李 真 王留強 盧孟柱(林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

毛白楊PtoWOX11/12a對楊樹扦插苗生長發(fā)育的影響*

李 真 王留強 盧孟柱
(林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

【目的】 WOX轉錄因子家族是一類植物特有的轉錄因子家族，在植物胚胎建成、干細胞分裂和分化的維持以及器官的形成過程中發(fā)揮重要調控作用。本研究分析毛白楊PtoWOX11/12a基因對轉基因84K楊葉形、莖等生長發(fā)育的影響，分析毛白楊不定根誘導過程中及過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊中PtoWOX11/12a基因、生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達模式，為深入研究WOX基因對植物生長發(fā)育的調控機制提供參考。【方法】 對在溫室生長1～3個月的過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因以及非轉基因84K楊(對照)的葉形、株高和地徑進行比較； 通過組織切片對轉基因和非轉基因84K楊的第5、9和13節(jié)間的解剖學特征進行分析，并對各節(jié)間的形成層和木質部寬度進行比較； 利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術，分析PtoWOX11/12a、生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在毛白楊不定根產生過程中及在過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊中的表達模式?！窘Y果】 在葉形上，過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊葉片長度與非轉基因84K楊(對照)沒有顯著差異，但是寬度顯著大于對照； 抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊的葉長和葉寬都明顯小于對照，且葉邊緣呈現鋸齒狀缺刻。在植株的株高和地徑方面，過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊的株高和地徑都明顯低于對照，且存在顯著差異； 莖解剖分析發(fā)現，過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊木質部寬度小于對照，形成層細胞層數多，而抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊木質部寬度同樣小于對照，但與過表達植株相比，木質部寬度相對變大，形成層細胞層數變少。qPCR結果顯示PtoWOX11/12a基因在毛白楊不定根產生過程中被誘導并持續(xù)表達，而生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在誘導培養(yǎng)3天后表達量才迅速增加，但在過表達PtoWOX11/12a轉基因植株中表達量升高，在抑制表達植株中表達量降低?！窘Y論】PtoWOX11/12a基因的過表達或者抑制表達都影響了轉基因84K楊葉的發(fā)育、莖的高生長和徑向生長(次生木質部發(fā)育)；PtoWOX11/12a基因在楊樹不定根形成和生長過程中發(fā)揮作用涉及到生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8的參與。在生根過程中，PtoWOX11/12a基因和生長素合成基因YUCCA1及YUCCA8在表達時間上存在時間間隔。高水平的PtoWOX11/12a抑制了生長素合成相關基因的表達，導致過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊由于更容易形成分生組織，促進了根原基的形成，產生比較多的不定根。在不定根生長過程中，YUCCA1及YUCCA8基因上調表達，可促進生長素合成和根部分生組織細胞的分裂；在莖中，二者上調表達促使過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊形成層活動的增強，繼而影響木質部的分化，木質部變窄。

楊樹；PtoWOX11/12a； 基因表達； 實時熒光定量PCR； 不定根； 形成層

WUSCHEL related homeobox(WOX)是真核生物同源異型盒(homeobox，HB)轉錄因子超家族中植物特有的1個亞支，含有1個由65個氨基酸殘基組成的、保守的同源異型結構域(homedomain, HD)(Zhangetal., 2015)。這類轉錄因子在植物發(fā)育關鍵時期發(fā)揮重要作用，如參與胚的形成、調控干細胞分裂分化動態(tài)平衡和器官的形成等(van der Graaffetal., 2009)。

