張 濤 蘇 倡 劉 艷 張迪駿 周 君① 蘆晨陽明庭紅 司開學(xué) 蘇秀榕①

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2.寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧波 315800)

泥蚶(Tegillarca granosa)重組鐵蛋白富集重金屬離子的特性及化學(xué)傳感器的研究*

張 濤1蘇 倡2劉 艷2張迪駿1周 君1①蘆晨陽1明庭紅1司開學(xué)1蘇秀榕1①

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2.寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧波 315800)

利用泥蚶(Tegillarca granosa)鐵蛋白原核表達(dá)工程菌獲得的重組鐵蛋白, 通過圓二色光譜分析蛋白二級結(jié)構(gòu), 掃描電鏡和電感耦合等離子質(zhì)譜研究重組鐵蛋白富集Fe2+、Mn2+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+和As3+等7種重金屬離子的特性, 同時探索利用重組鐵蛋白修飾絲網(wǎng)印刷電極, 設(shè)計(jì)和制備重組鐵蛋白檢測Pb2+和Cd2+濃度的電化學(xué)生物傳感器。結(jié)果表明復(fù)性成功的鐵蛋白多為完整的α-螺旋結(jié)構(gòu), 而復(fù)性不成功的蛋白聚集體則多為無規(guī)卷曲。重組鐵蛋白的直徑和形態(tài)與富集的離子種類有關(guān)。泥蚶鐵蛋白對單一金屬離子Fe2+和Mn2+的富集凸顯優(yōu)勢。對兩種混合金屬離子的富集大多表現(xiàn)為競爭關(guān)系。但重組鐵蛋白對 Hg2+和 As3+混合組的富集量明顯高于單一金屬離子組的富集量,對Hg2+和As3+混合組的富集表現(xiàn)出協(xié)同促進(jìn)作用。重組鐵蛋白傳感器對Pb2+和Cd2+溶液的最低檢測限為 10μg/L。

泥蚶鐵蛋白; 重組表達(dá); 富集重金屬; 化學(xué)傳感器; 鉛和鎘離子

泥蚶(Tegillarca granosaLinnaeus)俗稱血蚶、花蚶、粒蚶、血螺等, 隸屬于軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 蚶目(Arcoida), 蚶科(Arcidae),泥蚶屬(Tegillarca), 主要分布于印度洋及西太平洋的熱帶、亞熱帶近岸海域, 在中國主要分布在黃、渤海以南的沿海地區(qū), 是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一(李太武等, 2003; 蘇秀榕等, 2005; 張春丹等, 2012)。

近年來, 隨著沿海重金屬污水排放的加重, 環(huán)境中的重金屬通過食物鏈進(jìn)入人體危害健康的事件,使得泥蚶對于重金屬的富集作用成為近年來研究的熱點(diǎn)(Wanget al, 1999; 李學(xué)鵬等, 2008)。通過研究發(fā)現(xiàn), 生物體通過鐵結(jié)合蛋白和對鐵的外界吸收來維持鐵的穩(wěn)態(tài)(孫雪松等, 2007)。泥蚶對重金屬污染的抗逆性與其體內(nèi)編碼鐵蛋白基因的表達(dá)密切相關(guān)控(Jinet al, 2011)。典型的鐵蛋白結(jié)構(gòu)是由蛋白9外殼和鐵內(nèi)核兩部分構(gòu)成, 其中蛋白外殼是由 24個亞基自組裝形成的籠狀結(jié)構(gòu)(Hamburgeret al, 2005)。鐵蛋白主要存在于大多數(shù)生物體內(nèi), 在鐵的儲存和維持體內(nèi)鐵代謝平衡方面具有重要的作用(Wanget al,2009)。鐵蛋白可以存儲生物體內(nèi)多余的鐵, 同時鐵誘導(dǎo)鐵蛋白基因表達(dá), 讓機(jī)體內(nèi)部產(chǎn)生鐵蛋白對多余鐵進(jìn)行富集, 避免發(fā)生鐵中毒(Stillmanet al, 2001)。Zhang等(2007)發(fā)現(xiàn)在白斑綜合癥病毒或重金屬刺激下, 鐵蛋白基因明顯上調(diào)。

