皮斌/河南省正陽縣獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心

張三軍/河南省駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

王艷 /河南省駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

皮斌/河南省正陽縣獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心

張三軍/河南省駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)于1910年由Glasser首次報(bào)道，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征，該病又稱為革拉氏病(Glasser’S disease)，本菌是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下它可以侵入動(dòng)物機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病，可以影響2月齡～4月齡的豬，常見于4周齡～8周齡，發(fā)病率和死亡率均很高，本菌作為豬呼吸道病綜合征的主要繼發(fā)細(xì)菌性病原，近年來引起的發(fā)病率越來越高，特別是在繁殖呼吸綜合征病毒和圓環(huán)病毒2型感染后，幾乎總是伴隨著Hps的感染。副豬嗜血桿菌的血清型在1992年就報(bào)道有15種之多，各國各地方流行的血清型也不盡相同，且各型之間缺乏交叉保護(hù)，因此，為了了解河南南部Hps的流行狀況和血清型分布特點(diǎn)，本試驗(yàn)對(duì)豫南某豬場(chǎng)的Hps可疑病料進(jìn)行了分離和鑒定，從而為下一步研究河南省Hps的血清分型方法、疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）材料

1.試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間。本試驗(yàn)于2016年3月至2017年9月間在河南省駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.病料。取Hps可疑病豬的肺臟、心血、胸腹腔積水、心包積液、關(guān)節(jié)積液。

3.培養(yǎng)基及主要試劑。NAD，購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；鮮血培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司；麥康凱培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基為自制；微量生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自北京天壇生物科技公司；金黃色葡萄球菌借自河南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室。

（二）方法

1.直接涂片鏡檢。無菌采集病豬的肺臟、心血、胸腹腔積水、心包積液、關(guān)節(jié)積液直接涂片，干燥固定后分別進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

2.分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性觀察。將疑似HPS感染的豬肺臟、關(guān)節(jié)液分別接種于含NAD的鮮血培養(yǎng)基上，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。接著將可疑菌落分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通血平板、含NAD的鮮血培養(yǎng)基上，置于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，觀察可疑菌株的生長特性。為盡可能排除雜菌干擾，此時(shí)可采用格盤法，挑取在巧克力培養(yǎng)基和含NAD的鮮血培養(yǎng)基上生長良好的可疑菌落，在同樣的位置分別接種于含NAD的鮮血培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、普通血平板上，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h后再次觀察分離菌株的生長特性。

3.衛(wèi)星現(xiàn)象檢查。衛(wèi)星現(xiàn)象檢查實(shí)驗(yàn)參考 陸承平的獸醫(yī)微生物學(xué)進(jìn)行的。取兩個(gè)巧克力培養(yǎng)基的平皿，一個(gè)劃線接種所分離純化的細(xì)菌并點(diǎn)種金黃色葡萄球菌，另一個(gè)只劃線接種分離菌做對(duì)照。然后于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，觀察其是否在金黃色葡萄球菌周圍長出“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

4.生化試驗(yàn)鑒定。吸取5μl 0.07%過濾除菌的NAD分別無菌加入到脲酶、氧化酶、接觸酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等生化管內(nèi)，并分別挑取疑似Hps的單個(gè)菌落穿刺接種，各接種1管，用石蠟?zāi)し饪?，放入含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3 d后觀察。

5.小鼠毒力試驗(yàn)。用已滅菌的注射器吸取1 ml生理鹽水，噴灑在可疑菌Hps生長良好的NAD的鮮血培養(yǎng)基上，將可疑菌落洗刮下來制成細(xì)菌懸液，分別于腹部皮下接種5只健康成年小白鼠，每只0.2 ml，觀察小白鼠的生長情況。

6.藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)采用紙片法進(jìn)行。挑取2～3個(gè)可疑菌落劃線于含NAD的鮮血培養(yǎng)基上，然后吸取3～5滴生理鹽水進(jìn)行涂布均勻，再把圓形的藥敏紙片按一定的比例貼在其上面，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