在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，WOX轉錄因子家族包含15個成員(WUS以及WOX1-WOX14)，它們主要在莖和根頂端分生區(qū)干細胞的維持、側生器官的發(fā)育、花器官的形成和胚發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用(Aichingeretal., 2012; Uedaetal., 2011)。AtWUS基因是WOX家族中最早發(fā)現的基因，主要在維持根和莖頂端分生組織(shoot apical meristem，SAM)中干細胞特性、促進干細胞的增殖和抑制干細胞的分化等過程中發(fā)揮重要作用(吳錦斌等， 2013)。AtWOX5作為AtWUS基因的同系物，在調控莖尖和根部干細胞穩(wěn)定以維持未分化狀態(tài)時，二者可以相互補償(Sarkaretal., 2007)。在水稻(Oryzasativa)中，leaf2和leaf3基因位點編碼OsWOX3A蛋白，雙突變體產生窄而卷曲葉片、增多的分蘗、減少的側根和窄小的種子，說明OsWOX3A參與橫軸器官向外側的生長發(fā)育及分蘗與側根的發(fā)育，同時調控葉片的維管模式(Choetal., 2013)。AtWOX4基因主要在維管原形成層和形成層中表達，參與次生生長過程中維管形成層干細胞增殖(Hirakawaetal., 2010; Jietal., 2010)。AtWOX11和AtWOX12共同參與葉片原形成層細胞或薄壁細胞向根源基細胞轉變的過程(Liuetal., 2014a)。在模式植物水稻基因組中，WOX轉錄因子家族有13個成員，部分成員的生物學功能和作用機制已得到詳細的研究和闡述。例如，OsWOX7參與調控水稻居間分生組織(Wangetal., 2014)；OsWOX11受外源生長素和細胞分裂素的誘導后主要在根尖和根分生組織的形成區(qū)中表達，并參與激活冠狀根的發(fā)生，促進其生長(Zhaoetal., 2009)。

目前，關于該家族成員的研究，主要集中于擬南芥、水稻、矮牽牛(Petuniahybrida)、番茄(Lycopersiconesculentum)等草本植物中，木本植物中WOX基因的研究較少。在楊樹中，根據毛果楊(Populustrichocarpa)基因組信息，本課題組前期鑒定了18個毛白楊(Populustomentosa)WOX轉錄因子家族成員，對它們的序列結構、進化關系以及在不同組織(根、莖、葉和未成熟木質部等)中的表達模式等進行了分析和比較，發(fā)現PtoWOX11/12a主要在根部表達，過表達該基因能夠影響楊樹根的發(fā)育，增加不定根的數量(Liuetal., 2014b)，該研究也是關于楊樹WOX基因的首次報道； 此外分析不定根形成過程中的轉錄組數據發(fā)現，生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達發(fā)生顯著變化。隨后，Xu等(2015)發(fā)現南林895楊(Populus×euramericana‘Nanlin 895’)PeWOX11a和PeWOX11b基因主要在根中表達，過表達PeWOX11a或者PeWOX11b不僅能夠增加轉基因楊樹不定根的數量，還能誘導地上部分莖段產生異位根。

為進一步了解毛白楊PtoWOX11/12a基因是否參與調控楊樹其他組織或者器官的生長和發(fā)育，并探討其參與調控的作用機制，本研究分析了PtWOX11/12a基因對楊樹葉片、莖生長發(fā)育的影響，同時還利用所建立的該基因對不定根的誘導試驗體系(Liuetal., 2014c)，探討了該基因與生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在楊樹組培苗莖段扦插生根過程中各個時期的相對表達情況，以了解它們互作的機制。上述結果為進一步闡明PtoWOX11/12a基因調控楊樹生長發(fā)育作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

毛白楊用于基因表達分析，銀腺楊無性系84K楊(P.alba×P.glandulosacl. 84K)用于遺傳轉化，本課題組前期已獲得的過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊(Liuetal., 2014b)用于表型和不定根中生長素合成相關基因的表達分析。所有植物材料均由本實驗室(中國林業(yè)科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室)保存并繁殖。將轉基因和非轉基因84K楊帶有頂端的組培苗嫩莖(約2.5 cm)扦插到生根培養(yǎng)基(1/2MS基礎培養(yǎng)基+0.05 mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1NAA，pH5.8～6.0)中，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強度50 μmol·m-2s-1。生長20天后，將其移栽到人工土中，隨后轉入溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，生長條件同上。