由于近年來我國沿海城市經(jīng)濟(jì)發(fā)展, 水環(huán)境中重金屬濃度的增加成為水體污染的主要因素之一。相比過去水中的重金屬的直接檢測, 海洋貝類生物對重金屬的富集效應(yīng)被認(rèn)為更適宜檢測水環(huán)境中的重金屬污染程度。本研究利用原核表達(dá)工程菌表達(dá)重組鐵蛋白, 通過圓二色光譜對純化后的重組鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 研究了對Fe2+、Mn2+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+和As3+等7 種重金屬離子的富集能力, 制備了可以檢測Cd2+和Pb2+濃度的電化學(xué)生物傳感器。

1 材料與方法

1.1 材料

泥蚶重組鐵蛋白由實(shí)驗(yàn)室制備。氯化亞鐵(FeCl2),氯化鎘(CdCl2), 氯化錳(MnCl2), 氯化汞(HgCl2), 氯化鉻(CrCl3), 氯化鉛(PbCl2), 氯化砷(AsCl3), 鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6]), 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC), N-羥基丁二酰亞胺(NHS), 乙酸(CH3COOH), 乙酸鈉(CH3COONa)等購于國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。BCA總蛋白濃度測定試劑盒購至南京建成有限公司, CLMS-2AN多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液購于美國 SamplePrep公司, 錫元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司, 羧基修飾絲網(wǎng)印刷電極購于蘇州長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司。標(biāo)準(zhǔn)馬脾鐵蛋白購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組鐵蛋白的圓二色光譜(CD)分析 經(jīng)原核表達(dá)純化后獲得的泥蚶重組鐵蛋白利用超濾管濃縮至蛋白含量1mg/mL。取1.0mL樣品, 采用1mm光徑的樣品池, 在波長范圍為190—260nm遠(yuǎn)紫外區(qū)域進(jìn)行掃描, 氮?dú)饬髁繛?L/min, 以純水為參比溶液。利用二級結(jié)構(gòu)分析軟件 CDNN對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)組成的估算, 并以標(biāo)準(zhǔn)馬脾鐵蛋白作為對照。

1.2.2 富集重金屬的研究 富集單一重金屬離子:將純化后的泥蚶重組鐵蛋白(0.1mg/mL)利用透析裝置, 分別在 0.2mmol/L的氯化亞鐵(FeCl2), 氯化鎘(CdCl2), 氯化錳(MnCl2), 氯化鉻(CrCl3), 氯化汞(HgCl2), 氯化鉛(PbCl2), 氯化砷(AsCl3)溶液中透析12h后, 然后利用PBS溶液洗去未被吸附的重金屬離子。反應(yīng)全過程均用磁力攪拌器, 并每隔4h更換一次溶液。富集處理完成后放置到4℃條件下, 保存?zhèn)溆谩?/p>

富集兩種重金屬離子: 蛋白濃度和方法同上, 將氯化亞鐵(FeCl2)分別和氯化鎘(CdCl2), 氯化錳(MnCl2), 氯化鉻(CrCl3), 氯化汞(HgCl2), 氯化鉛(PbCl2), 氯化砷(AsCl3)兩兩混合后的溶液中透析 12h后, 然后利用PBS溶液洗去未被吸附的重金屬離子。富集完成后放置到4℃條件下, 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 富集重金屬后重組鐵蛋白的形貌觀察 取泥蚶重組鐵蛋白富集重金屬的處理組溶液各 10μL。分別滴在干凈無菌的云母片表層, 靜置, 自然干燥后用高真空濺射鍍膜儀進(jìn)行噴金處理, 利用掃描電鏡(S-3400N, 日本HITACHI公司)對鐵蛋白富集不同重金屬后的聚集形貌進(jìn)行觀察。利用軟件 Image-Pro Plus計(jì)算各個蛋白聚集體的大小。

