趙旭

（遼寧省海城市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，遼寧 海城 114200）

糖皮質(zhì)激素治療對重癥肌無力患者Tfh細(xì)胞亞群的作用

趙旭

（遼寧省海城市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，遼寧 海城 114200）

目的 觀察糖皮質(zhì)激素治療前后對重癥肌無力患者Tfh細(xì)胞亞群的調(diào)控和影響。方法 選取2015年8月～2016年9月于本院由糖皮質(zhì)激素治療顯著的患者30例以及健康對照組20例，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測對比健康對照組，同一患者治療前后外周血中CD4+T細(xì)胞CXCR5,ICOS以及轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)，ELISA的方法比較治療前后血清中細(xì)胞因子IL-21的表達(dá)水平。結(jié)果 ①與健康對照組相比，新發(fā)MG患者Tfh細(xì)胞顯著升高，而糖皮質(zhì)激素治療后顯著降低；②新發(fā)MG患者相較于健康對照組，ICOS與Bcl-6表達(dá)顯著上調(diào)，而糖皮質(zhì)激素治療后可以顯著降低ICOS的表達(dá)水平；③新發(fā)MG患者血清中IL-21水平顯著增加，糖皮質(zhì)激素治療后IL-21的水平較治療前顯著下降。結(jié)論①Tfh細(xì)胞的失衡可能參與重癥肌無力的發(fā)病過程，其比例與MG的療效相關(guān)。②糖皮質(zhì)激素可能通過影響Tfh細(xì)胞IL-21的表達(dá)抑制自身抗體的產(chǎn)生治療重癥肌無力。

Tfh細(xì)胞；重癥肌無力；糖皮質(zhì)激素；IL-21

重癥肌無力（myasthenia gravis,MG）主要發(fā)生于神經(jīng)肌肉接頭處的自身免疫性疾病，其發(fā)生機(jī)制是由于自身抗體與乙酰膽堿受體AChR或MuSK相結(jié)合導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)受損最終導(dǎo)致肌肉無力[1-2]，因此自身反應(yīng)性的B細(xì)胞及其產(chǎn)生的病理性抗體在MG發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[3-4]。而自身免疫性抗體的產(chǎn)生離不開CD4+T細(xì)胞的輔助。

Tfh（Follicular helper T cells），是最近發(fā)現(xiàn)的輔助性CD4+T細(xì)胞亞群，它主要存在于次級淋巴組織中，在生發(fā)中心與B細(xì)胞相互作用促進(jìn)B細(xì)胞的亞型轉(zhuǎn)化和抗體的產(chǎn)生。其分化依賴于轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，而發(fā)揮作用主要依賴于其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-21[5-6]。Tfh細(xì)胞目前被報(bào)道參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生[7-8]。糖皮質(zhì)激素是重癥肌無力目前臨床上廣泛采用的方法，但其作用機(jī)制目前仍然未知。本文擬通過比較新發(fā)重癥肌無力與糖皮質(zhì)激素治療后患者外周血中Tfh細(xì)胞亞群，表型，轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞因子的分泌，初步了解重癥肌無力中Tfh細(xì)胞亞群的變化與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并進(jìn)一步了解MG的發(fā)病機(jī)制，深入研究糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年8月～2016年9月于本院神經(jīng)內(nèi)科就診的確診為重癥肌無力患者30例，其中男19例，女11例，平均年齡（41.3±6.2）歲，納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：①晨起暮重的典型的重癥肌無力臨床癥狀；②疲勞實(shí)驗(yàn)及新斯的明實(shí)驗(yàn)為陽性；③接受糖皮質(zhì)激素治療后效果顯著者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①在接受糖皮質(zhì)激素治療前有過其它如免疫抑制劑或胸腺切除的治療史；②明顯肝腎功能不全者，嚴(yán)重感染（如HIV感染）、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤者。另外納入20例同期于本院保健科接收健康體檢者作為正常對照，其中男12例，女8例，平均年齡（40.2±8.3）歲，兩組患者在性別和年齡統(tǒng)計(jì)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且所有納入的患者均簽訂相應(yīng)的知情同意書。

1.2 Tfh細(xì)胞的標(biāo)記和染色 就診當(dāng)天空腹采集納入重癥肌無力患者治療前和治療后以及健康對照組EDTA抗凝的靜脈血2 mL，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞后，分別將購自BD公司的Alexa-488-anti-CXCR5，PE-anti-ICOS，PerCP-Cy5.5-anti-CD4對所分離的淋巴細(xì)胞室溫標(biāo)記，20分鐘后對細(xì)胞進(jìn)行固定、穿膜（利用購自eBiosciences的穿膜打孔試劑盒），取APC-anti-Bcl-6抗體室溫避光穿孔1 h后，加入200 μL Hank’s緩沖液重懸細(xì)胞，于BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，并用Flowjo軟件對所得結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 ELISA檢測血漿中IL-21表達(dá)水平 將上述采集的靜脈血離心后分離血漿，分裝至EP管中凍于-80℃冰箱保存，根據(jù)購自北京達(dá)科為公司的人IL-21 ELISA試劑盒說明書操作，檢測患者和健康對照組血漿中IL-21的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素治療后MG患者外周血Tfh細(xì)胞比例變化觀察新發(fā)MG患者與健康對照組相比，表1的結(jié)果顯示，外周血CD4+細(xì)胞中，CXCR5的表達(dá)水平顯著上調(diào)[（12.8±2.9）%vs（9.2±2.5）%]，且兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。糖皮質(zhì)激素治療后MG患者與自身治療前相比，外周血中CXCR5的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