選取生長狀態(tài)良好且長勢一致的毛白楊組培苗，截取帶有頂端的組培苗莖段(約2.5 cm)扦插到新鮮的生根培養(yǎng)基中，依據前期不定根誘導過程(Liuetal., 2014c)，分別在培養(yǎng)0，2，3，4，6，8天后，收集每個時間點的植株最底端約0.5 cm長莖段，每個樣品至少含10株扦插苗，液氮速凍置于-80 ℃保存用于RNA提取。

1.2 總RNA的提取和實時熒光定量PCR

采用傳統的CTAB法(Changetal., 1993)提取上述毛白楊莖段各時間點樣品以及不同轉基因和非轉基因84K楊幼嫩葉片的總RNA。利用RQ1 RNase-free DNase(Promega，Madison，WI，USA)對其進行處理以去除DNA污染。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)合成cDNA第1鏈，具體方法參見試劑盒使用說明。

實時熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)，在Roche 480實時熒光定量PCR儀(Roche Applied Science，Penzberg，Upper Bavaria，Germany)上進行操作，以84K楊α-actin基因作為內參。為了確保試驗結果真實可靠，每個試驗均設有3次生物學重復和4次技術重復。用于實時熒光定量PCR的基因特異性引物使用Primer 5軟件設計，其序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR的基因特異性引物Tab.1 Primers used for qPCR

1.3 載體構建和遺傳轉化84K楊

EAR(ERF-associated amphiphilic repression)抑制結構域作為顯性抑制子能夠抑制轉錄因子下游基因的表達(Hiratsuetal., 2003)。本試驗以毛白楊cDNA為模板，擴增PtoWOX11/12a基因編碼區(qū)序列，并融合EAR抑制結構域(SRDX序列)，通過Gateway BP反應重組進入pDNOR222(Invitrogen)載體后送公司測序，測序正確后通過LR反應亞克隆至終載體pMDC32，電擊轉化農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，以農桿菌介導的葉盤法轉化84K楊(Liuetal.， 2014b)。在含有200 mg·L-1特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化培養(yǎng)基(1/2MS基礎培養(yǎng)基+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA)上篩選抗性葉芽，隨后在含有同樣濃度抗生素的生根培養(yǎng)基上誘導生根。摘取幼苗葉片，提取總RNA，利用qPCR技術對其進行分子鑒定。

1.4 轉基因84K楊的表型變化

將20天左右的生長狀態(tài)良好且長勢一致的轉基因和非轉基因對照84K楊組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1個月對各個植株的株高和地徑進行測定。同時，摘取苗木頂端至基部的所有葉片，觀察其葉形變化，并對第4片展開葉的長、寬以及長寬比進行連續(xù)測量和計算。為了減少植株的個體差異，每次試驗至少3次生物學重復，每組數據至少測量12株材料。結果進行t檢驗。

1.5 莖段切片分析

截取3月齡轉基因和非轉基因對照84K楊頂端向下的第5、9、13節(jié)間，進行切片分析。首先，取每個莖段中部位置約2～3 mm厚度的材料放入2.5%的戊二醛固定液中過夜固定。固定的材料經過70%、85%、95%和100%的酒精脫水后用Spurr樹脂包埋。用Leica EMUC7超薄切片機(Leica 283 Microsystems GmbHWetzlar，Germany)按厚度為2 000 nm的標準進行切片，經甲苯胺藍O(Toluidine blue O，TBO)染色后，使用蔡司Zeiss Axio Imager A1(Carl Zeiss)顯微鏡進行拍照觀察，通過Axiovision Rel 4.8對木質部寬度進行測定。