1.2.4 重組鐵蛋白富集重金屬的能力研究 取泥蚶重組鐵蛋白富集各種重金屬溶液各 0.1mL, 加入5%的稀硝酸, 搖動使樣品分散, 裝入微波消解系統(tǒng)中進(jìn)行微波消解處理, 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對所富集的重金屬含量進(jìn)行定量的分析測定。標(biāo)準(zhǔn)液為多元素混合液和錫單元素溶液, 用超純水配成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.5 電化學(xué)傳感器的制備和檢測 將羧基修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面用超純水進(jìn)行清洗并晾干后備用。其中, 0.4mol/L的 EDC溶液和 NHS溶液為0.1mol/L按照1∶1混合后滴到絲網(wǎng)印刷電極上進(jìn)行30min的羧基活化, 用超純水清洗掉干凈后, 將200μL濃度為2mg/mL重組鐵蛋白溶液滴在工作電極表面, 靜置反應(yīng)30min后用超純水除去未反應(yīng)的蛋白,最后將修飾好的絲網(wǎng)印刷電極4℃保存。利用濃度為5mmol/L的 K3[Fe(CN)6]溶液對修飾電極和空白電極靈敏度進(jìn)行檢測, 然后利用修飾電極在在 pH為 4.5的乙酸/乙酸鈉緩沖液條件下, 室溫下用溶出伏安法測定濃度為 10μg/L、25μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L的Pb2+和Cd2+的電化學(xué)信號, 記錄數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后在相同檢測條件下對50μg/L的Pb2+和Cd2+溶液重復(fù)檢測5次, 記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓二色譜檢測結(jié)果

將分子篩層析收集到的各蛋白峰溶液, 利用圓二色譜進(jìn)行分析獲得各個峰蛋白溶液的復(fù)性蛋白的二級結(jié)構(gòu)完整程度。泥蚶原核表達(dá)的重組鐵蛋白的α-螺旋所占比例低于標(biāo)準(zhǔn)馬脾鐵蛋白, 無規(guī)則卷曲所占比例則明顯高于馬脾鐵蛋白, 但四種二級結(jié)構(gòu)總體占比趨勢與標(biāo)準(zhǔn)馬脾鐵蛋白相似, 可見經(jīng)過一系列分離純化和復(fù)性操作獲得的泥蚶重組鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)趨于完整, 所占比例與對照組存在微小差異(圖1)。

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

圖1 泥蚶重組鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Secondary structure analysis ofrecombinant proteins of T.granosa

如圖2所示泥蚶重組鐵蛋白富集Fe2+后的聚集體仍為大小相似的圓球體, 直徑大約為1μm, 但球體間發(fā)生了粘連現(xiàn)象。推測為Fe2+的氧化作用。富集Mn2+的蛋白聚集體形貌與對照組相比變化非常明顯, 由原來的小球體變?yōu)榛ㄇ驙罱Y(jié)構(gòu), 且直徑也增大到5μm 左右。富集 Cd2+的蛋白聚集體為大小均勻的小圓球狀單體或聚集體, 顆粒較小, 直徑大約為1μm。富集Cr3+的蛋白聚集體為粘連在一起的圓球體, 直徑大小沒有變化。富集Hg2+的蛋白為明顯聚集成堆的圓球體, 直徑變化不明顯。富集 As3+組的蛋白由原來的光滑小球體變?yōu)闄E圓形、周圍出現(xiàn)小刺狀的球體結(jié)構(gòu)。富集 Pb2+的蛋白小球體直徑明顯增大為 2—3μm, 且2—3 個小球體之間發(fā)生明顯的相融合現(xiàn)象。

2.3 ICP-MS檢測結(jié)果

泥蚶重組鐵蛋白在相同的條件下, 對Fe2+的富集量最高為 615.28mg/g, 其次為 Mn2+的富集量545.04mg/g。對Cd2+和Hg2+的富集量在400mg/g左右,而對Cr3+、As3+和Pb2+的富集量均在200mg/g左右, 由此可見泥蚶重組鐵蛋白更易于富集多價(jià)態(tài)金屬離子Fe2+和Mn2+。而對于As3+的富集可能與其在溶液中的存在狀態(tài)相關(guān)(圖3)。

觀察比較泥蚶重組鐵蛋白富集兩種混合金屬離子的情況發(fā)現(xiàn), Mn2+與 Fe2+、Cd2+、As3+和 Hg2+的混合基本沒有影響泥蚶鐵蛋白對于 Mn2+的富集量300mg/g左右。而Hg2+和As3+的混合組增加明顯, 重組鐵蛋白對兩種混合離子的富集明顯高于單一離子條件下的富集量; 而大部分混合組均表現(xiàn)為拮抗?fàn)顟B(tài), 其中Cd2+和As3+混合組最為明顯, 單一離子溶液條件下富集量是混合條件下富集量的2倍。

