樟子松苗木和大樹均可受害。何秉章[1]等人首次在黑龍江省帽兒山林場的樟子松上發(fā)現(xiàn)病害癥狀，經(jīng)鑒定該病害由兩種病原菌引起，即擬盤多毛孢屬Pestalotiopsissp.和截盤孢Truncatellasp.真菌。近年來，隨著樟子松栽植面積不斷擴(kuò)大，樟子松赤枯病的危害越來越嚴(yán)重，不僅引起針葉枯死，樹勢減弱，而且引起林產(chǎn)品品質(zhì)下降，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)王桂珍[2]調(diào)查，遼寧省沈陽東陵鐵路林場一年生樟子松苗發(fā)病率30% 以上，重者苗木枯死，對苗木生產(chǎn)威脅很大。目前該病害主要靠化學(xué)防治來控制，但因容易造成環(huán)境污染而受到限制，尋找科學(xué)的防治方法是亟待解決的新問題。近年來隨著防治技術(shù)的迅速發(fā)展，森林植物病害的生物防治技術(shù)在生產(chǎn)上受到廣泛重視。以細(xì)菌、放線菌和真菌為生物源的生物防治[3-5]，對土傳病害、葉部病害和枝干病害均取得了較好的防治效果。真菌病害生防制劑已經(jīng)開發(fā)成商品并大面積推廣應(yīng)用的有木霉，線蟲病害的生防菌有厚垣輪枝霉、淡紫擬青霉等。為尋找控制樟子松赤枯病具有開發(fā)價(jià)值的生防菌株，作者進(jìn)行了從樟子松葉上分離并篩選拮抗菌株的研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料 樟子松赤枯病病原菌檸檬擬盤多毛孢Pestalotiopsiscitrina(MeAipine)Nag Raj從哈爾濱帽兒山實(shí)習(xí)林場的樟子松病葉上分離得到，保存于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林病理實(shí)驗(yàn)室。植物材料為帽兒山實(shí)習(xí)林場的樟子松1～3年生針葉。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然，121 ℃高壓滅菌30 min[6]。

1.2 葉棲真菌分離及純化 將健康的1年生、2年生和3年生樟子松針葉剪成0.5 cm左右的小段，用紗布包起放入漂白粉(1∶14)消毒液中消毒30 s，取出用無菌水漂洗3次，用吸水紙吸干。接至PDA培養(yǎng)基上，每皿5段，放入25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每個(gè)處理6次重復(fù)。

當(dāng)接種材料周圍生出明顯的菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法和單孢分離法[6-7]挑取形態(tài)不同的菌落，接入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，20～25 ℃避光培養(yǎng)。最后轉(zhuǎn)到PDA斜面保存，用以進(jìn)一步鑒定及后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 形態(tài)鑒定 將分離、純化所得的真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)數(shù)日后，對已經(jīng)產(chǎn)孢的真菌，直接挑取孢子，制成水載片；產(chǎn)生子實(shí)體的真菌做徒手切片，制成水載片；在顯微鏡下觀察子實(shí)體、分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞以及孢子的形態(tài)特征，結(jié)合其培養(yǎng)特性及菌落特征，參考相關(guān)真菌分類資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[8-10]。

1.4 樟子松赤枯病病原菌的拮抗菌篩選 拮抗菌株初篩采用平板對峙法[11]。將培養(yǎng)8 d的病原菌、11種內(nèi)生真菌，用7 mm打孔器切取等質(zhì)量的菌餅，采用兩點(diǎn)對峙法，分別接至PDA培養(yǎng)基的中心兩側(cè)，兩點(diǎn)相距4 cm，一側(cè)接入病原菌，另一側(cè)接入待測的內(nèi)生真菌菌株；以接7 mm的水瓊脂的菌餅與病原菌的為對照；放入25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)5次。24 h后測量，每24 h測量1次。每日記錄、觀察11種待測菌株與病原菌的生長情況。并分別測量記錄內(nèi)生真菌菌株指向病原菌的半徑、病原菌指向內(nèi)生菌菌株的半徑以及對照病原菌的半徑，5 d 后開始計(jì)算內(nèi)生菌菌株對病原菌的抑制率。若兩菌落相交，要觀察并記錄內(nèi)生真菌菌株對病原菌的抑制、包圍，以及病原菌對拮抗菌株包圍、侵占的反作用。抑菌率的計(jì)算公式如下：