2 結果與分析

2.1 過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊的鑒定

為了獲得抑制表達PtoWOX11/12a轉基因材料，構建了PtoWOX11/12a基因的顯性抑制載體，轉化84K楊獲得轉基因株系，經qPCR檢測篩選出表達量明顯降低的2個轉基因株系DR19和DR31(圖1)； 同時，對已有的過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊2個株系(OE6和OE12)進行了分子檢測(圖1)，結果顯示過表達轉基因株系成熟葉片中的PtoWOX11/12a基因的表達量分別高于非轉基因84K楊(對照)約400、600倍。過表達轉基因株系(OE6和OE12)和抑制表達轉基因株系(DR19和DR31)用于后續(xù)的表型比較和功能分析試驗。

圖1 實時熒光定量PCR分析過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊Fig.1 qPCR analysis of PtoWOX11/12a-overexpression and -suppressed expression transgenic 84K poplarsCK： 非轉基因84K楊； OE6, OE18： 過表達轉基因84K楊6號和18號株系； DR19, DR31： 顯性抑制轉基因84K楊19號和31號株系。下同。CK: Non-transgenic 84K poplar; OE6, OE18: Over-expression transgenic poplar lines 6 and 18; DR19, DR31: Suppressed expression transgenic poplar lines 19 and 31. The same below.

2.2 PtoWOX11/12a對轉基因84K楊葉形的影響

圖2 PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊的葉形分析Fig.2 Analysis of leaf shape of PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars1-11： 自植株頂端至基部的所有葉片排序The serial number of leaves from the top to the base of plant.

將20天的生長狀態(tài)良好且長勢一致的過表達(OE6和OE18)、抑制表達(DR19和DR31)PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室培養(yǎng)2個月后，對其頂端至基部的所有葉片依次進行比較，結果發(fā)現，與對照相比，過表達PtoWOX11/12a轉基因植株的葉片趨近于卵圓形，而抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株葉片趨近于狹長型，且葉片邊緣呈現鋸齒狀缺刻(圖2)。同時，比較了栽植于溫室1、2和3個月后的轉基因和對照植株第4片展開葉的長、寬以及長寬比發(fā)現，過表達PtoWOX11/12a轉基因植株的葉片長度與對照類似，沒有顯著差異，但寬度明顯大于對照，且二者葉片的長寬比存在顯著差異； 抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株葉片的長度和寬度顯著低于對照葉片，長寬比卻顯著大于對照(表2)。以上結果表明，PtoWOX11/12a基因參與了84K楊葉片的生長和發(fā)育。

表2 PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊葉片長、寬及長寬比統計① Tab.2 Statistics of the leaf length, width and length/width between PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

①數值表示平均值±標準差； 轉基因株系與對照的t檢驗P值用星號表示:*,Plt;0. 05;**,Plt;0.01。 下同。Values shown are means±SD.Pvalues of Student’sttest for transgenic lines and control poplars are denoted with asterisks(*,Plt;0.05;**,Plt; 0.01). The same below.

2.3 PtoWOX11/12a對轉基因84K楊株高、地徑的影響

為了進一步研究PtoWOX11/12a對轉基因84K楊生長發(fā)育的影響，對過表達(OE6和OE18)、抑制表達(DR19和DR31)PtoWOX11/12a轉基因以及非轉基因(對照)84K楊的地上部分(株高和地徑)進行了連續(xù)統計。株高統計結果顯示，過表達PtoWOX11/12a轉基因植株的株高均顯著低于對照，且差異隨著植株生長更加明顯； 而抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株的株高又顯著低于過表達轉基因植株，表現為植株矮小、生長遲緩。地徑統計結果顯示，過表達和抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株的地徑均小于對照，且存在顯著差異，其中抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株的地徑最小(圖3，表3)。

圖3 2月齡PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊表型Fig.3 Phenotypes of two-month-old PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