二、結(jié)果與分析

1.直接涂片鏡檢結(jié)果

對(duì)不同組織部位所取的病料，經(jīng)直接涂片，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察，可見到革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，不形成芽孢，未見鞭毛和莢膜。所查組織中以肺臟和關(guān)節(jié)液中的細(xì)菌最密集。

2.分離培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過5%CO2培養(yǎng)36 h后，發(fā)現(xiàn)在含NAD的鮮血培養(yǎng)基上生長良好，可見到有針尖大小，圓形邊緣整齊、灰白色、半明的小菌落生長。挑取這樣的小菌落進(jìn)行染色鏡檢后可見到革蘭陰性的小桿菌。如圖1所示，以長而彎曲如長絲狀者居多，也有纖細(xì)桿狀，間有些球桿狀，表現(xiàn)出明顯的多形性，不形成芽孢，未見莢膜和鞭毛。通過格盤法檢查的結(jié)果表明，在37℃5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h后，在含NAD的鮮血培養(yǎng)基上生長良好，在巧克力培養(yǎng)基上生長稀少，而在麥康凱培養(yǎng)、普通瓊脂培養(yǎng)基、普通血平板上不生長。分離培養(yǎng)分離菌的結(jié)果符合理論上Hps的培養(yǎng)特性。

圖1 分離菌鏡檢結(jié)果（革蘭氏染色 1000×）

3.衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果

衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果表明，在金黃色葡萄球菌的兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，距金黃色葡萄球菌愈近，菌落愈大，愈遠(yuǎn)則菌落愈小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”；而在未接種金黃色葡萄球菌的另一個(gè)巧克力平皿上則生長不良，菌落稀少，無“衛(wèi)星現(xiàn)象”出現(xiàn)。

4.生化試驗(yàn)結(jié)果

挑取可疑菌落，接種加入了NAD的生化管中，生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，分離菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖，不發(fā)酵核糖；氧化酶、尿酶、吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陰性，接觸酶為陽性。該分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果基本和理論上Hps的相一致，說明該分離菌為Hps。

5.小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

分離菌接種小白鼠后，16～36 h內(nèi)小白鼠全部死亡，分別無菌取小白鼠的心血、肝、肺、氣管病料接種于NAD的鮮血培養(yǎng)基上，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，在肺、氣管接種的NAD鮮血培養(yǎng)基上分離到疑似的副豬嗜血桿菌菌落，涂片鏡檢出現(xiàn)和患病豬體內(nèi)相似的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。

6.藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（Kirby-Bauer Method），對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷，Kirby-Bauer Method未建議使用的藥物，僅報(bào)告其抑菌圈直徑，不做敏感性分析。從表2可看出，分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢他啶、頭孢噻唑、慶大霉素均敏感，對(duì)林克霉素、土霉素、四環(huán)素均耐藥，而對(duì)恩諾沙星為中度敏感型藥物。對(duì)諾氟沙星不做敏感分析。通過藥敏試驗(yàn)，可根據(jù)敏感的藥物對(duì)相應(yīng)發(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行藥物治療，臨床用藥應(yīng)在藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)下進(jìn)行。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

三、討論

1.Hps的發(fā)病原因及預(yù)防要點(diǎn)

副豬嗜血桿菌通常只感染豬，可以影響2周齡～4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%。但我國對(duì)Hps的研究還不夠系統(tǒng)深入，重視程度不夠。該病多發(fā)于春冬氣候驟變季節(jié)，長途運(yùn)輸、飼料更替、斷奶、飼養(yǎng)密度過大、圈舍潮濕等應(yīng)激因素是其主要誘因。因此宜對(duì)該病采取綜合防治措施：加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，盡量減少各種應(yīng)激，實(shí)行全進(jìn)全出制度，防止不同年齡的豬只混養(yǎng)等。目前疫苗免疫是預(yù)防Hps最有效的方法之一，在一些地方應(yīng)用自家苗預(yù)防Hps感染，也取得了很好效果。副豬嗜血桿菌的臨床癥狀、剖檢病變和流行病學(xué)特征與豬的鏈球菌病、支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎等有相似之處，臨床上很容易將它們混淆。在診斷時(shí)應(yīng)從流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室檢查等多方面來綜合分析，以降低該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害。