2.4 傳感器的制備和使用

利用泥蚶重組鐵蛋白修飾的絲網(wǎng)印刷電極在 pH 4.5的乙酸/乙酸鈉緩沖液條件下, 室溫下用溶出伏安法測定不同濃度的Pb2+和Cd2+的電化學(xué)信號。重金屬離子濃度分由低到高分別為 10μg/L、25μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L。Pb2+和 Cd2+溶液的最低檢測限可以達(dá)到10μg/L, 在10—100μg/L之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系, Pb2+溶液的回歸方程為y= 0.2979x+ 34.336,R2值為 0.9960, Cd2+溶液的回歸方程為y=0.1651x+6.0569,R2值為0.9342 (圖4)。在相同的檢測條件下對50μg/L的 Pb2+和 Cd2+溶液重復(fù)檢測 5 次, 其偏差分別為3.4%和4.1%, 可見重現(xiàn)性較好。

3 討論

3.1 重組鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)

泥蚶重組鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)中的無規(guī)卷曲大于標(biāo)準(zhǔn)鐵蛋白, 此類蛋白聚集體的形成源于復(fù)性過程中高濃度的尿素溶液破壞了蛋白的類天然二級結(jié)構(gòu),形成天然卷曲, 復(fù)性過程中更易形成天然聚集(Harrisonet al, 1996; Zouet al, 2016)。

通過一系列復(fù)性和純化操作獲得的泥蚶重組鐵蛋白在掃描電鏡下我們觀察為大小均勻的球體, 當(dāng)鐵蛋白富集不同種類重金屬離子后, 其聚集體表面形貌發(fā)生了明顯變化。首先表現(xiàn)為球體直徑的增大,由原來的 1μm增加到 2—3μm (Pb2+富集組), 直徑變化最為明顯的 Mn2+富集組, 蛋白球體直徑增加為5μm。Zou等(2016)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鐵蛋白內(nèi)部有鐵核或其他金屬核填充時, 蛋白球體直徑較大。富集重金屬后, 蛋白空腔的內(nèi)部被金屬支撐起來, 金屬離子氨基酸側(cè)鏈間存在著如疏水鍵、氫鍵、靜電作用和范德華力等相互作用力, 對蛋白質(zhì)的折疊會造成較為顯著的影響, 從而增加了蛋白殼的厚度, 使重組鐵蛋白聚集體直徑明顯增加(Truffiet al, 2016)。其次蛋白聚集體之間發(fā)生了不同程度的粘連、聚集成堆而不是均勻分散, 蛋白球體表面出現(xiàn)層狀結(jié)構(gòu)或者刺狀結(jié)構(gòu)。鐵蛋白富集重金屬后, H+和OH–一方面在構(gòu)成金屬核的過程中有促進(jìn)作用(Leviet al, 2015), 另一方面會與蛋白殼內(nèi)外表層的氨基酸發(fā)生結(jié)合, 對蛋白殼的構(gòu)象發(fā)生影響, 也會改變蛋白殼的柔性調(diào)節(jié)能力。這種調(diào)節(jié)能力大小影響了蛋白聚集體的表面形貌。同時,不同的重金屬具有不同的氧化還原強(qiáng)度, 會影響介質(zhì)中的正負(fù)離子強(qiáng)度, 也造成不同處理組的不同形貌變化。Yamashita等(2010)研究鐵蛋白富集 Fe2+、Co2+和 Ni2+發(fā)現(xiàn), 三重金屬離子在進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)部成核過程中, 氧化還原能力的不同導(dǎo)致鐵蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生獨(dú)特的變化進(jìn)而在電鏡下呈現(xiàn)出不同的形貌。另一方面, 金屬離子水化可能摧毀了鐵蛋白水化層, 并使鐵蛋白容易折疊中間體。金屬離子水合作用不同, 導(dǎo)致鐵蛋白對重金屬的富集強(qiáng)度不一, 促使表面形貌發(fā)生不同的變化(Zoleaet al, 2015)。Yang等(2007)利用鐵蛋白在不同金屬離子溶液中蛋白亞基間的解聚/聚合特性裝載鉑金屬。最后, 反應(yīng)系統(tǒng)形成了形貌各異的Fe-鐵蛋白、Cd-鐵蛋白、Cr-鐵蛋白、Mn-鐵蛋白、Hg-鐵蛋白、As-鐵蛋白和Pb-鐵蛋白的聚集體。