對3月齡轉基因和非轉基因84K楊莖段的第5、9和13節(jié)間進行解剖分析并統計木質部寬度。結果顯示，過表達轉基因植株的第5、9和13節(jié)間木質部寬度明顯低于對照，但形成層細胞層數增多； 而抑制表達轉基因植株的木質部寬度低于對照但卻高于過表達植株，但形成層區(qū)域變窄。木質部的寬度為： 對照gt;抑制表達植株gt;過表達植株； 形成層區(qū)域大小為： 過表達植株gt;對照gt;抑制表達植株(圖4，表4)。以上結果表明過表達或者抑制表達PtoWOX11/12a基因不僅引起葉形發(fā)生變化，同時也影響了植株次生生長，表現為影響株高、地徑以及莖木質部發(fā)育。

2.4 PtoWOX11/12a對生長素合成基因的影響

利用毛白楊不定根誘導體系，進一步分析了PtoWOX11/12a是否通過影響生長素合成來調控分生組織的活性。通過qPCR分析了毛白楊PtoWOX11/12a基因和生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在毛白楊不定根產生和伸長過程中各個時期的表達，同時對PtoWOX11/12a基因在84K楊葉片中過表達或抑制表達后對生長素合成基因的影響做了進一步分析。結果發(fā)現，當莖段插入培養(yǎng)基后，PtoWOX11/12a被誘導表達，隨后其表達量均上調，且在第2天時表達量最高，說明該基因在不定根發(fā)生的起始階段發(fā)揮著重要作用(圖5A)。在不定根產生的過程中，生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在不定根發(fā)育的前期表達量較低，但是在第4天(即不定根形成之后)時出現顯著的上調表達(圖5B，C)。過表達PtoWOX11/12a基因促進生長素合成基因的表達，而抑制表達PtoWOX11/12a基因生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8表達量下調(圖5D)。表明生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8受到PtoWOX11/12a的影響，在不定根形成后期(伸長過程)中發(fā)揮作用。

表3 PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊株高、地徑比較Tab.3 Comparison of the height and basal diameter among PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

表4 PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊木質部及形成層寬度比較Tab.4 Comparison of the xylem and cambium width among PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

圖5 利用實時熒光定量PCR分析PtoWOX11/12a和生長素合成基因YUCCA1、YUCCA8的表達模式Fig.5 Expression analysis of PtoWOX11/12a and auxin genes (YUCCA1 and YUCCA8) using qPCRA-C： 誘導不同天數的毛白楊莖段； D： PtoWOX11/12a轉基因和非轉基因(對照)84K楊葉片。A-C: Induction of stem segments of Populus tomentosa with different induction days; D: Leaves from different PtoWOX11/12a- and non-transgenic (control) 84K poplars.

3 討論

WOX家族基因除了參與莖尖分生組織干細胞的維持, 還參與高等植物根尖分生組織和維管分生組織中干細胞的維持(于燕杰等， 2016)。目前，對于WOX基因家族中WOX11/12a基因的研究多集中在不定根發(fā)育方面，例如，Liu等(2014b)發(fā)現毛白楊WOX11/12a基因能夠促進不定根的生長，增加不定根數量； Xu等(2015)發(fā)現過表達PeWOX11a和PeWOX11b增加楊樹的不定根數目同時還誘導出異位不定根，此外在過表達PeWOX11b轉基因楊樹的葉腋中誘導產生不定根。但是目前對WOX11/12a基因對植株地上部分生長量的影響還未見報道。