進(jìn)一步觀察糖皮質(zhì)激素治療對MG患者外周血Tfh細(xì)胞表型ICOS以及轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)的影響。相比于健康對照組，新發(fā)MG患者外周血CD4+細(xì)胞表面ICOS的表達(dá)顯著上調(diào)，而治療后，顯著下降。新發(fā)MG患者Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)水平較對照組顯著升高，而治療后雖有下降趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 糖皮質(zhì)激素治療后Tfh細(xì)胞比例變化（x±s）Table 1 The Change of Tfh cells Percentage after Glucocorticoid Treatment(x±s)

2.2 糖皮質(zhì)激素治療后血漿中細(xì)胞因子IL-21表達(dá)水平的變化 采用雙抗夾心法檢測MG患者治療前后血漿細(xì)胞因子IL-21的濃度，新發(fā)MG患者血漿中IL-21的濃度（210.8±80.3）pg/mL顯著高于對照組（85.8±50.9）pg/mL（P＜0.05）。治療后血漿中IL-21（160.5±60.2）pg/mL的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 糖皮質(zhì)激素治療后血漿IL-21表達(dá)水平的變化（x±s）Table 2 The Change of Plasma IL-21 after Glucocorticoid Treatment(x±s)

3 討論

濾泡輔助性T細(xì)胞作為最近新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞亞群，在次級淋巴器官中可以誘導(dǎo)并輔助B細(xì)胞進(jìn)入生發(fā)中心增殖分化形成漿細(xì)胞，并產(chǎn)生抗體[10]。研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病中均會出現(xiàn)Tfh的數(shù)量或者功能發(fā)生異常，且增高程度也與自身免疫病的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系[11-12]。國外通過動(dòng)物模型和臨床樣本的實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，重癥肌無力患者中Tfh細(xì)胞的分化均出現(xiàn)異常，而病情緩解后，會伴隨著Tfh細(xì)胞比例恢復(fù)至正常水平[13-14]。

口服糖皮質(zhì)激素目前廣泛應(yīng)用于MG患者的臨床治療，其作用的主要機(jī)制是降低細(xì)胞因子的分泌和抑制抗原提呈，抑制淋巴細(xì)胞的增殖和分化。本文通過比較新發(fā)MG患者與健康對照組以及同一患者糖皮質(zhì)激素治療前后Tfh細(xì)胞的比例、表型、轉(zhuǎn)錄因子Bcl6的表達(dá)以及血漿中IL-21的水平發(fā)現(xiàn)，新發(fā)MG患者中，相較于健康對照組，Tfh細(xì)胞比例，表面ICOS分子，轉(zhuǎn)錄因子Bcl6的表達(dá)顯著上調(diào)，而治療顯著后Tfh細(xì)胞明顯降低。暗示著Tfh細(xì)胞可能參與到重癥肌無力的發(fā)病過程中。

轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6被報(bào)道可以參與促進(jìn)Tfh細(xì)胞的分化，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新發(fā)的MG患者Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)相較于健康對照組顯著升高，而糖皮質(zhì)激素治療后并降低Tfh細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)。而國內(nèi)崔亞杰等最近研究發(fā)現(xiàn)，在口服潑尼松治療有效的MG患者中，外周血Bcl-6的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)[15]。暗示著潑尼松的治療可能是通過抑制Bcl-6的表達(dá)抑制Tfh細(xì)胞的分化來抑制Tfh細(xì)胞產(chǎn)生，而我們的文章中糖皮質(zhì)激素治療后雖然Bcl-6的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，但并未有顯著性差異，其是否是與潑尼松的作用機(jī)制相類似，還有待接下來進(jìn)一步研究。

IL-21主要由Tfh細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育成熟以及抗體的產(chǎn)生。在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，新發(fā)MG患者血清中IL-21的水平顯著高于健康對照組，而糖皮質(zhì)激素治療后顯著下降，暗示著糖皮質(zhì)激素治療可能是通過抑制Tfh細(xì)胞產(chǎn)生IL-21，減少漿細(xì)胞的分化以及自身免疫性抗體的產(chǎn)生。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞可能參與MG患者發(fā)病的過程，而糖皮質(zhì)激素治療效果顯著的患者中Tfh細(xì)胞顯著降低，暗示著Tfh細(xì)胞的變化與臨床療效有顯著相關(guān)性。

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doi:10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.014

The Impact of Glucocorticoid Treatment on Tfh Cell in Myasthenia Gravis Patients

Zhao Xu
(Haicheng Central Hospital,department of internal neurology,Haicheng,Liaoning,114200,China)

Objective To explore the potential effects of glucocorticoid treatment on Tfh cell population in myasthenia gravis patients.Methods 30 patients newly diagnosed with myasthenia gravis and treated in our hospital as well as 20 healthy controls from Oct 2015 to Sep 2016 were given oral glucocorticoid treatment.Changes of CXCR5,ICOS and transcriptional factor Bcl-6 were determined by flow cytometry.Serum IL-21 was measured by ELISA.Results①Compared with healthy controls,the percentage of Tfh cells were significantly elevated and decreased after glucocorticoid treatment;②The expression of ICOS and Bcl-6 was significantly higher in MG patients compared with healthy controls,however,only the level of ICOS was significantly down-regulated after glucocorticoid therapy;③Serum IL-21 was significantly higher in MG patients compared with control littermates and glucocorticoid treatment could obviously returns to normal level.Conclusion①The imbalance of Tfh cells may take part in the pathogenesis of MG occurrence and correlated with clinical therapeutic outcome;②Glucocorticoid treatment may inhibit autoantibody production through inhibiting the secretion of IL-21 by Tfh cells.

Tfh cells;Myasthenia gravis;glucocorticoid;IL-21