圖2 重組鐵蛋白富集不同金屬離子的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of different ferritins treatment groups

3.2 重組鐵蛋白對重金屬離子的富集

圖3 泥蚶重組鐵蛋白對不同重金屬離子的富集量Fig.3 Comparison of results for different metals treatment of recombinant proteins of T.granosa

泥蚶重組鐵蛋白對 Fe2+和 Mn2+富集相對其他重金屬離子表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。蛋白對Fe2+的富集優(yōu)勢與鐵蛋白本身的特性和活性位點(diǎn)有關(guān)。鐵蛋白在生物體內(nèi)的主要功能即為儲存多余的Fe2+, 避免其對生物體的傷害(Yanget al, 2007)。同時有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鐵核內(nèi)充滿 Fe3+時會加速 Fe2+的氧化和儲存速率(Bou-Abdallah, 2010)。重組鐵蛋白對Mn2+富集優(yōu)勢則源于錳很強(qiáng)的氧化還原特性, 在錳的化學(xué)氧化過程中, 二價(jià)錳先被氧化成含大量三價(jià)錳的固體氧化物或氫氧化物, 再經(jīng)緩慢的歧化反應(yīng), 最終生成四價(jià)錳。有研究發(fā)現(xiàn)生物錳氧化物形成過程中伴隨著多種形式的氧化還原反應(yīng), 初級錳氧化物物的晶體結(jié)構(gòu)也會隨時間發(fā)生變化(Toneret al, 2005)。

重組鐵蛋白對于兩種混合金屬離子的富集大多表現(xiàn)為兩種金屬離子的競爭關(guān)系, 例如 Cd2+和As3+混合組、Cr3+與 Cd2+混合組等。這是受鐵蛋白內(nèi)核的空間大小和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量限制的。Wong等(1996)就是利用鐵蛋白內(nèi)核空間的固定大小合成均勻大小的金屬納米顆粒。但與其他金屬離子混合組不同, 重組鐵蛋白對Hg2+和As3+混合組的富集表現(xiàn)出協(xié)同促進(jìn)作用。Hg2+和As3+混合組的富集量明顯高于單一金屬離子組的富集量。Hg2+和As3+同時存在可能改變了重組鐵蛋白所處的溶液環(huán)境條件,研究發(fā)現(xiàn)溶液 pH的升高可以顯著增加鐵蛋白所帶負(fù)電荷量, 增加靜電吸引作用, 富集更多的金屬陽離子。

圖4 泥蚶重組鐵蛋白修飾電極測定Pb2+和Cd2+濃度梯度曲線Fig.4 Determination of concentration gradient of Pb2+ and Cd2+ modified electrode of recombinant proteins of T.granosa

3.3 重組鐵蛋白電化學(xué)生物傳感器

鐵蛋白具有氧化外界Fe2+為Fe3+并在內(nèi)部形成鐵核的功能, 同時在特定的條件下鐵蛋白可以將內(nèi)核中的Fe3+還原為Fe2+釋放到外界中, 氧化還原過程伴隨著的電子轉(zhuǎn)移特性使得鐵蛋白在電極上表現(xiàn)出傳遞電子的能力(Inamuddinet al, 2016)。Zapien等(2000)利用鐵蛋白成功實(shí)現(xiàn)了在金電極上的自組裝, 并測得相當(dāng)明確的電流-電位曲線。本實(shí)驗(yàn)利用重組鐵蛋白富集重金屬離子Cd2+和Pb2+的特性, 將鐵蛋白固定在絲網(wǎng)印刷電極上以檢測溶液中Cd2+和Pb2+的濃度。相比于以酶作為敏感元件的生物傳感器更具有專一性和準(zhǔn)確性(王明華等, 2013)。Wu等(2004)也是將鐵蛋白加入到制備納米金薄膜電極的溶液體系中, 發(fā)現(xiàn)能夠顯著增強(qiáng)電極的靈敏度和穩(wěn)定性。另一方面,重組鐵蛋白本身氨基酸側(cè)鏈帶有-NH2基團(tuán), 可以直接與羧基修飾的絲網(wǎng)印刷電極發(fā)生反應(yīng)實(shí)現(xiàn)鐵蛋白的固定, 無需外加修飾基團(tuán)。Ritzert等(2009)利用鐵蛋白氨基酸側(cè)鏈的-NH2基團(tuán)將其直接固定在羧基修飾的金電極表面, 實(shí)現(xiàn)在電化學(xué)方面探究鐵蛋白的Fe2+釋放動力學(xué)。泥蚶重組鐵蛋白電化學(xué)生物傳感器在 Cd2+和 Pb2+溶液的最低檢測限方面均能達(dá)到10μg/L, 相比于Shen等(2008)構(gòu)建的Pb2+最低檢測限1nmol/L的脫氧核糖核酸酶金電極生物傳感器有明顯的優(yōu)勢。泥蚶重組鐵蛋白修飾電極在10—100μg/L之間也表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,R2值達(dá)到 0.9960和0.9342。