本研究發(fā)現，過表達或者抑制PtoWOX11/12a基因能夠影響轉基因84K楊的根系生物量，這與前人的研究結果(Xuetal., 2015)一致，但是過表達或者抑制PtoWOX11/12a基因均影響了植株的葉形、株高、地徑以及莖木質部的發(fā)育。過表達PtoWOX11/12a轉基因植株葉片的長度與非轉基因對照84K楊沒有顯著差異，但寬度稍微大于對照； 抑制表達PtoWOX11/12a轉基因植株葉片長度和寬度都顯著低于對照，這表明葉芽基形成后分生組織的分裂和分化受到了PtoWOX11/12a的調控(圖2)。解剖分析發(fā)現，過表達植株的木質部寬度遠遠小于對照，同時抑制表達植株的木質部寬度也小于對照，但是較過表達植株略寬，說明PtoWOX11/12a基因能夠影響莖的縱向及橫向生長(次生木質部發(fā)育)，導致轉基因植株株高、地徑均低于對照楊樹(圖3)。木質部發(fā)育是由形成層活動決定的，過表達PtoWOX11/12a基因可能使轉基因楊樹形成層分裂活動增強，形成層細胞層數增多，但分化程度相對對照楊樹較弱，致使木質部寬度低于對照楊樹，而當PtoWOX11/12a表達受到抑制后，形成層分裂活動降低，形成層細胞層數減少，但是分化程度介于過表達轉基因楊樹和對照楊之間(圖4，表4)，說明PtoWOX11/12a影響了形成層干細胞的活動和木質部的分化。在擬南芥中，WOX5和WOX11在根頂端分生組織中發(fā)揮作用，WUS和WOX4主要參與莖頂端分生組織和形成層中的活動，但在調控莖尖和根部干細胞穩(wěn)定以維持未分化狀態(tài)時，WOX和WUS可以相互補償(Sarkaretal., 2007; Hirakawaetal., 2010; Liuetal., 2014a)。由此推測，在本研究中當PtoWOX11/12a基因過表達后，葉片和莖部該基因的表達量顯著上調，可能干擾或替代了原有的該家族其他成員在葉片或者莖中的功能，因而出現上面所述的表型變化。本文主要研究了PtoWOX11/12a基因對溫室84K楊扦插苗生長發(fā)育的影響，今后工作還應進一步分析該基因對多年生植株生長發(fā)育的影響，例如發(fā)達的根系在田間是否最終會促進地上部分的增長等問題，進而全面揭示該基因的調控作用。

根據前人研究發(fā)現，楊樹莖段插入基本培養(yǎng)基后第2～3天出現愈傷組織，4天后產生側根，隨后側根進入伸長階段(Liuetal., 2014c)。因此，在本研究中，為了解釋PtoWOX11/12a對分生組織的影響，利用楊樹不定根誘導系統分析了PtoWOX11/12a在莖段產生不定根的各個時期中的表達情況，特別是對生長素合成的影響。當莖段插入培養(yǎng)基后，PtoWOX11/12a基因被誘導表達，在愈傷組織形成時期(第2～3天)一直處于較高的表達水平，說明PtoWOX11/12a基因參與不定根形成起始過程(圖5)，而這個時期生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8表達量很少，但在不定根形成后的伸長期(4天后)表達量急劇增加，推測在生根過程中，PtoWOX11/12a基因及生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8在表達時間上存在時間間隔。高水平的PtoWOX11/12a抑制了生長素合成相關基因的表達，導致過表達PtoWOX11/12a轉基因楊樹更容易形成分生組織，因而促進了根原基的形成，產生了較多的不定根(Liuetal., 2014b)。不定根生長過程中，YUCCA1及YUCCA8基因上調表達，促進了生長素合成和根部分生組織細胞的分裂。在莖中表現為形成層活動增強，繼而影響木質部的分化，木質部變窄。

4 結論

本研究發(fā)現PtoWOX11/12a基因影響楊樹扦插苗的生長發(fā)育。過表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊的葉片寬度增加，株高、地徑降低，木質部寬度變小，但是形成層細胞層數增加； 抑制表達PtoWOX11/12a轉基因84K楊的葉長、寬都明顯變小，且葉邊緣呈現鋸齒狀缺刻，株高和地徑也顯著降低，木質部寬度與過表達植株相比相對變大，但形成層細胞層數變少。這種變化是由于PtoWOX11/12a影響了生長素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達，從而導致形成層活動和木質部形成的變化。本研究為深入探索WOX基因在植物不同組織生長發(fā)育調控機制提供了參考。