相對抑菌率(%)=(病原菌對照菌落半徑-病原菌菌落指向?qū)χ啪陌霃?÷病原菌對照菌落半徑×100

被抑菌率(%)=(拮抗菌菌落半徑-與病原菌對峙菌的趨向半徑)÷拮抗菌菌落半徑×100

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]的拮抗系數(shù)、抑菌率和被覆蓋程度篩選出適合的生防菌株。拮抗系數(shù)的分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉棲真菌群落組成 經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，從校園健康樟子松針葉上分離到的葉棲真菌共25種，其中，子囊菌3種為血紅毛殼Chaetomiumcruentum、印度毛殼C.indicum和散囊菌Eurotiumsp.，接合菌1種為根霉Rhizopussp.，其余21種為半知菌,以Penicilliumsp.，Alternariasp.，Paecilomycessp.和Pestalitioposissp.為優(yōu)勢種，分離率依次為19.7%，15.2%，15.5%和10%，這些優(yōu)勢種在不同年齡的針葉上分離頻率差異較大(表2)。

表2 樟子松葉棲真菌分離率 %

注：-表示沒有分離到該菌株。

樟子松針葉真菌群落物種較豐富，1年生的針葉分離鑒定出真菌12種，2年生針葉上的真菌16種，3年生針葉上的真菌18種。不同年齡松針上真菌組成和分離頻率差異也較大，隨著針葉年齡增加真菌種類增多。在不同年齡針葉上，葉棲真菌共有6種，占總數(shù)的28%，為鏈格孢屬、芽枝霉屬、散囊殼屬、青霉屬、擬青霉屬和色串孢屬。共有屬(種)鏈格孢屬、散囊殼屬和色串孢屬真菌隨針葉年齡增大分離率逐漸增大，共有屬(種)青霉和擬盤多毛孢屬的真菌隨針葉年齡增大分離到的次數(shù)減少，共有屬(種)芽枝霉屬從針葉中分離到的次數(shù)由大到小依次為：1年生，3年生，2年生。1年、2年生的針葉青霉屬真菌排第1位，3年生的針葉擬青霉屬真菌排第1位。

2.2 拮抗真菌篩選 從分離、純化的真菌中選出11種真菌與樟子松赤枯病病原菌檸檬擬盤多毛孢Pestalotiopsiscitrina對峙培養(yǎng)，結(jié)果見表3。這11種真菌對檸檬擬盤多毛孢菌絲體均有不同程度的抑制作用，其中長枝木霉TrichodermalongibrachiatumKM菌株3 d后將病原菌完全覆蓋，完全占領(lǐng)了病原菌全部營養(yǎng)空間，拮抗系數(shù)和覆蓋率都達(dá)到最高。血紅毛殼和印度毛殼在4 d后對檸檬擬盤多毛孢的抑制作用逐漸增強(qiáng)，有明顯的抑菌帶，用抑菌率、拮抗系數(shù)和覆蓋率3個(gè)指標(biāo)來評價(jià)血紅毛殼比印度毛殼的抑菌效果更明顯。散囊菌屬Eurotiumsp.和鏈格孢屬Scytalidiumsp.不但對檸檬擬盤多毛孢產(chǎn)生拮抗作用較小，反而被檸檬擬盤多毛孢所抑制，說明這兩種生防菌沒有抑制病原菌的作用，反而能在一定程度上促進(jìn)病原菌菌絲的生長。在檸檬擬盤多毛孢的自我對峙中，發(fā)現(xiàn)檸檬擬盤多毛孢并沒有相互融合，而是自我抑制，出現(xiàn)明顯的抑菌帶，并且抑制效果也相對較為明顯。而青霉Penicilliumsp.、擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.、莖點(diǎn)霉Phomasp.、枝頂孢Acremoniumsp.、座殼孢Dichomerasp.和盾殼霉Coniothyriumsp.對檸檬擬盤多毛孢的抑制效果不明顯，抑菌率較低。