2.副豬嗜血桿菌難分離的原因及解決辦法

本試驗(yàn)針對(duì)河南某個(gè)豬場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌感染病例進(jìn)行了病原的分離和鑒定，并對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以便為豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌病的控制起到一定的指導(dǎo)作用。副豬嗜血桿菌在病料中的分離率比較低，一般患病豬死亡12 h后，在病料中幾乎分離不到，因此需在患豬剖殺或死亡后12 h以內(nèi)及時(shí)進(jìn)行病原分離。而且副豬嗜血桿菌十分嬌嫩，對(duì)營養(yǎng)要求苛刻，其在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h～48h生長較差，由于副豬嗜血桿菌有較高的培養(yǎng)要求，其生化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是特殊培養(yǎng)基基質(zhì)的選擇，或者商品生化反應(yīng)管的營養(yǎng)改良。血清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)成功，但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的pH值等生化特性。一般病原分離應(yīng)采用含NAD的營養(yǎng)豐富的鮮血平板培養(yǎng)基。本試驗(yàn)在鮮血平板上加入了30μl0.07%的NAD因子，不但沒有改變培養(yǎng)基的理化特性，而且使得可疑菌生長良好，而在未加NAD因子的鮮血培養(yǎng)基上可疑菌不生長，而且該分離菌在巧克力培養(yǎng)基上也很少生長，對(duì)培養(yǎng)基的改良顯得十分重要。此外，目前各豬場(chǎng)在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛使用抗生素，也是副豬嗜血桿菌分離較低的原因之一，因此在日常的疾病預(yù)防和診治時(shí)，不要盲目用藥，要在藥敏試驗(yàn)結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行用藥。另外副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道中的一種常在菌，故評(píng)定疾病是否由副豬嗜血桿菌感染引起，最好能從漿膜、心包、腹膜、關(guān)節(jié)和腦膜等全身各部位采樣送檢，才能進(jìn)行本菌感染的診斷。

3.對(duì)Hps研究的必要性及意義

由于副豬嗜血桿菌存在多個(gè)血清型，不同菌株對(duì)同一種抗生素的敏感性有很大差異，在藥敏試驗(yàn)中，可根據(jù)高度敏感的藥物對(duì)相應(yīng)發(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行藥物治療，臨床用藥應(yīng)在分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)下進(jìn)行。血清型的多樣性以及占很大比例的不能分型菌株，也影響了對(duì)具有高效交叉保護(hù)力疫苗的研制。副豬嗜血桿菌是早期定居菌，血清型有15種之多，其致病力與血清型有關(guān)，這就難以通過管理措施來控制其引起的疾病。本試驗(yàn)通過對(duì)副豬嗜血桿菌的相關(guān)研究，通過形態(tài)學(xué)觀察、病原菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)，分離和鑒定出了副豬嗜血桿菌。詳細(xì)說明了副豬嗜血桿菌的特性，為進(jìn)一步研究副豬嗜血桿菌的抗原特性，疫苗研制、臨床預(yù)防、診斷等奠定了基礎(chǔ)，也為下一步確定副豬嗜血桿菌的血清型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在我國，由于飼養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整進(jìn)行不當(dāng)，以及突發(fā)的新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán)重。近年來，我國各豬場(chǎng)發(fā)生多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見不鮮，其中不少病例的病原被初步診斷為副豬嗜血桿菌，但限于試驗(yàn)條件，很少有人對(duì)其進(jìn)行確切診斷。因此對(duì)我國的副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查并確定我國流行的主要血清型已成為時(shí)勢(shì)所趨。

（略）