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(責任編輯 徐 紅)

EffectsofPtoWOX11/12aGenefromPopulustomentosaontheGrowthandDevelopmentofCuttingSeedlingsinPoplar

Li Zhen Wang Liuqiang Lu Mengzhu
(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingKeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationoftheStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestryBeijing100091)

【Objective】 WOX transcription factor family is one of the plant-specific transcription factor families, which have been demonstrated playing an important role in the embryonic patterning, stem cell maintenance and proliferation and lateral organ development. This study analyzed the roles ofPtoWOX11/12agene fromPopulustomentosain the development of leaves and stems of transgenic 84K poplar(Populusalba×P.glandulosacl. 84K). The gene expression level during the process of adventitious roots formation ofPopulustomentosa,and in overexpression and suppressed expression ofPtoWOX11/12atransgenic 84K poplars were analyzed. Our research provides a foundation for further studies of the roles ofWOXsgene in plant development.【Method】 The leaf shape, height and basal diameter of one-month-old to three-month-old transgenic lines and non-transgenic 84K poplar (control) in the greenhouse were measured and compared. The anatomy of stem sections of the 5th, 9thand 13thinternodes of transgenic lines and control plants was analyzed and the width of xylem and cambium were compared. The expression ofPtoWOX11/12a,YUCCA1 andYUCCA8 during the process of adventitious roots development inP.tomentosaand in overexpression and suppressed expression ofPtoWOX11/12atransgenic 84K poplars was examined using quantitative real-time PCR (qPCR).【Result】 There were no significant differences between overexpression ofPtoWOX11/12aand control plants in leaf length, but the leaf width of overexpression ofPtoWOX11/12awas sharply larger than the control. The leaf length and width of suppression expressionPtoWOX11/12atransgenic poplars were less than control, and the leaf margin had serrate incision. The height and diameter of overexpression and suppression expressionPtoWOX11/12atransgenic poplars were significantly less than the control poplars. The anatomy analysis indicated that the xylem, the number of cambium layers of overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars was thinner than the control and the xylem of the suppression expression ofPtoWOX11/12awas also thinner than the control, but it is wider than overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars. qPCR analysis showed thatPtoWOX11/12awas strongly induced and expressed in the stem during the process of adventitious roots development. The expression levels of auxin synthesis genes,YUCCA1 andYUCCA8, were increased at the third day. Furthermore, their expression levels were increased in overexpressed while decreased in suppressedPtoWOX11/12atransgenic poplars.【Conclusion】 Overexpression or suppression expression ofPtoWOX11/12agene has effects on plant leaf shape, height and stem radial growth (secondary xylem development).PtoWOX11/12agene participates in adventitious roots formation and elongation involved in the expression of auxin synthesis genesYUCCA1 andYUCCA8. In the process of root formation, expression time interval was existed amongPtoWOX11/12a,YUCCA1 andYUCCA8 genes. Higher expression ofPtoWOX11/12amay inhibits the expression of auxin synthesis genes, thus overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars are easier to form meristem, promote root primordium formation and produce large number of adventitious roots. During adventitious root growth, the increased expression level ofYUCCA1 andYUCCA8 promote auxin synthesis and root meristem cell division. In stem the increased activities of cambium affected the xylem differentiation in overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars, thus the xylem of transgenic poplars is thinner in size than the control.

Populus；PtoWOX11/12a； gene expression； quantitative real-time PCR； adventitious root； cambium

10.11707/j.1001-7488.20171108

2017-03-02；

2017-04-28。

“十二五”863 計劃課題“林木優(yōu)質、速生性狀調控基因的分離及育種技術研究”(2013AA102702)。

* 盧孟柱為通訊作者。

S718.46

A

1001-7488(2017)11-0069-08