表3 拮抗菌株與樟子松赤枯病病原菌對峙培養(yǎng)8 d的抑菌率、覆蓋程度

A.病原菌與長枝木霉對峙結(jié)果；B.病原菌與印度毛殼對峙結(jié)果；C.病原菌與血紅毛殼對峙結(jié)果；D.對照圖1 重要接抗菌與病原菌平板抑制圖

綜合上述結(jié)果，從11種生防菌與病原菌的平板對峙試驗(yàn)中選出3種能夠有效抑制樟子松赤枯病病原菌的真菌：長枝木霉、血紅毛殼和印度毛殼。其中長枝木霉對病原菌菌絲的抑制效果最強(qiáng)，抑制率為72.81%，其次為血紅毛殼、印度毛殼，抑制率分別為49.16%和42.36%，這3種真菌對病原菌的抑制率均在40%以上。3種真菌形態(tài)特征見圖2～4。

A.分生孢子梗和分生孢子;B.分生孢子；標(biāo)尺=10μm圖2 長枝木霉形態(tài)特征

A.子囊果和附屬絲；B.子囊；C、D.子囊孢子；標(biāo)尺=10μm圖3 印度毛殼形態(tài)特征

A.子囊果上的附屬絲；B.子囊；C.子囊孢子；標(biāo)尺=10μm圖4 血紅毛殼形態(tài)特征

3 結(jié)論與討論

從樟子松針葉上共分離出葉棲真菌25種，其中，半知菌21種，子囊菌3種，接合菌1種，優(yōu)勢種為Penicilliumsp.、Alternariasp.、Paecilomycessp.和Pestalitioposissp.。各年齡針葉共有6屬(種)，這6個(gè)屬(種)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。

從11種葉棲真菌與病原菌的對峙培養(yǎng)中，篩選出具有開發(fā)價(jià)值的優(yōu)良生防菌株。根據(jù)生防菌對病原菌的抑菌率、拮抗系數(shù)和覆蓋程度等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，最終確定的可以有效抑制樟子松赤枯病病原菌的拮抗菌株為長枝木霉Trichodermalongibrachiatum、血紅毛殼Chaetomiumcruentum和印度毛殼C.indicum。

本研究表明：木霉屬T. sp.和毛殼屬C. sp.真菌對樟子松赤枯病病原菌有明顯的抑制作用，為后續(xù)研究該病的林間生物防治和抑菌活性物質(zhì)的篩選奠定了基礎(chǔ)。

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ScreeningofantagonisticfungiofPinussylvestrisvar.mongolicaredblight/

XU Yang,et al.

(Agricultural Research Institute of The Fourth Division of Xinjiang Production and Construction Corps,yining 835000,China)

Twenty-five species of fungi were isolated from healthy needles ofPinussylvestrisvar.mongolica,and of which 11 species with biocontrol potential were tested for screening the antagonistic against the pathogen of red blight inPinussylvestrisvar.mongolica.The result of confrontation test showed thatTrichodermalongibrachiatum,ChaetomiumcruentumandC.indicumcould effectively inhibite the growth of the pathogen,among them,T.longibrachiatumhad the highest antagonistic effect on the pathogen hypha,its inhibiting rate was 72.81%,followed byC.cruentumandC.indicum,which were 49.16% and 42.36% respectively.

Pinussylvestrisvar.mongolicared blight；pathogen；antagonistic fungi；restrained rate

2016-05-25；

2016-07-15

新疆兵團(tuán)第四師科技項(xiàng)目(2016)“伊犁地區(qū)地下真菌的篩選與塊菌(松露)的引種栽培”

徐陽(1988—)，女，助理研究員，碩士，主要從事林果病蟲害及森林病理學(xué)方面的研究，E-mail：31476214@qq.com

劉雪峰，研究員，主要從事森林病理學(xué)及真菌分類方面的研究，E-mail：liuxuefeng63@sina.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)03-0001-04

(責(zé)任編輯 楊靜莉)