4 結(jié)論

泥蚶重組鐵蛋白富集 Fe2+的聚集體為直徑約1μm 圓球體, 富集 Mn2+的為直徑 5μm 左右花球, 富集Cd2+為直徑約1μm小圓球, 富集Cr3+的為粘連在一起的圓球體, 富集Hg2+為成堆的圓球體, 富集As3+為橢圓形、周圍出現(xiàn)小刺狀的球體結(jié)構(gòu), 富集Pb2+的為直徑 2—3μm左右、且 2—3個小球體相融合。泥蚶重組鐵蛋白在相同的條件下, 對Fe2+的富集量最高為615.28mg/g, 其次為 Mn2+的富集量 545.04mg/g。對Cd2+和Hg2+的富集量在400mg/g左右, 而對Cr3+、As3+和Pb2+的富集量均在200mg/g左右, 由此可見泥蚶重組鐵蛋白更易于富集多價(jià)態(tài)金屬離子 Fe2+和 Mn2+。泥蚶重組鐵蛋白富集 Hg2+和 As3+為協(xié)同效應(yīng), 富集Cd2+和 As3+為拮抗效應(yīng)。泥蚶重組鐵蛋白傳感器對Pb2+和Cd2+溶液的最低檢測限為10μg/L。

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RESEARCH OF CHARACTERISTICS OF ENRICHMENT OF HEAVY METALS BY RECOMBINANT FERRITIN FROMTEGILLARCA GRANOSA

ZHANG Tao1, SU Chang2, LIU Yan2, ZHANG Di-Jun1, ZHOU Jun1, LU Chen-Yang1,MING Ting-Hong1, SI Kai-Xue1, SU Xiu-Rong1
(1.School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo315211,China; 2.Ningbo Polytechnic,Ningbo315800,China)

The recombinant ferritin protein taken from theTegillarca granosaferritin protein prokaryotic expression bacteria was used to design and get the electrochemical biosensors for detection of Pb2+and Cd2+of the recombinant ferritin protein through the analysis of the secondary structure of protein by circular dichroism (CD), the research of the characteristics of the protein to enrich 7 heavy metal ions such as Fe2+, Mn2+, Cd2+, Cr3+, Hg2+, Pb2+and As3+by scanning electron microscope(SEM) and inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS) and the exploration of the recombinant ferritin protein to modify screen-Printed Electrode.The results showed that the ultra-structure of recombinant ferritin protein with successful refolding was mainly complete α-helix, however, the structure of the protein with unsuccessful refolding is mainly an irregular one.The diameter and shape of the recombinant ferritin protein was related to the type of the enriched ions.T.granosaferritin had advantage to enrich the single metal ions like Fe2+and Mn2+and performs as a competing role when it came to the enrichment of the 2 mixed metal ions.However, the enriched amount of the mixed metal ions of Hg2+and As3+was obviously higher than the enriched amount of the single metal ions and the protein just promoted the enrichment of the that mixed ion.And the lowest detection concentration of biosensors for Pb2+and Cd2+liquor was 10μg/L.

Tegillarca granosaferritin; recombinant expression; enrichment heavy metals; chemical sensor; lead and cadmium ions

Q789; S917

10.11693/hyhz20170300067

* 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目, 41676159號, 40776075號, 41176123號。張 濤, 碩士研究生, E-mail: 1104534052@qq.com

① 通訊作者: 周 君, 博士, E-mail: zhougundam@foxmail.com; 蘇秀榕, 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail: suxiurong@nbu.edu.cn

2017-03-23, 收修改稿日期: 2017-04-20